Uma estratégia para validar o papel da mediada por calejado Plasmodesmal Gating na Tropic Response

Summary

Este artigo descreve os métodos para o rastreio dos genes que controlam a permeabilidade plasmodesmal e inclinação, portanto, auxina durante a resposta trópico. Isto inclui a medição do grau de resposta trópico no hipocótilo da Arabidopsis thaliana e verificar a permeabilidade plasmodesmal pelo ácido 8-hidroxipireno-1,3,6-trissulfónico carregamento (HPTS) e avaliação do nível de finalmente calejado.

Abstract

A auxina hormona vegetal desempenha um papel importante em muitos processos de crescimento e desenvolvimento, incluindo respostas trópico à luz e gravidade. O estabelecimento de um gradiente de auxina é um evento chave levando a phototropism e gravitropismo. Anteriormente, foi demonstrado polar do transporte de auxina (PAT) para estabelecer um gradiente de auxina em diferentes domínios celulares de plantas. No entanto, Han et ai. Demonstraram recentemente que a formação adequada gradiente de auxina, plasmodesmal conectividade symplasmic mediada por calose entre as células adjacentes é também um factor crítico. Neste manuscrito, a estratégia para elucidar o papel de genes específicos, que podem afetar phototropism e gravitropismo alterando a conectividade symplasmic através de modulação de síntese calejado plasmodesmal, é discutido. O primeiro passo é o despiste de respostas aberrantes trópico de 3 dias de idade de plântulas estioladas mutantes ou sobre-expressão de um gene linhas juntamente com o tipo selvagem. Este rastreio preliminarpodem levar à identificação de uma série de genes que funcionam em PAT ou controladores conectividade symplasmic. O segundo rastreio envolve a triagem dos candidatos que mostram respostas trópico alterada por afetar a conectividade symplasmic. Para lidar com tais candidatos, foi examinado o movimento de um marcador symplasmic e a deposição de calose plasmodesmal. Esta estratégia seria útil para explorar novos genes candidatos que podem regular a conectividade symplasmic directa ou indirectamente as respostas durante trópico e outros processos de desenvolvimento.

Introduction

Plantas, como organismos vivos sésseis, desenvolveram uma rede altamente sofisticada de sinalização de célula a célula para abordar vários estímulos ambientais. respostas Tropic são um dos fenômenos pelo qual as plantas respondem a estímulos ambientais. Plantas mostram dois principais trópico respostas, phototropism e gravitropismo. plantas fotossintéticas dobrar em direção à fonte de luz por phototropism para colher o máximo de energia. Da mesma forma, gravitropismo faz as plantas a crescer em direção ao centro da gravidade. O mecanismo fundamental que leva a tais respostas tropicais envolve a formação de gradiente assimétrica da auxina phytohormone ^1. O ato de formação de gradiente de auxina local está bem caracterizada; os genes que estão envolvidos neste mecanismo fornecem um roteiro para a ação do hormônio ^2-8. A posição específica de transportadores de efluxo de auxina, tais como o pino-formado (PIN) e P-glicoproteínas, executa o movimento de auxina a partir do citoplasma para a parede celular de células do doador ^9,10. Furthermore, pela actividade simporte ⁺ H activo / IAA de transportadores de influxo de auxina, tais como as proteínas da família AUX1 LAX /, auxina é finalmente entregue às células receptoras adjacentes ^2,11,12. Este movimento direcional da auxina é conhecido como transporte de auxina polar (PAT). PAT leva a uma distribuição diferencial de auxina durante vários estágios de desenvolvimento e em resposta a diferentes estímulos ambientais ^13,14. Além disso, a interrupção na localização ou a expressão de qualquer um destes transportadores de influxo ou efluxo de auxina conduz a uma alteração grave na PAT, o que provoca uma perturbação do gradiente de auxina, que conduz a defeitos de desenvolvimento. Recentemente, Han et ai. informou que a regulamentação plasmodesmal também é necessário para manter o gradiente de auxina ^15. Até à data, mais de 30 proteínas plasmodesmal foram identificados ^16. Entre estas proteínas, AtGSL8 foi classificado como uma enzima chave para a síntese de calose em plasmodesmos (PD) e, consequentemente, desempenha um papel vital na maintaining o limite de tamanho PD exclusão (SEL). Expressão AtGSL8 reprimida resultou em um padrão de gradiente auxina distorcida levando a nenhuma resposta trópico em contraste com mudas de tipo selvagem ^15.

Neste manuscrito, métodos para explorar novos genes candidatos que estão envolvidos na regulação do PD são fornecidos. AtGSL8 foi utilizado como uma proteína modelo para testar estes métodos, uma vez que é uma enzima chave contribuindo para PD biossíntese de calose. Devido à letalidade da plântula-gsl8 knock-out mutantes ^17, a dexametasona (DEX) linhas de ARNi -inducible foram usadas de acordo com um relatório publicado anteriormente ^15. A estratégia aqui fornecida pode ser adaptado para rastrear os genes que estão implicados na resposta hipocótilo trópico controlado por PD SEL.

Protocol

1. Seleção de mutantes com alterações da resposta fototrópicas e gravitrópico

1. Prepare 1x Murashige e Skoog (MS) Médio, pH 5,7, com 0,8% Agar Um dia antes do experimento.
   1. Adicione 800 ml de água bidestilada a um frasco cónico de 2 L e mexa com uma barra magnética.
   2. Adicionar 4,4 g de sal de MS ao frasco cónico.
   3. Adicionar 0,5 g de 2- (N-morfolino) etano sulfónico (MES) e agita-se até que todos os sais sejam completamente dissolvidos.
   4. Ajustar o pH do meio a 5,7 com KOH 1 M.
   5. Transferir a forma de um cilindro de massa e perfazer o volume final para 1 L com ddH ₂ O.
   6. Despeje volta do meio em um frasco cónico de 2 L e adicionar 8 g de agar vegetal.
   7. Enrole a boca do balão cónico firmemente com papel alumínio.
   8. Autoclave o meio de cultura MS e _ddH2O durante 15 min a 121 ° C, 15 psi, e depois da autoclavagem, manter o meio em uma incubadora a 60 ° C e a _ddH2O à TA.
   9. Após arrefecimento a 60 ° C, verter o meio em 125 x 125 x 20 mm ³ placas quadradas num banco de fluxo laminar (50 ml em cada placa).
   10. Permitir que o agar solidificar à temperatura ambiente durante cerca de 1 hora, mantendo as placas parcialmente aberta. Se as placas não são utilizadas imediatamente, selá-los usando filme plástico e armazenar a 4 ° C no frigorífico.
2. Surface-esterilizar as sementes com 1,1% de hipoclorito de sódio e pontilham as sementes em placas de agar 1x MS que foram preparados no ponto 1.1.
   Nota: Aqui, Arabidopsis thaliana {Col-0 Seeds, dsGSL8 (Col-0)} ¹⁵ são utilizados para a resposta trópico, coloração calejado e HPTS carregamento Arabidopsis thaliana {Col-0 e dsGSL8 (Col-0) EMS mutante} sementes (. não publicado) são utilizadas para resposta trópico na Figura 2.
   1. Autoclave de 300 mL de _ddH2O numa garrafa.
   2. Adicionar cerca de cem sementes para cada fundo, isto é,mutante line / sobre-expressão e de tipo selvagem (Col-0) sementes, para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   3. Retire placas 1x MS agar de um 4 ° C geladeira e secá-las em um banco de fluxo laminar em uma posição parcialmente aberta.
   4. Superfície-esterilizar as sementes pela adição de 1 ml de uma solução de lixívia a 0,2 x (1,1% de hipoclorito de sódio) e manter os tubos de microcentrífuga num agitador a 250 rpm durante 5 min.
   5. Deixe as sementes para liquidar o fundo por gravidade e em seguida, remover a solução de água sanitária por micropipeta.
   6. Adicionar 1 ml de ddH ₂ O fresco (autoclavado) para as sementes e misturar bem invertendo o tubo várias vezes microcentrífuga. Deixe as sementes se contentar novamente e, em seguida, remover a água.
   7. Repita o passo 1.2.6 5-6 vezes.
   8. Adicionar o dobro da quantidade de água com o volume das sementes que foram deixados após a lavagem final.
   9. Ponto as sementes esterilizadas numa placa de agar MS 1x semi-seca utilizando uma ponta de micropipeta de 1 ml contendo 200 ul de sementes (emágua cluindo).
      1. Manter uma distância de aproximadamente 0,1 centímetros entre duas sementes e um mínimo de 1,8 cm entre as duas filas de sementes. Dot as sementes em cinco linhas horizontais por placa quadrada (125 x 125 x 20 mm ^3). Permitir que a água para secar ligeiramente antes de colocar a tampa sobre a placa.
   10. Selar as placas com fita cirúrgica, empilhar todas as placas na vertical, e embrulhe com papel alumínio.
   11. Transferir as placas embrulhados para uma caixa escura (sem acesso à luz). Em seguida, mantenha a caixa escura em um 4 ° C / sala de geladeira por 3 dias.
   12. A partir deste passo, manter a direcção de placas inalteradas. Após 3 dias de tratamento pelo frio, manter a caixa escura em uma sala de cultura de plantas a 22 ° C para os próximos 3 dias. Após 3 dias, verifique o status germinação das sementes sob luz verde em um quarto escuro.
       NOTA: Normalmente 3 dias de idade Col-0 mudas estiolados pode crescer até 1,6 cm de comprimento.
3. Analisar a um fototrópico alteradaND resposta gravitrópico em mutantes ou sobre-expressão de linhas de um gene específico. Escolha mudas retas única de tamanho similar e verticalmente cultivado sob luz verde em um quarto escuro. Transferir mudas seleccionados para uma placa de agar MS 1x fresco, utilizando a ponta de um palito esterilizado.
   1. Gentilmente selecionar as mudas a partir da parte mais baixa do seu hipocótilo sem tocar quaisquer outras partes. Certifique-se de que todas as mudas têm mesma orientação cotilédones / gancho, e após a transferência, que a orientação dos ganchos de mudas permanecem os mesmos. Usar um mínimo de 20 mudas de cada fundo em cada linha e um mínimo de duas placas para cada ponto de tempo para análise posterior.
      Nota: Quatro fundos diferentes podem ser comparadas em cada placa (4 linhas).
      Opcional: Enquanto estiver usando dexametasona (DEX) -inducible / sobre-expressão linhas RNAi, transferir as mudas acima para uma MS 1x chapa junto com a placa de MS + dex (placa contendo 1x MS, meio de agar 0,8% suplementado com dex 20 mM) for 3 hr e manter as placas verticalmente na caixa escura.
   2. Para verificar a resposta phototropic, transferir as placas acima verticalmente para uma caixa preta com apenas um lado aberto. Transfira a caixa preta contendo placas para uma câmara de crescimento da planta com a luz branca unilateral. Para assegurar luz unilateral, colocar o bordo da placa para a fonte de luz (não o lado da frente). Consulte a configuração na Figura 1.
   3. Da mesma forma, para verificar a resposta gravitrópico, mantenha as placas com mudas transferidos verticais, e cobrir com folha de alumínio. Em seguida, alterar a orientação da placa vertical para 90 ° e mantê-lo dentro da caixa negra coberta de todos os lados. Consulte a configuração na Figura 1.
   4. Depois que os dados momentos, (geralmente de 1,5 hr, 3 hr, 6 horas e 12 horas) verificar as placas com um scanner, e salvar as imagens no formato JPEG.
   5. Medir o ângulo de flexão de mudas utilizando o software ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (Figure 2).
      1. Inicie o programa ImageJ clicando duas vezes (Figura 2A).
         Nota: As principais ferramentas que foram utilizados na medição do ângulo estão apresentados na Figura 2B.
      2. Clique na opção "Arquivo" seguido de sub-opção "Abrir" na barra de ferramentas ImageJ, e as imagens abertas salvos no formato de arquivo JPEG para medir o ângulo de flexão trópico (Figura 2C).
      3. Clique na ferramenta de aumento para ampliar ou reduzir a imagem clicando no botão esquerdo ou direito do mouse, respectivamente, como mostrado na Figura 2B.
      4. Clique na ferramenta de rolagem para arrastar e posicionar a imagem (Figura 2D) .next, clique na ferramenta ângulo para medir o ângulo de flexão (Figura 2E).
         1. Faça um duplo clique esquerdo no hipocótilo originais crescente ponto de direção 'a', arraste o mouse para a flexão ponto de iniciação 'b' (Figura 2F), e clique extremidade esquerdapara desenhar a primeira linha (Figura 2G).
         2. Arraste o mouse do ponto b para o ponto final de flexão 'c', e clique no botão esquerdo para desenhar a segunda linha (Figura 2H) e formar uma fixa A. Nota: O ângulo de flexão verdade é B, que é igual a 180 ° - A. (Figura 2F).
         3. Medir e registro Um pressionando 'M' no teclado. O ficheiro de resultado vai abrir separadamente, como mostrado na Figura 2I. Meça e registre todas as mudas um por um. Por exemplo, medir em primeiro lugar o ângulo de flexão de todos os hipocótilos de Col-0 e, em seguida, para as linhas mutantes.
   6. Transferir o conjunto de dados do ImageJ para arquivo de planilha para fazer a average de dobrar ângulos de cada fundo.
   7. Para a análise quantitativa, fazer um diagrama gráfico de barras com os resultados dos testes estatísticos, incluindo barras de erro padrão e valores de probabilidade (ver Figura 2).
      1. Calcular o verdadeiro flexão B, e projetar uma fórmula usando planilha, ou seja, B = 180 ° - Uma nota: Uma é o valor que foi derivada da análise ImageJ.
      2. Medir o ângulo de flexão média B para cada fundo usando ferramentas de planilha (Figura 2J).
      3. Analisar o desvio padrão entre as repetições para cada medição usando a planilha "fórmulas" de ferramentas (Figura 2J).
      4. Teste o sigsignificância dos resultados por aplicação de um teste-t para o ângulo médio de flexão e o desvio padrão calculados como mencionado acima.
      5. Desenhar um diagrama de barras usando os valores acima para representar graficamente a diferença quantitativa no ângulo de curvatura entre duas origens diferentes usando a planilha "insert" ferramenta (Figura 2K).
         Nota: Mutant sobre-expressão / linhas de genes candidatos fortes iria mostrar diferenças claras com relação a tipo selvagem, como nenhuma dobra, rápida flexão ou flexão lenta.

2. Linhas de plantas de tela com as respostas defeituoso Tropic devido a mudanças no PD SEL com um Altered PD calejado Nível

1. Executar uma Loading Ensaio Hipocótilo por 8-hidroxipireno-1,3,6-trissulfónico (HPTS) Dye Carregando no Top de Mudas com EAPs agarose Blocos e comparar o Movimento dos Dye Entre Mutant / sobre-expressão Linhas e Col-0.
   1. Prepare HPTS agaroblocos de si para o ensaio hipocótilo carregamento.
      1. Tomar 10 ml de _ddH2O num frasco cónico de 50 ml e adiciona-se 0,1 g de agarose para se preparar um gel de agarose a 1%. Ferva a agarose em um forno de microondas por 1-2 min com agitação intermitente, e deixe-o esfriar por 5 min.
      2. Adicionar 50 mg de HPTS para 10 ml de solução de agarose a 1%, e misturar bem, até a solução ficar verde.
      3. Verter a mistura acima a uma placa de Petri de 10 mm, e permitir que a solidificar durante 15 min.
      4. Corte as HPTS solidificadas agarose com uma lâmina de dissecção cortante para fazer pequenos blocos de agarose (0,5 x 2 cm ^2).
   2. Prepare amostras de plantas para o ensaio de corante de carregamento HPTS.
      1. Definir uma plataforma para o ensaio HPTS corante de carregamento; colocar uma cobertura deslizante microscópio (24 x 50 mm ^2), sobre uma placa de meio MS como mostrado na Figura 3A.
      2. Especiais de Consumo 3 dias de idade plântulas estioladas a partir da base do gancho usando uma tesoura cirúrgica afiado.
      3. Imediatamentetransferir as plântulas acima (um mínimo de 5 mudas de cada fundo) para a superfície de um vidro de cobertura microscópica, de tal maneira que apenas 0,5 centímetros de hipocótilo a partir da posição excisão deve permanecer na tampa deslizante, e o resto do hipocótilo deve tocar a forma como mostrado na Figura 3B.
      4. Colocar o bloco de agarose HPTS no topo do hipocótilo (com um gancho excisado) durante 5 min, de tal maneira que a área excisada toca o bloco de agarose HPTS.
      5. Após 5 min de carregamento, remover o bloco de agarose a partir da superfície do hipocótilo, transferir os hipocótilos para a 10 milímetros de Petri contendo _ddH2O e lavar hipocótilos em _ddH2O durante 15 minutos com agitação contínua.
   3. Prepare amostras para microscopia confocal.
      1. Escolha um mínimo de 5 mudas de cada fundo para observação ao microscópio confocal de varrimento laser.
      2. No canal de laser, definir o comprimento de onda de 488 nm para exc específicaitation e 500-550 nm para a emissão de passa-banda.
      3. Mudas de transferência em 2 sets (um Col-0 + um mutante) para uma nova lâmina de microscópio, após a lavagem com DDH ₂ O. Adicione 100-150 mL de água bidestilada para o slide, e cobrir com uma cobertura deslizante. Mudar o slide para o estágio do microscópio confocal.
      4. Concentre-se a região do hipocótilo (com uma lente objetiva de 20X ou 40X) usando de campo brilhante iluminação (luz branca). Em seguida, digitalizar os slides para fluorescência.
      5. Captar imagens para um mínimo de 10 conjuntos, e comparar os dois fundos, verificando a extensão do movimento do corante do ponto de carregamento.
         Nota: Mutant sobre-expressão / linhas com movimento symplasmic alterada vai mostrar diferentes padrões de carga de corante em relação ao tipo selvagem Col-0.
2. Analisar o nível calejado em Mutant / Lines sobre-expressão evidenciando alteração fototrópicas e gravitrópico Response e mostrando distinto HPTS Dye Movimento Compared de Col-0.
   1. Prepare anilina corante coloração calejado azul.
      1. Adicione 1 M de glicina, pH 9,5 e 0,1% (W / v) de azul de anilina em autoclavado ddH ₂ O.
      2. Adicione o tampão de coloração através da mistura de 0,1% de azul de anilina e 1 M de glicina em 2: 3 razões de volume. Por exemplo, para 50 ml de tampão de coloração, tomar 20 ml de 0,1% de azul de anilina e 30 ml de 1 M de glicina. Nota: Certifique-tampão a coloração de um mínimo de 48 horas antes do uso e armazená-lo no escuro.
   2. Stain dobrado ou mudas com corante azul de anilina-specific calejado não dobrado.
      1. A fim de inibir a síntese de novo de calose durante o processo de coloração, adicionar o volume final de 1,5 mM de 2-desoxi-D-glucose (DDG) a 50 ml de tampão de coloração.
      2. Tire mudas estiolados 3 dias de idade para coloração calejado (com ou sem resposta trópico).
      3. Corte as mudas de sua região gancho usando tesouras cirúrgicas finas.
      4. Transferir as mudas em uma pequena placa de Petri contêming 2 ml de tampão de coloração usando a ponta de um palito de dentes.
      5. Incubam-se as plântulas com tampão de coloração no escuro durante 2 horas com agitação contínua a 30 rpm.
      6. Após a coloração, lavar as mudas com _ddH2O por 2 min para remover o excesso de tampão de coloração.
      7. Escolha um mínimo de 5 mudas para cada fundo da planta para observação ao microscópio confocal de varrimento laser.
   3. Preparar as amostras para microscopia confocal:
      1. Transferir as mudas em conjunto (um Col-0 + um mutante) para limpar o microscópio desliza após a lavagem com DDH ₂ O.
      2. Adicione 100-150 mL de DDH ₂ O e cobrir com uma cobertura deslizante. Mudar o slide para o estágio do microscópio confocal.
      3. Num canal de laser, definir o comprimento de onda de 405 nm para a excitação específica e 500-550 nm de emissão para a imagiologia de fluorescência azul de anilina.
      4. Traga a região do hipocótilo em foco, primeiro com 10X e tardiar com 20X ou 40X lentes objetivas usando de campo brilhante (luz branca) iluminação.
      5. Em seguida, ligue a luz filtrada, digitalizar os slides para a fluorescência, e salvar as imagens.
      6. Medir a intensidade de sinal de calose com o software ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (Ver Figura 4).
         1. Alterar o formato de microscopia confocal imagens da Olympus Imagem formato binário (* .oib) para o formato de arquivo JPEG. Nota: Somente o formato JPEG é suportado pelo software ImageJ.
         2. Inicie o programa ImageJ clicando duas vezes (Figura 4A). Nota: As setas indicam a ferramenta rectângulo para ser utilizado na medição da intensidade de calose (Figura 4B).
         3. Clique na opção "Arquivo" seguido do sub-opção "Abrir" na barra de ferramentas ImageJ e abertos microscopia imagens que foram salvas no formato de arquivo JPEG para medir a intensidade calejado (Figura 4C).
         4. Clique no ícone retangular na Imabarra de ferramentas Gej (Figura 4D).
         5. Para analisar a intensidade do sinal, arraste o cursor sobre a imagem e seleccione a área a ser examinada (Figura 4E)
         6. Meça e registre os valores numéricos para intensidade de sinal pressionando "M" no teclado (Figura 4E). Nota: O arquivo resultado será aberta em separado (Figura 4F).
         7. Medir e registrar a intensidade valores um a um para todas as mudas de cada fundo da planta.
            Nota: No ImageJ, o arquivo de resultado "Mean" indica a intensidade do sinal da "Área" selecionado.
      7. Copiar os valores médios do arquivo de resultado ImageJ, e colar no arquivo de planilha para análise quantitativa.
      8. Para a análise quantitativa, fazer um diagrama gráfico de barras com os testes estatísticos, incluindo barras de erro padrão e valores de probabilidade (Figura 4).
         1. Medir a intensidade média do sinal(média de ImageJ) para cada fundo usando a planilha "fórmulas" de ferramentas (Figura 4G).
         2. Analisar o desvio padrão entre as repetições para cada medição usando a planilha "fórmulas" de ferramentas (Figura 4G).
         3. Calcular o erro padrão (SE) utilizando thespreadsheet "fórmulas" ferramenta.
            Nota: SE = s / √ n, onde (s) representa o desvio padrão da população, e (n) é o tamanho (número de observações) da amostra.
         4. Testar a significância dos resultados através da aplicação de um teste-t para a intensidade média do sinal e os valores de erro padrão calculados como mencionado acima.
         5. Desenhar um diagrama gráfico de barras usando os valores acima para representar graficamente a diferença quantitativa do nível calejado entre duas origens diferentes usando a planilha "insert" ferramenta (Figura 4H).
            Nota: Mutant sobre-expressão / linhas de candidatos fortes vai scomo os diferentes níveis de calejado em relação ao tipo selvagem, como não calejado, pouco calejado ou acumulação PD calejado hiper.

Representative Results

Na configuração atual, dexametasona (DEX) -inducible linhas RNAi de AtGSL8 [daqui em diante dsGSL8 (+ dex / -Dex)] foram utilizados, como gsl8 homozigotos mutantes de inserção de T-DNA são mudas letal ^18. Três dias de idade de plântulas estioladas dsGSL8 e mudas de tipo selvagem com Dex ± foram expostos a estímulos fototrópicos e gravitrópico. Descobrimos que dsGSL8 (+ dex) mudas eram defeituosos em phototropism e gravitropismo ^15. A Figura 5 mostra claramente que dsGSL8 (+ dex) exibe nenhuma dobra sob a influência de ambos phototropism e gravitropismo. Além disso, a alteração no movimento symplasmic em dsGSL8 (+ Dex) e dsGSL8 (-Dex) ou Col-0 foi analisada através de um ensaio de carga HPTS. Consistente com a nossa conclusão anterior, o movimento HPTS corante em dsGSL8 (+ dex) foi substancialmente mais extensa do que em dsGSL8 (-Dex) ou Col-0, Figura 6. calose é um dos principais reguladores da DP SEL, e AtGSL8 é conhecido como uma PD ¹⁶ calose sintase. Além disso, a coloração azul calose anilina foi levada a cabo, e dsGSL8 (+ Dex) mostraram um nível de calose persistentemente baixa de DP antes e depois respostas trópico, tal como mostrado na Figura 7.

Figura 1. Fluxograma dos passos que estão envolvidos na estimulação de respostas fototrópicas e gravitrópico. (A) Transferência vertical crescido mudas de diferentes origens vegetais para uma placa, mas em linhas separadas. (B) Para fototropismo, manter as placas de guarnição para a luz branca unilateral dentro de uma caixa escura que é aberto de um lado. Para gravitropismo, primeiro embrulhar as placas com folha de alumínio, girar 90 °, e transferir para um caixa escura (covered a partir de todos os lados). (C) Usando um scanner, digitalizar as placas após diferentes intervalos de tempo, tais como 1,5 hr, 3 hr, 6 horas e 12 horas. (D e E) Estes painéis mostram a geração de dados de ImageJ e análise de dados usando arquivos de planilhas, respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. A medição do ângulo de flexão por ImageJ. (A) Ver o programa J Imagem clicando duas vezes. (B) Os principais ferramentas que foram utilizados na medição do ângulo. (C) Abra a opção "Arquivo" seguido do sub-opção "Abrir" na barra de ferramentas J Imagem para abrir microscopia imagens que foram salvas no formato de arquivo JPEG. (D (F) Esboço da medição do ângulo: abc define um fixo A, e o ângulo de curvatura é calculada como verdadeiro B, que é igual a 180 ° - A. (G) Linha que representa a distância do ponto A ao ponto b. (H) A continuidade da linha de ab para apontar c tomada A. (I) arquivo Resultado da Imagem J exibição Um valor. (J) arquivo de planilha Representante exibindo as medições médias ângulo de flexão, standesvios-padrão, erros e cálculos t-teste. (K) Bar diagrama gráfico exibindo os dobra medidas de ângulo entre duas diferentes formações vegetais Col-0 e dsGSL8 EMS mutantes. As barras de erro são SEM (erro padrão da média +) e *** representa a significância pelo teste t (p value> 0,001). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Esquema dos passos que estão envolvidos no ensaio de carga HPTS. (A) Painel ilustrando a preparação dos blocos de agarose HPTS. (B) Painel representando a excisão e transferência de mudas e o carregamento de blocos de agarose EAPs. (C) Painel exibindo os passos que estão envolvidos na amostrapreparação para imagem confocal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Medição da intensidade calejado por ImageJ. (A) Ver o programa ImageJ clicando duas vezes. (B) Os principais ferramentas que foram utilizados na medição da intensidade de calose. (C) Abra a opção "Arquivo" seguido do sub-opção "Abrir" na barra de ferramentas ImageJ para abrir microscopia imagens que foram salvas no formato de arquivo JPEG. (D) O ícone retangular na barra de ferramentas ImageJ. (E) A área seleccionada da imagem para analisar a intensidade calejado. Arquivo de resultado (F) ImageJ exibindo o valor de intensidade calejado como "Mean". (L)arquivo de planilha representante exibindo as medições médias calejado intensidade, desvios-padrão, erro padrão e cálculos t-teste. Diagrama do gráfico (H) Bar representando a diferença da intensidade calejado entre os dois fundos de plantas. As barras de erro são SEM (erro padrão da média +) e *** representa a significância pelo teste t (p value> 0,001). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Redução de expressão AtGSL8 leva a defeito respostas trópico. (A) resposta fototrópicas mostrou por dsGSL8 (± dex), juntamente com Col-0. (B) resposta gravitrópico mostrado por dsGSL8 (± dex) al ong com Col-0. dsGSL8 (+ dex) não mostra respostas fototrópicas ou gravitrópico. dsGSL8 (+ dex) e dsGSL8 (-Dex) simbolizam tratados com dexametasona e não tratada dsGSL8 -inducible linhas RNAi, respectivamente. Barra de escala representa 0,2 cm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. O movimento symplasmic aumentou após a supressão da AtGSL8. Imagens de fluorescência foram tomadas após HPTS de carregamento para dsGSL8 ± superfícies dex hipocótilo corte, juntamente com tipo selvagem Col-0. DsGSL8 (+ dex) mostrou mais extensa circulação de HPTS tintura, demonstrando aumento movimento symplasmic. barra de escala representa 0,2 mm.com / files / ftp_upload / 53513 53513fig6large.jpg "target =" / _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7. AtGSL8 linhas suprimidas apresentaram distribuição PD calejado simétrica entre os lados iluminados e sombreadas do hipocótilo. (A) imagem de fluorescência mostrando anilina coloração azul calejado para dsGSL8 (-Dex) a 0 h. (B) Imagem de fluorescência mostrando anilina coloração azul calejado para dsGSL8 (-Dex), após 6 horas de phototropism. (C) Fluorescência imagem que mostra a coloração azul calejado anilina para dsGSL8 (+ dex), após 6 horas de phototropism. Setas amarelas indicam a acumulação calejado na região sombreada de hipocótilo. A barra de escala representa 50 um. (D) Diagrama do gráfico de barras representando a amount de calejado PD que no acumulado dsGSL8 (± dex) hipocótilos antes e depois de 3 horas e 6 horas de phototropism. focos intensidades de fluorescência foram medidos a partir de hipocótilos dez independentes (dados são a média ± SD; teste t de Student, * p <0,01). Esta figura foi modificado a partir de (Han et al., 2014) ^15. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Neste manuscrito, uma estratégia para a tela mutante / sobre-expressão linhas que são defeituosos nas respostas fototrópicas e gravitrópico devido a calejado PD alterada e, portanto, PD SEL é descrito em detalhes. a síntese e degradação de calose PD é conseguida principalmente por sintases de calose e β-1,3-glucanases, mas a regulação destes enzimas é controlada por muitos factores a montante. Para procurar tais factores a montante ou candidatos que estão diretamente envolvidos na regulação do PD, criámos este método para a seleção. Esta configuração tem algumas limitações como mutantes de algumas enzimas-chave que regulam a biossíntese PD calejado (gsl8) são letais ¹⁵ e para resolver tais mutantes seriam limitados por esta configuração. Além disso, se o gene candidato mostra mais rápida ou mais lenta de resposta trópico juntamente com PD aberto ou fechado, mas o nível de calose permanece inalterado, em seguida, a análise detalhada é necessária para caracterizar adicionalmente tais candidatos. Os fatores críticos e proce solução de problemassses em cada etapa também são elaborados. Em primeiro lugar, em preparação médio, um fator crítico que pode afetar o crescimento da planta é o pH dos meios de comunicação, que deve variar entre 5.7-5.8. Em segundo lugar, a secagem da superfície de placas de agar adequado é importante; seria difícil de levantar os 3 dias de idade, sem qualquer dano plântulas a partir de placas de agar com elevado teor de água. No entanto, muito de secagem de placas de ágar pode causar algumas rachaduras na mídia durante a incubação e resultar em crescimento de plântulas assimétrica. Durante a esterilização da superfície de sementes utilizando solução de hipoclorito de sódio, deve ser tomado cuidado para remover completamente o hipoclorito de sódio por lavagem repetitiva com DDH autoclavada ₂ O, uma vez que é um forte agente de branqueamento. Autoclavado _ddH2O deve ser preparada imediatamente e tratadas de forma asséptica, como estoques antigos pode causar contaminação por fungos em placas de MS. Após a esterilização, as sementes são estratificados por tratamento pelo frio para sincronizar a germinação. Este processo pode ser realizado quer por transferrinag esterilizado sementes molhadas diretamente para uma sala fria em ambientes escuros ou primeira pontilhando as sementes em placas de MS e, em seguida, transferindo as placas para um quarto frio em ambientes escuros. No entanto, nós preferimos o último, porque dá um crescimento mais uniforme das mudas. Enquanto salpicando sementes, a distância entre as duas sementes adjacentes deve ser pelo menos de 0,1 cm porque as sementes de muito perto pontilhadas iria resultar no crescimento de sobreposição de plântulas, que são muito difíceis de transferir em experiências subsequentes.

Para as respostas fototrópicas e gravitrópico adequadas, mudas não deve ser exposto à luz e deve permanecer intacta. Para evitar os efeitos de luz branca de fundo, selecionar cuidadosamente as mudas sob uma fonte de luz verde no quarto escuro como plantas não respondem a luz verde. fonte de luz verde pode ser gerado por cobrindo a fonte de luz branca utilizando folhas de vinilo transparente verde. Para selecionar as mudas, um palito esterilizado é a melhor opção. touch the parte muito inferior do hipocótilo com o palito para levantar as mudas de modo que eles podem ser facilmente transferidos para uma nova placa. Todas as mudas devem ser semelhantes em tamanho e orientação do gancho. Durante as nossas experiências, verificámos que se o sentido de gancho está no lado oposto da fonte de luz, as plantas irão mostrar uma resposta mais rápida do que trópico plantas com a mesma direcção de gancho como fonte de luz. Normalmente, no caso de phototropism, pode-se ver uma clara diferença entre o ângulo de flexão entre os verdadeiros candidatos e Col-0 dentro de 3 horas, enquanto que no caso de gravitropismo, que normalmente leva 6-12 horas. Finalmente, para ter os dados estatisticamente relevantes, um mínimo de três réplicas biológicas e 20 mudas são necessários de cada vez.

Para testar o grau de movimento symplasmic entre diferentes origens vegetais, HPTS corante de carga é uma técnica conveniente, uma vez que não necessita de ferramentas sofisticadas e instrumentação. Para o ensaio de carga HPTS, a percentagem de gel em blocos de agarose EAPs é de grande importância, como um gel muito frágil ou disco não vai dar os melhores resultados. É preferível utilizar um frasco cónico de 50 ml com borracha solto e não a utilização de um balão de grande volume para a ferver de agarose com 10 ml de água. blocos de agarose HPTS pode ser utilizada durante uma semana após a preparação se mantido embrulhado com folha de alumínio a 4 ° C. Outro fator fundamental no ensaio de carga HPTS é a excisão da região do hipocótilo gancho. Excisão deve ser realizado com tesouras de dissecação afiadas e numa posição semelhante para todas as mudas. Excisão com uma tesoura sem corte pode causar danos indesejados para mudas e pode dificultar HPTS carregamento. Além disso, as condições de crescimento das plântulas e estágios de desenvolvimento pode desempenhar um papel crucial na circulação do corante, como a acumulação de calose é mais propensos a responder a tais mudanças, o que, finalmente, representam o obstáculo em movimento corante. Assim, o crescimento das mudas nas melhores condições é necessário. Calose em PD desempenha um papel fundamental narespostas trópico de mudas estiolados através da regulação PD SEL, que é importante para auxina formação de gradiente ^15. níveis de calose pode ser detectado por coloração com azul de rotulagem ou imuno-anilina. A coloração com azul de anilina é um método simples e rápido para detectar o nível calejado. Como as células de hipocótilo têm alta pressão de turgescência e uma camada epi-cutícula, que não é fácil para o corante penetrar as células. Por isso, desenvolvemos o método cut-coloração para permitir anilina corante azul para penetrar facilmente. No entanto, existe o risco de a síntese de novo de calose que podem influenciar os resultados de coloração, que é uma limitação do método de coloração de calose normal. Para evitar tais efeitos, o protocolo de coloração é modificado através da adição do inibidor da sintase de calose glucose a 2-desoxi-D (DDG) para o tampão de coloração. Assim, este protocolo envolve a medição de calose pré-existentes apenas na região inferior do hipocótilo que é exactamente abaixo do local de corte. Evitar o uso de prepar recentementeEd azul de anilina, e manter a solução de azul de anilina à temperatura ambiente durante um mínimo de 48 horas antes da utilização. Notamos que a coloração com solução de azul fresco anilina não dá melhores resultados de coloração calejado.

No geral, nós apresentamos um conjunto de estratégias que podem ser utilizadas para o rápido rastreio de mutantes de sobre-expressão / linhas com uma resposta trópico defeituoso ou melhorada, alterando PD SEL por directa ou indirectamente, modulando calose PD. Um fato mais cedo sobre respostas trópico foi majorly restrito à ação de portadores de auxina e jogadores de sinalização, como PINIOD ^2-14. Além disso, também estabeleceram um papel crítico de movimento symplasmic de auxina em manter um gradiente de auxina no sistema ¹⁵ hipocótilo. A simplicidade e versatilidade deste método, sem dúvida, reforçam a sua utilidade na investigação de genes candidatos para a sua regulação de PD SEL, desempenhando assim um papel essencial no desenvolvimento da planta, incluindo respostas trópico.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt)	Sigma	H1529-1G	Fluorescent dye as symplasmic tracer
LE Agarose	Dongin-Genomic	GEL001-500G	Used for HPTS agarose block
Microwave oven	LG-Goldstar		Machine for boiling agarose gel
100 ml glass conical flask	Dong Kwang	A0205	Used to boil HPTS agarose gel
Petri dish (35 mm x 10 mm)	SPL life sciences	SPL10035	Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples
Microscope cover slides and glass slides (24 mm x 50 mm)	Marienfeld Laboratory Glassware	101222	Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation
MS medium plates 125 mm x 125 mm x 20 mm	SPL life sciences	SPL11125	Plates to make MS agar medium
Scissors	Germany Stainless	HSB 942-11	Used to excise hook region of plant samples
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture	Duchefa	P10453.01	MS medium including vitamins.
(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate	Bioshop	3G30212	To make MS media.
Plant agar	Duchefa	P1001.1000	To solidify MS media.
Autoclave	ALP	CL-40L
Shaker	Wise Mix	SHO-1D	To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way.
1 ml Blue tips	Sorenson	10040
1 ml pipette	BioPette	L-1101-2
Surgical tape	MIcropore	1530-0	To seal the MS plate
Aniline blue (Methyl blue)	Sigma	M5528-25G	Used to prepare aniline blue staining buffer.
Glycine	Bioshop	GLN001	Used to prepare aniline blue staining buffer.
DDG	Sigma	D8375-1G	Used for the inhibition of callose synthases.
Confocal microscope	Olympus	FV1000MPE SIM	To check aniline blue staining and HPTS dye loading result.
Stirrer	I lab	K400	To mix media solution.
Aluminium foil	SW cooking foil		To wrap plates in a dark condition.
Sodium hypochlorite	Samjin Industry		To surface-sterilized seeds