Eine Strategie zur Validierung der Rolle der Kallose-vermittelten Plasmodesmal Gating im Tropic Antwort

Summary

Dieser Artikel beschreibt die Methoden für die Gene Screening plasmodesmal Permeabilität und damit Auxin Gradienten während tropischen Reaktion zu steuern. Dies beinhaltet die Messung des Grades der Tropic Reaktion in Hypokotyl von Arabidopsis thaliana und plasmodesmal Permeabilität von 8-Hydroxypyren-1,3,6-trisulfonsäure (HPTS) Laden und schließlich Kallose- Ebene Beurteilung zu überprüfen.

Abstract

Das Pflanzenhormon Auxin spielt eine wichtige Rolle in vielen Wachstums- und Entwicklungsprozessen, einschließlich tropische Reaktionen auf Licht und Schwerkraft. Die Einrichtung eines Auxin Gradient ist ein Schlüsselereignis zu phototropism und Gravitropismus führt. Zuvor wurde polare Auxin-Transport (PAT) gezeigt ein Auxin Gradienten in verschiedenen zellulären Domänen von Pflanzen zu schaffen. Allerdings Han et al. Haben kürzlich gezeigt , dass für eine ordnungsgemäße Auxin Gradienten Bildung, plasmodesmal Kallose-vermittelte symplasmic Konnektivität zwischen den benachbarten Zellen ist auch ein kritischer Faktor. In diesem Manuskript, auf die Strategie, die Rolle bestimmter Gene aufzuklären, die phototropism und Gravitropismus durch Veränderung der symplasmic Konnektivität durch Modulation plasmodesmal Kallose- Synthese beeinflussen können, wird diskutiert. Der erste Schritt ist zusammen mit dem Wildtyp abweichenden tropischen Antworten von 3 Tage alten etiolated Sämlinge von Mutanten oder Überexpression Linien eines Gens zu screenen. Diese vorläufige Screeningkann dazu führen, symplasmic Verbindung zur Identifizierung einer Reihe von Genen in PAT funktionieren oder zu steuern. Das zweite Screening beinhaltet die Sortierung von Kandidaten, die durch Beeinflussung symplasmic Konnektivität veränderten tropischen Antworten zeigen. Um solche Kandidaten, die Bewegung eines symplasmic Tracer und die Ablagerung von plasmodesmal Callose adressieren wurden untersucht. Diese Strategie wäre nützlich, neue Kandidaten-Gene zu untersuchen, die symplasmic Konnektivität direkt oder indirekt bei Tropic Reaktionen und andere Entwicklungsprozesse regulieren kann.

Introduction

Pflanzen, wie sessile Lebewesen haben ein hochentwickeltes Netz von Zell-zu-Zell-Signal entwickelt, um verschiedene Umweltstimuli ansprechen. Tropic Reaktionen sind eines der Phänomene, bei dem Pflanzen auf Umweltreize reagieren. Pflanzen zeigen zwei Haupt tropischen Antworten, Phototropismus und Gravitropismus. Photosynthetic Pflanzen biegen in Richtung der Lichtquelle durch Phototropismus maximale Energie zu ernten. In ähnlicher Weise macht Gravitropismus die Pflanzen in Richtung des Schwerpunkts zu wachsen. Der grundlegende Mechanismus für solche tropischen Reaktionen führen beinhaltet asymmetrische Gradienten Bildung der Phytohormone Auxin ^1. Der Akt des lokalen Auxin Gradienten Bildung ist gut charakterisiert; die Gene , die an diesem Mechanismus beteiligt sind , bieten einen Fahrplan für die Hormonwirkung ^2-8. Die spezifische Position der Auxin Efflux Träger, wie PIN-FORMED (PIN) und P-Glykoproteine, führt die Bewegung von Auxin aus dem Cytoplasma in den Zellwand von Donorzellen ^9,10. Furthermore, durch die aktive H ⁺ / IAA Symport Aktivität von Auxin Einstrom Träger wie AUX1 / LAX Familienproteine, Auxin wird schließlich zu den benachbarten Empfängerzellen ^2,11,12 geliefert. Diese gerichtete Bewegung von Auxin als polare Auxin-Transport (PAT) bekannt. PAT führt zu einer differentiellen Auxin Verteilung während der verschiedenen Entwicklungsstadien und als Reaktion auf unterschiedliche Umweltreize ^13,14. Darüber hinaus führt die Unterbrechung der Lokalisierung oder Expression von beliebigen dieser Auxin Einströmen oder Ausströmen Träger schwerer Veränderung in PAT, die eine Unterbrechung des Auxin-Gradienten bewirkt, zu Entwicklungsstörungen führen. Vor kurzem Han et al. berichtet , dass plasmodesmal Regelung auch notwendig ist , ¹⁵ die Auxin - Gradienten zu halten. Bis heute, mehr als 30 plasmodesmal Proteine ​​wurden ¹⁶ identifiziert. Unter diesen Proteinen als ein Schlüsselenzym für die Synthese bei Callose plasmodesmata (PD), und somit spielt eine wichtige Rolle in maint berichtet AtGSL8 wurdeaining die PD Größe Ausschlussgrenze (SEL). Unterdrückte AtGSL8 Expression führte zu einer verzerrten Muster Auxin Gradienten zu keinem tropischen Reaktion im Gegensatz zu Wildtyp - Sämlinge ¹⁵ führt.

In diesem Manuskript, zu Methoden, um neue Kandidaten-Gene erforschen, die bei Parkinson-Regulation beteiligt sind, zur Verfügung gestellt. AtGSL8 wurde als Modell-Protein verwendet, um diese Methoden zu testen, da es ein Schlüsselenzym trägt Callose Biosynthese PD. Aufgrund der Sämlings-Letalität gsl8 ¹⁷ Mutanten knock-out, Dexamethason (Dex) -induzierbaren RNAi - Linien wurden in Übereinstimmung mit einem zuvor veröffentlichten Bericht ¹⁵ verwendet. Die Strategie hier kann vorgesehen sein, angepasst Gene zu suchen, die in Hypokotyls Tropic Antwort von PD SEL gesteuert beteiligt sind.

Protocol

1. Screening von Mutanten mit Altered Phototrope und Gravitrope Antworten

1. Bereiten Sie 1x Murashige und Skoog (MS) Medium, pH 5,7, mit 0,8% Agar einen Tag vor dem Experiment.
   1. In 800 ml doppelt destilliertem Wasser in einen 2 l-Erlenmeyerkolben und rühren mit einem Magnetstab.
   2. In 4,4 g MS Salz in den Erlenmeyerkolben.
   3. Mit 0,5 g 2- (N-Morpholino) ethansulfonsäure (MES) und rühren, bis alle Salze vollständig gelöst sind.
   4. Der pH-Wert des Mediums auf 5,7 mit 1 M KOH.
   5. Übertragen , um das Medium zu einem Massenzylinder und bringen Endvolumen auf 1 l mit ddH ₂ O.
   6. Gießen Sie das Medium in einen 2 l-Erlenmeyerkolben zurück und fügen Sie 8 g Pflanzen Agar.
   7. Wickeln Sie den Mund des konischen Kolben fest mit Aluminiumfolie.
   8. Autoklave mit MS - Medium und ddH ₂ O für 15 Minuten bei 121 ° C, 15 psi, und nach dem Autoklavieren, halten Sie das Medium in einem 60 ° C Inkubator und der ddH ₂ O bei RT.
   9. Nach Abkühlen auf 60 ° C, gieße das Medium in 125 x 125 x 20 mm ³ quadratische Platten auf einem laminaren Strömungsbank (50 ml in jeder Platte).
   10. Erlauben es dem Agar für etwa 1 h bei RT zu verfestigen, indem die Platten teilweise offen gehalten wird. Wenn die Platten nicht sofort verwendet werden, versiegeln sie durch Plastikverpackung und lagern bei 4 ° C in einem Kühlschrank verwendet wird.
2. Oberflächen sterilisieren die Samen mit 1,1% Natriumhypochlorit und dot die Samen auf 1x MS-Agar-Platten, die in Abschnitt 1.1 hergestellt.
   Hinweis: Hier Arabidopsis thaliana {Col-0 Seeds, dsGSL8 (Col-0)} ¹⁵ sind für tropische Reaktion verwendet, Kallose - Färbung und HPTS Laden Arabidopsis thaliana {Col-0 und dsGSL8 (Col-0) EMS - Mutante} Samen (. nicht veröffentlicht) sind für tropische Reaktion in Abbildung 2 verwendet.
   1. Autoclave 300 ml ddH ₂ O in einer Flasche.
   2. In etwa hundert Samen für jeden Hintergrund, das heißt,Mutante / Überexpression Linie und Wildtyp (Col-0) Samen, in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
   3. Nehmen Sie 1x MS-Agar-Platten von einem 4 ° C Kühlschrank und trocknen Sie sie auf einem Laminar-Flow-Bank in einer teilweise offenen Position.
   4. Oberflächen sterilisieren die Samen durch Zugabe von 1 ml einer 0,2 x Bleichlösung (1,1% Natriumhypochlorit) und halten Sie die Reaktionsgefäße auf Schüttler bei 250 Umdrehungen pro Minute für 5 min.
   5. Lassen Sie die Samen durch die Schwerkraft auf den Boden absetzen und dann durch Mikro die Bleichlösung zu entfernen.
   6. 1 ml frischem ddH ₂ O (autoklaviert) auf die Samen und mischen Sie gut durch den Mikrozentrifugenröhrchen mehrmals umgekehrt wird . Lassen Sie die Samen wieder absetzen und dann das Wasser zu entfernen.
   7. Wiederholen Sie Schritt 1.2.6 5-6 mal.
   8. Fügen die doppelte Menge an Wasser zu dem Volumen der Samen, die nach dem letzten Wasch gelassen wurden.
   9. Dot die sterilisierten Samen auf einem halbgetrockneten 1x MS-Agar-Platte eine 1 ml Mikropipettenspitze, die 200 & mgr; l von Samen mit (including Wasser).
      1. Halten Sie etwa eine 0,1 cm Abstand zwischen zwei Samen und ein Minimum von 1,8 cm zwischen zwei Samenreihen. Punkt , um die Samen in fünf horizontalen Reihen pro Quadratplatte (125 x 125 x 20 mm ^3). Lassen Sie das Wasser leicht zu trocknen, bevor Sie den Deckel auf die Platte legen.
   10. Verschließen Sie die Platten mit chirurgischen Band, stapeln alle Platten vertikal und wickeln mit Aluminiumfolie.
   11. Übertragen Sie die eingewickelt Platten zu einem dunklen Kasten (ohne Zugang zu Licht). Dann halten Sie die dunkle Box in einem 4 ° C Zimmer / Kühlschrank für 3 Tage.
   12. Ausgehend von diesem Schritt, halten Sie die Richtung der Platten unverändert. Nach 3 Tagen Kältebehandlung, halten Sie den dunklen Kasten in einer Pflanzenkulturraum bei 22 ° C für die nächsten 3 Tage. Nach 3 Tagen, überprüfen Sie die Keimung Status der Samen unter grünem Licht in einem dunklen Raum.
       HINWEIS: In der Regel 3 Tage alten Col-0 etiolated Sämlinge bis 1,6 cm lang werden können.
3. Analysieren Sie den veränderten phototropes einnd gravitropen Reaktion in Mutanten oder Überexpression Linien eines spezifischen Gens. Wählen Sie nur ähnlich großen und vertikal gewachsen gerade Sämlinge unter grünem Licht in einem dunklen Raum. Übertragen Sie ausgewählte Sämlinge auf eine frische 1x MS-Agar-Platte mit der Spitze eines sterilisierten Zahnstocher.
   1. Wählen Sie leicht die Sämlinge aus dem untersten Teil ihrer Hypokotyls ohne andere Teile zu berühren. Stellen Sie sicher, dass alle die Sämlinge haben gleiche cotyledon / Haken Ausrichtung und nach der Übertragung, dass die Ausrichtung der Sämling Haken bleiben gleich. Verwenden mindestens 20 Keimlinge von jedem Hintergrund in jeder Reihe und mindestens zwei Platten für jeden Zeitpunkt für eine weitere Analyse.
      Hinweis: Vier verschiedene Hintergründe können in jeder Platte (4 Zeilen) verglichen werden.
      Optional: Während Dexamethason (Dex) -induzierbaren RNAi / Überexpression Linien verwenden, die oben Sämlinge auf eine 1x MS übertragen Platte mit der + dex MS Platte entlang (Platte mit 1x MS, 0,8% Agar-Medium mit 20 & mgr; M DEX ergänzt) for 3 Stunden und halten die Platten vertikal in dunklen Kasten.
   2. Um phototropes Antwort überprüfen, übertragen Sie die oben Platten senkrecht zu einer schwarzen Box mit nur einer Seite geöffnet. Übertragen Sie die Black-Box-enthaltenden Platten zu einer Pflanze Wachstumskammer mit einseitigem weißes Licht. Um einseitige Licht zu gewährleisten, stellen Sie den Rand der Platte in Richtung der Lichtquelle (nicht die Vorderseite). Wenden Sie sich an das Setup in Abbildung 1.
   3. In ähnlicher Weise die gravitropen Reaktion zu überprüfen, halten die Platten mit übertragen Sämlinge vertikal und mit Alufolie abdecken. Als nächstes vertikal die Platte Ausrichtung ändern, um 90 ° und es im Inneren der Black Box von allen Seiten bedeckt halten. Wenden Sie sich an das Setup in Abbildung 1.
   4. Nach den angegebenen Zeitpunkten (in der Regel 1,5 Stunden, 3 Stunden, 6 Stunden und 12 Stunden) zu scannen, die Platten mit einem Scanner, und die Bilder im JPEG-Format speichern.
   5. Messen Sie den Biegewinkel von Sämlingen mit ImageJ Software (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (Abbure 2).
      1. Starten Sie das ImageJ Programm durch einen Doppelklick (2A).
         Anmerkung: Die wichtigsten Werkzeuge , die in der Winkelmessung verwendet wurden , sind in 2B gezeigt.
      2. Klicken Sie auf die Option "Datei" , gefolgt von Unteroption "Open" in der ImageJ Symbolleiste und öffnen Sie Bilder gespeichert im JPEG - Dateiformat den tropischen Biegewinkel (2C) zu messen.
      3. Klicken Sie auf das Vergrößerungswerkzeug in oder auf das Bild , um es zu vergrößern , indem Sie die linke oder rechte Maustaste, bzw. wie in 2B gezeigt.
      4. Klicken Sie auf das Scroll - Werkzeug zu ziehen und positionieren Sie das Bild (2D) .Neben, klicken Sie auf den Winkel Werkzeug , um den Biegewinkel (Abbildung 2E) zu messen.
         1. Machen Sie einen Doppelklick der linken Maustaste auf den ursprünglichen Hypokotyls Wachstumsrichtung Punkt 'a', ziehen Sie die Maus auf die Biegeanfangspunkt "b" (2F) und klicken Sie links Hinternin der ersten Zeile (2G) zu zeichnen.
         2. Ziehen Sie die Maus von dem Punkt B zu dem Biege Endpunkt 'c', und klicken Sie auf die linke Taste , um die zweite Linie zu zeichnen (Abbildung 2H) und bilden eine feste A. Hinweis: Die wahre Biegewinkel ist B, die auf 180 ° gleich ist - A. (2F).
         3. Messen und speichern Ein durch "M" auf der Tastatur drücken. Die Ergebnisdatei wird separat öffnen , wie in 2I gezeigt. Messen und alle der Sämlinge einzeln aufzuzeichnen. Zum Beispiel messen zuerst den Biegewinkel für alle der Hypokotyle von Col-0 und dann für Mutantenlinien.
   6. Übertragen Sie den Datensatz aus ImageJ zu Tabellenkalkulationsdatei, um die av machenschnittlich Winkel jedes Hintergrund Biegen.
   7. Für die quantitative Analyse, machen ein Balkendiagramm , Diagramm mit statistischen Testergebnisse, einschließlich Standard - Fehlerbalken und Wahrscheinlichkeitswerte (siehe Abbildung 2).
      1. Berechnen Sie die wahre Biege B, und entwerfen Sie ein Formel - Tabelle verwenden, das heißt, B = 180 ° - Eine Notiz: A ist der Wert, der aus ImageJ Analyse abgeleitet wurde.
      2. Messen Sie die durchschnittliche Biegewinkel B für jeden Hintergrund mit Tabellenkalkulationsfunktionen (2J).
      3. Analysieren Sie die Standardabweichung zwischen den Wiederholungen für jede Messung mit dem Tabellenkalkulations "Formeln" Werkzeug (2J).
      4. Testen Sie die sigdeutung der Ergebnisse durch einen t-Test auf die durchschnittliche Biegewinkel und Standardabweichungswerte der Anwendung berechnet, wie oben erwähnt.
      5. Zeichnen Sie ein Balkendiagramm der obigen Werte mit grafisch die quantitative Unterschied in der Biegewinkel zwischen zwei verschiedenen Hintergründen mit der Kalkulationstabelle "Einfügen" Werkzeug (Abbildung 2K) darstellen.
         Hinweis: Mutant / Überexpression Linien von starken Kandidaten-Gene zeigen würde deutliche Unterschiede in Bezug auf Wildtyp, wie sie kein Verbiegen, schnelle Biegen oder langsam Biegen.

2. Bildschirmpflanzenlinien mit defekten Tropic Antworten auf Grund von Änderungen in PD SEL mit einem Altered PD Kallose Ebene

1. Führen Sie eine Hypokotyl Laden Assay von 8-Hydroxypyren-1,3,6-trisulfonsäure (HPTS) Farbstoffbeladung auf dem Top of Keimlinge mit HPTS Agaroseblöcken und Vergleichen Sie die Bewegung des Farbstoffs zwischen Mutant / Überexpression Linien und Col-0.
   1. Bereiten Sie HPTS agarose Blöcke für den Hypokotyls Laden-Test.
      1. Nehmen 10 ml ddH ₂ O in einem 50 ml Erlenmeyerkolben und fügen Sie 0,1 g Agarose ein 1% Agarosegel herzustellen. Kochen Sie die Agarose in einem Mikrowellenofen für 1-2 min mit intermittierendem Schütteln, und lassen Sie es für 5 Minuten abkühlen lassen.
      2. In 50 mg HPTS bis 10 ml einer 1% igen Lösung und gut mischen, bis die Lösung grün wird.
      3. Gießen Sie die obige Mischung auf eine 10 mm Petrischale, und lassen Sie es 15 Minuten zu verfestigen.
      4. Schneiden Sie die erstarrten HPTS Agarose mit einem scharfen Schnitt Klinge kleine Agaroseblöcken (0,5 x 2 cm ²⁾ zu machen.
   2. Bereiten Pflanzenproben für die HPTS Farbstoff-Laden-Test.
      1. Stellen Sie eine Plattform für den HPTS Farbstoffbeladung Assay; legen Sie eine Mikroskop - Deckschieber (24 x 50 mm ²⁾ auf einem neuen MS - Medium - Platte , wie in 3A gezeigt.
      2. Excise 3 Tage alten etiolated Sämlinge von der Basis des Hakens eine scharfe chirurgische Schere verwenden.
      3. Sofortübertragen Sie die oben Setzlinge (mindestens 5 Sämlinge von jedem Hintergrund) auf die Oberfläche eines mikroskopischen Deckglas in einer Weise, die nur 0,5 cm von Hypocotyl aus der Exzision Position auf Abdeckschlitten, und der Rest des Hypokotyls bleiben sollte sollte berühren das Medium , wie in 3B gezeigt.
      4. Legen Sie die HPTS Agaroseblock auf dem Hypokotyl (mit einem ausgeschnittenen Haken) für 5 min in einer Weise, dass die ausgeschnittenen Bereich der HPTS Agaroseblock berührt.
      5. Nach 5 min Belastung, die Agarose Block von der Hypokotyls Oberfläche zu entfernen, übertragen Sie die Hypokotylen auf die 10 mm Petrischale mit ddH ₂ O und waschen Hypokotylen in ddH ₂ O für 15 Minuten unter ständigem Schütteln.
   3. Vorbereitung der Proben für die konfokale Mikroskopie.
      1. Wählen Sie ein Minimum von 5 Sämlinge von jedem Hintergrund für die Beobachtung unter dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop.
      2. In der Laserkanal, stellen Sie die Wellenlänge 488 nm für spezifische EXCitation und 500 bis 550 nm für Bandpass Emission.
      3. Transfer Sämlinge in 2 Sätzen (ein Col-0 + eine Mutante) auf einen neuen Objektträger , nachdem er mit ddH ₂ O. Waschen In 100-150 ul doppelt destilliertem Wasser auf den Objektträger und Deckel mit einem Deckglas. Verschieben Sie den Schlitten auf die Bühne des konfokalen Mikroskops.
      4. Focus der Hypokotyls Region (mit 20X oder 40X Objektiv) unter Verwendung von Hellfeld (weißes Licht) Beleuchtung. Dann scannen Sie die Folien für die Fluoreszenz.
      5. Nehmen Sie Bilder für mindestens 10 Sätze, und vergleichen Sie die zwei Hintergründe durch das Ausmaß der Farbstoff Bewegung von der Ladestelle zu überprüfen.
         Hinweis: Mutant / Überexpression Linien mit veränderten symplasmic Bewegung zeigen unterschiedliche Muster der Farbstoffbeladung im Vergleich zu Wildtyp - Col-0.
2. Analysieren Sie den Kallose Ebene in Mutant / Überexpression Linien Zeige Altered Phototrope und Gravitrope Antwort und Anzeigen Distinct HPTS Dye Bewegung Compared zum Col-0.
   1. Bereiten Anilinblau Kallose- Färbung Farbstoff.
      1. Stellen Sie 1 M Glycin, pH 9,5 und 0,1% (W / V) Anilinblau in autoklaviert ddH ₂ O.
      2. Machen Sie den Färbepuffers um 0,1% Anilinblau Mischen und 1 M Glycin in 2: 3 Volumenverhältnisse. Beispielsweise für 50 ml Färbepuffer, nehmen 20 ml von 0,1% Anilinblau und 30 ml 1 M Glycin. Hinweis: Stellen Sie die Färbung mindestens 48 Stunden vor Puffer, es zu benutzen und speichern im Dunkeln.
   2. Stain gebogen oder nicht gebogen Sämlinge mit Kallose- spezifischen Anilin blauen Farbstoff.
      1. Um die de novo Synthese Callose während des Färbeprozesses hemmen, fügen Sie das Endvolumen von 1,5 mM 2-deoxy-D-glucose (DDG) auf 50 ml Färbepuffer.
      2. Nehmen Sie 3 Tage alten etiolated Sämlinge für Kallose-Färbung (mit oder ohne Tropen Antwort).
      3. Schneiden Sie die Sämlinge aus ihren Haken Region mit dünnen chirurgische Scheren.
      4. Übertragen Sie die Sämlinge in eine kleine Petrischale enthaltening 2 ml Färbepuffers die Spitze eines Zahnstocher.
      5. Inkubieren der Sämlinge mit Färbepuffer im Dunkeln für 2 Stunden unter kontinuierlichem Schütteln bei 30 Upm.
      6. Nach dem Färben, waschen Sie die Sämlinge mit ddH ₂ O 2 min überschüssige Färbepuffers zu entfernen.
      7. Wählen Sie mindestens 5 Setzlinge für jede Pflanze Hintergrund für die Beobachtung unter dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop.
   3. Bereiten Sie die Proben für die konfokale Mikroskopie:
      1. Übertragen Sie die Sämlinge im Set (eine Col-0 + eine Mutante) , um das Mikroskop zu reinigen gleitet nach dem Waschen mit ddH ₂ O.
      2. In 100-150 ul ddH ₂ O und Deckel mit einem Deckglas. Verschieben Sie den Schlitten auf die Bühne des konfokalen Mikroskops.
      3. In einem Laserkanal, setzen die Wellenlänge auf 405 nm für spezifische Anregungs- und 500 bis 550 nm Emission für die Abbildung von Anilin blaue Fluoreszenz.
      4. Bringen Sie die Hypokotyls Region in den Fokus, zunächst mit 10X und spätr mit 20X oder 40X Objektivlinsen mit Hellfeld (weißes Licht) Beleuchtung.
      5. Dann schalten Sie gefilterte Licht, scannen die Folien für die Fluoreszenz und die Bilder speichern.
      6. Messen Sie die Kallose- Signalintensität mit ImageJ Software (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (siehe Abbildung 4).
         1. Ändern Sie das Format der konfokalen Mikroskopie Bilder von Olympus Bild Binary-Format (* .oib) in das JPEG-Dateiformat. Hinweis: Nur JPEG-Format von ImageJ Software unterstützt wird.
         2. Starten Sie das ImageJ Programm durch einen Doppelklick (4A). Hinweis: Pfeile , um das Rechteck - Werkzeug zeigen , die in der Kallose- Intensitätsmessung verwendet werden (4B).
         3. Klicken Sie auf die Option "Datei" , gefolgt von der Unteroption "Open" in der ImageJ Symbolleiste und öffnen Mikroskopie Bilder , die im JPEG - Dateiformat gespeichert wurden die Kallose- Intensität (4C) zu messen.
         4. Klicken Sie auf die rechteckigen Symbol auf dem ImaGej Symbolleiste (4D).
         5. Um die Signalintensität, ziehen Sie den Cursor über das Bild zu analysieren und den Bereich , zu untersuch (4E)
         6. Messen und die numerischen Werte für die Signalintensität aufzeichnen , indem Sie "M" auf der Tastatur (Abbildung 4E). Hinweis: Das Ergebnis Datei separat geöffnet (4F).
         7. Zu messen und aufzuzeichnen, die Intensitätswerte eins nach dem anderen für alle die Sämlinge von jeder Pflanze Hintergrund.
            Hinweis: In ImageJ, die Ergebnisdatei "Mean" zeigt die Signalstärke des gewählten "Bereich".
      7. Kopieren Sie die Mittelwerte aus dem ImageJ Ergebnisdatei, und fügen Sie ihn in Tabellenkalkulationsdatei für die quantitative Analyse.
      8. Für die quantitative Analyse, ein Balkendiagramm , Diagramm mit statistischen Tests, einschließlich Standard - Fehlerbalken und Wahrscheinlichkeitswerte (Abbildung 4).
         1. Messen Sie die durchschnittliche Signalintensität(Mittelwert von ImageJ) für jeden Hintergrund mit der Kalkulationstabelle "Formeln" Werkzeug (4G).
         2. Analysieren Sie die Standardabweichung zwischen den Wiederholungen für jede Messung mit dem Tabellenkalkulations "Formeln" Werkzeug (4G).
         3. Berechnen Sie die Standardfehler (SE) thespreadsheet "Formeln" Tool.
            Hinweis: SE = s / √ n ist , wobei (n) die Standardabweichung der Population ist, und (n) die Größe (Anzahl der Beobachtungen) der Probe.
         4. Die Signifikanz der Ergebnisse durch einen t-Test auf die mittlere Signalintensität und Standardfehlerwerte berechnet Anwendung wie oben erwähnt.
         5. Zeichnen Sie ein Balkendiagramm , Diagramm , das die oben genannten Werte mit graphisch den quantitativen Unterschied in der Kallose- Ebene zu vertreten zwischen zwei verschiedenen Hintergründen mit der Kalkulationstabelle "Insert" Werkzeug (4H).
            Hinweis: Mutant / Überexpression Linien von starken Kandidaten swie die verschiedenen Ebenen der Kallose- Vergleich zum Wildtyp, wie sie kein Kallose-, wenig Kallose- oder hyper PD Kallose- Akkumulation.

Representative Results

In der aktuellen Setup, Dexamethason (DEX) -induzierbaren RNAi Linien AtGSL8 [im Folgenden dsGSL8 (+ dex / -dex)] verwendet wurden, als homozygote gsl8 T-DNA Insertionsmutanten letalen ¹⁸ Sämling. Drei Tage alten etiolated Sämlinge von dsGSL8 und Wildtyp - Sämlinge mit ± dex wurden phototropes und gravitropen Reizen ausgesetzt. Wir fanden , dass dsGSL8 (+ dex) Sämlinge ¹⁵ in phototropism und Gravitropismus defekt waren. Abbildung 5 zeigt deutlich , dass dsGSL8 (+ dex) zeigt sowohl kein Biegen unter dem Einfluss phototropism und Gravitropismus. Des Weiteren Veränderung in symplasmic Bewegung in dsGSL8 (+ dex) und dsGSL8 (-dex) oder Col-0 wurde durch einen HPTS Laden Test analysiert. In Übereinstimmung mit unseren früheren Befund, der HPTS Farbstoff Bewegung in dsGSL8 (+ dex) war wesentlich umfangreicher als in dsGSL8 (-dex) oder Col-0, Abbildung 6 gezeigt Kallose ist einer der wichtigsten Regulatoren der PD SEL und AtGSL8 wird als PD Kallose - Synthase ¹⁶ bekannt. Darüber hinaus wurde Kallose- Anilin - Blau - Färbung durchgeführt, und dsGSL8 (+ dex) haben beharrlich einen niedrigen PD Kallose- Ebene vor und nach tropischen Antworten gezeigt, wie in Abbildung 7 gezeigt.

Abbildung 1. Flussdiagramm der Schritte, die an der Stimulation der phototropes und gravitropen Reaktionen beteiligt sind. (A) Transfer vertikal Sämlinge von verschiedenen Pflanzenhintergründe zu einer Platte gewachsen , aber in getrennten Leitungen. (B) Für phototropism, halten die Platten in Richtung gegenüber einseitigen weißes Licht in einer dunklen Box , die auf einer Seite geöffnet wird. Für Gravitropismus, wickeln Sie zuerst die Platten mit Aluminiumfolie, um 90 ° drehen, und in einen dunklen Kasten (covered von allen Seiten). (C) mit Hilfe eines Scanners, scannen die Platten nach unterschiedlichen Zeitintervallen, wie etwa 1,5 Stunden, 3 Stunden, 6 Stunden und 12 Stunden. (D und E) Diese Tafeln zeigen Datengenerierung aus ImageJ und Datenanalyse Tabellenkalkulationsdateien mit jeweils. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Messung des Biegewinkels von ImageJ. (A) Sehen Sie das Bild J - Programm mit einem Doppelklick. (B) Die Hauptwerkzeuge , die in der Winkelmessung verwendet wurden. (C) Öffnen Sie die Option "Datei" , gefolgt von der Unteroption "offen" in der Bild J Symbolleiste Mikroskopie Bilder zu öffnen , die im JPEG - Dateiformat gespeichert wurden. (D (F) Überblick über die Winkelmessung: abc definiert einen festen A, und der wahre Biegewinkel wird berechnet als B, die auf 180 ° gleich ist - A. (G) , um den Abstand von Punkt A nach Punkt B repräsentiert. (H) Die Kontinuität der Linie ab c Herstellung zu zeigen A. (I) Ergebnisdatei von Bild J zeigt Ein Wert. (J) Repräsentative Tabellenkalkulationsdatei , um die durchschnittliche Biegewinkelmessungen anzeigt, standard Abweichungen, Standardfehler und t-Test-Berechnungen. (K) Balkendiagramm Darstellung der Biegewinkelmessung zwischen zwei verschiedenen Pflanzenhintergründe Col-0 und dsGSL8 EMS - Mutante. Die Fehlerbalken sind SEM (Standardfehler des Mittelwerts +) und *** stellt die Bedeutung von T-Test (p - Wert> 0,001). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Überblick über die Schritte , die in der HPTS Laden Test beteiligt sind. (A) Gremium die Herstellung von HPTS Agaroseblöcken zeigt. (B) Tafel , die die Exzision und Übertragung von Sämlingen und das Laden von HPTS Agaroseblöcken. (C) Das Bedienfeld die Schritte anzeigt , die in der Probe beteiligt sindVorbereitung für die konfokale Abbildung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. Messung der Kallose- Intensität von ImageJ. (A) Sehen Sie das ImageJ Programm durch einen Doppelklick. (B) Die wichtigsten Werkzeuge , die in der Kallose- Intensitätsmessung verwendet wurden. (C) Öffnen Sie die Option "Datei" , gefolgt von der Unteroption "Open" in der ImageJ Symbolleiste Mikroskopie Bilder zu öffnen , die im JPEG - Dateiformat gespeichert wurden. (D) Das rechteckige Symbol auf ImageJ Symbolleiste. (E) Der ausgewählte Bereich des Bildes für die Kallose- Intensität zu analysieren. (F) ImageJ Ergebnisdatei Anzeige des Kallose- Intensitätswert als "Mean". (G)Repräsentative Tabellendatei die durchschnittlichen Kallose- Intensitätsmessungen, Standardabweichungen, Standardfehler und t-Test Berechnungen anzeigt. (H) Balkendiagramm Diagramm , das die Kallose- Intensitätsdifferenz zwischen den beiden Pflanzenhintergründe darstellen. Die Fehlerbalken sind SEM (Standardfehler des Mittelwerts +) und *** stellt die Bedeutung von T-Test (p - Wert> 0,001). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5. Reduktion von AtGSL8 Ausdruck führt Tropic Antworten auf defekt. (A) Phototrope Antwort von dsGSL8 zeigte (± dex) zusammen mit Col-0. (B) Gravitrope Antwort von dsGSL8 gezeigt (± dex) al Ong mit Col-0. dsGSL8 (+ dex) zeigt keine phototrope oder gravitropen Antworten. dsGSL8 (+ dex) und dsGSL8 (-dex) symbolisieren Dexamethason behandelten und unbehandelten dsGSL8 -induzierbaren RNAi Leitungen. Maßstabsbalken entspricht 0,2 cm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6. Die symplasmic Bewegung erhöht nach der Unterdrückung von AtGSL8. Fluoreszenzbilder wurden nach HPTS Laden zu dsGSL8 genommen ± dex Hypokotyls Schnittflächen zusammen mit Wildtyp - Col-0. DsGSL8 (+ dex) zeigte weitergehende Bewegung von HPTS Farbstoff, was zeigt , erhöht symplasmic Bewegung. Maßstabsbalken entspricht 0,2 mm.com / files / ftp_upload / 53513 / 53513fig6large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 7. AtGSL8 unterdrückt Linien zeigten symmetrische PD Kallose- Verteilung zwischen beleuchteten und schattigen Seiten des Hypokotyl. (A) Fluoreszenzbild Anilinblau Kallose- Färbung zeigt für dsGSL8 (-dex) bei 0 h. (B) Fluoreszenzbild Anilinblau Kallose- Färbung zeigt für dsGSL8 (-dex) nach 6 h phototropism. (C) Fluoreszenzbild Anilinblau Kallose- Färbung für dsGSL8 zeigt (+ dex) nach 6 h phototropism. Gelbe Pfeile zeigen die Kallose- Ansammlung auf schraffierten Bereich von Hypokotyl. Maßstabsbalken entspricht 50 & mgr; m. (D) Balkendiagramm , welches die Uhrount von PD Kallose- , die in dsGSL8 (± dex) akkumulierte Hypokotylen vor und nach 3 Stunden und 6 Stunden von phototropism. Die Fluoreszenzintensitäten Brennpunkte von zehn unabhängigen Hypokotylen gemessen wurden (Daten sind Mittelwerte ± SD; Student-t-Test, * p <0,01). Diese Zahl hat sich von geändert worden (Han et al., 2014) ^15. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

In diesem Manuskript, zu screenen, eine Strategie Mutante / Überexpression Linien, die aufgrund veränderter PD phototropes und gravitropen Antworten defekt sind Kallose- und somit PD SEL im Detail beschrieben wird. PD Callose Synthese und Abbau wird hauptsächlich durch Callose Synthasen und β-1,3-Glucanasen erreicht, aber Regulation dieser Enzyme wird von vielen Faktoren stromaufwärts gesteuert. Um solche vorgelagerten Faktoren oder Kandidaten zu suchen, die bei Parkinson-Verordnung unmittelbar beteiligt sind, haben wir diese Methode für das Screening einrichten. Diese Einrichtung hat einige Einschränkungen , wie Mutanten einiger Schlüsselenzyme PD Kallose- Biosynthese regulieren (gsl8) sind tödlich ¹⁵ und solche Mutanten zu sortieren , würde durch diese einrichten begrenzt werden. Auch, wenn der Kandidat-Gen zeigt, schneller oder langsamer Tropic Reaktion zusammen mit offenen oder geschlossenen PD, aber die Callose Pegel bleibt unverändert, so detaillierte Analyse erforderlich ist, um solche weiteren Kandidaten zu charakterisieren. Die kritischen Faktoren und Fehlerbehebung processes in jedem Schritt sind ebenfalls erarbeitet. Zuerst wird in Medium Vorbereitung, ein wichtiger Faktor, der das Pflanzenwachstum beeinflussen kann, ist der pH-Wert der Medien, die 5,7 bis 5,8 liegen sollte. Zweitens ist geeignete Oberflächentrocknung von Agarplatten wichtig; es wäre schwierig, die 3 Tage alte Keimlinge ohne Schaden aus Agar-Platten mit hohem Wassergehalt zu heben. Doch zu viel Trocknung von Agarplatten können einige Risse in den Medien während der Inkubation verursachen und in der asymmetrischen Sämlingwachstum führen. Während der Oberflächensterilisation der Samen Natriumhypochlorit - Lösung verwenden, muss darauf geachtet werden , um Natriumhypochlorit vollständig durch wiederholtes Waschen mit autoklavierten ddH ₂ O zu entfernen, da es ein starkes Bleichmittel ist. Dampfgehärtetem ddH ₂ O aseptisch frisch und behandelt hergestellt werden, wie alte Bestände Pilzbefall in MS - Platten verursachen könnten. Nach der Sterilisation werden Samen durch Kältebehandlung geschichtete Keimung zu synchronisieren. Dieser Prozess kann durch Transferrin durchgeführt, entwederg nasse Samen direkt an einem kalten Raum in dunkler Umgebung oder erste Punktierung die Samen auf MS-Platten sterilisiert und dann die Platten zu einem kalten Raum in dunkler Umgebung zu übertragen. Wir bevorzugen jedoch die letztere, weil es eine gleichförmigere Wachstum von Sämlingen gibt. Während Punktierung Samen, sollte der Abstand zwischen zwei benachbarten Samen mindestens 0,1 cm sein, da sehr eng gepunktete Samen in dem Wachstum von überlappenden seedling führen würde, die sehr schwer in den nachfolgenden Experimenten zu übertragen.

Für die richtige phototropes und gravitropen Antworten, Sämlinge sollten nicht dem Licht ausgesetzt werden und sollte nicht beschädigt werden. Um die Hintergrundeffekte von weißem Licht zu vermeiden, wählen Sie sorgfältig die Sämlinge unter einem grünen Lichtquelle in den dunklen Raum wie Pflanzen reagieren nicht auf grünes Licht. Grüne Lichtquelle kann durch Abdecken der Weißlichtquelle mit transparenten grünen Vinylfolien erzeugt werden. Für die Sämlinge der Auswahl ist ein sterilisierten Zahnstocher die beste Option. Berühren Sie the sehr geringer Teil des Hypokotyls mit dem Zahnstocher die Sämlinge zu heben, so dass sie leicht auf eine neue Platte übertragen werden können. Alle die Sämlinge sollten in Größe und Haken Ausrichtung ähnlich sein. Während unserer Experimente haben wir gesehen, dass, wenn die Hakenrichtung auf der gegenüberliegenden Seite der Lichtquelle ist, Pflanzen eine schnellere Reaktion tropischer als Pflanzen mit der gleichen Hakenrichtung wie die Lichtquelle zeigen. Normalerweise im Fall von phototropism kann man einen deutlichen Unterschied in der Biegewinkel zwischen echten Kandidaten und Col-0 innerhalb von 3 Stunden, während im Fall von Gravitropismus sehen, es in der Regel 6-12 Stunden dauert. Schließlich haben statistisch relevante Daten, ein Minimum von drei Replikaten biologischen und 20 Sämlinge benötigt werden jedes Mal.

Um das Ausmaß der symplasmic Bewegung zwischen verschiedenen Pflanzenhintergründen zu testen, ist HPTS Farbstoffbeladung eine geeignete Technik, da es keine komplizierte Werkzeuge und Instrumente benötigt. Für die HPTS Belastungstest, der Prozentsatz gel in HPTS Agaroseblöcken ist von großer Bedeutung, da ein sehr spröde oder hart Gel nicht optimale Ergebnisse liefern. Es ist besser, einen 50 ml Erlenmeyerkolben mit losen Gummi zu verwenden, und nicht mit 10 ml Wasser zum Sieden Agarose eine großvolumige Kolben zu verwenden. HPTS Agarose-Blöcke können für eine Woche nach der Herstellung verwendet werden, wenn mit einer Aluminiumfolie bei 4 ° C gewickelt gehalten. Ein weiterer wichtiger Faktor bei der HPTS Laden-Test ist die Exzision des Hypokotyls Haken Region. Excision sollte mit scharfen Dissektion Schere und an einer ähnlichen Position für alle die Sämlinge durchgeführt werden. Exzision mit stumpfen Schere können unerwünschte Schäden an Pflanzgut verursachen und HPTS Laden behindern können. Zusätzlich können die Sämlings Wachstumsbedingungen und Entwicklungsstufen könnte eine wichtige Rolle bei der Farbstoffbewegung spielt, wie Callose Akkumulations anfälliger auf solche Änderungen reagieren, die schließlich für die Hinderung der Farbstoffbewegung berücksichtigen. So wird unter optimalen Bedingungen die Keimlinge wachsen notwendig. Kallose bei PD spielt eine Schlüsselrolle in derTropic Antworten etiolierter Sämlinge von PD SEL Regelung, die für Auxin Gradientenbildung ¹⁵ wichtig ist. Kallose Spiegel kann durch Färbung mit Anilinblau oder Immunogoldmarkierung nachgewiesen werden. Die Färbung mit Anilinblau ist ein einfaches und schnelles Verfahren zur Bestimmung der Kallose- Ebene zu erfassen. Da Hypokotyls Zellen hohe Turgordruck und eine Epi-Kutikula-Schicht haben, ist es nicht einfach für den Farbstoff die Zellen eindringen können. Deshalb entwickelten wir die Cut-Färbemethode Anilin blauen Farbstoff zu ermöglichen, leicht zu durchdringen. Es besteht jedoch die Gefahr der Synthese neuer Callose, die die Färbungsergebnisse beeinflussen können, die eine Begrenzung der normalen Callose Färbemethode ist. Zur Vermeidung solcher Effekte wird das Färbungsprotokoll durch Zugabe des Kallose-Synthase-Inhibitor 2-D-deoxy Glukose (DDG) zur Färbepuffers modifiziert. Somit beinhaltet dieses Protokoll, um die Messung der vorbestehenden Callose nur im unteren Bereich des Hypokotyl, die genau unterhalb der Schnittstelle ist. Vermeiden Sie die Verwendung von frisch prepared Anilinblau, und halten Sie vor dem Gebrauch das Anilin-Blau-Lösung bei RT für mindestens 48 Stunden. Wir haben festgestellt, dass mit frischem Anilin-Blau-Lösung Färbung nicht optimal Kallose- Färbeergebnisse nicht geben.

Insgesamt haben wir eine Reihe von Strategien vorgestellt, die durch Veränderung SEL PD durch direkt oder indirekt modulieren PD Kallose- für das schnelle Screening von Mutanten / Überexpression Linien mit einem defekten oder verbesserten tropischen Reaktion verwendet werden kann. Eine frühere Tatsache über Tropic Reaktionen wurde die Wirkung von Auxin Träger- und Signalisierungs Spieler majorly beschränkt, wie PINIOD ^2-14. Darüber hinaus haben wir festgestellt , auch eine kritische Rolle von symplasmic Bewegung von Auxin in ein Auxin Gradienten im Hypocotyl System ¹⁵ aufrechterhalten wird . Die Einfachheit und Vielseitigkeit dieser Methode verstärken zweifellos seine Nützlichkeit Kandidatengene für ihre Regulation von PD SEL bei der Untersuchung, um dadurch eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der Pflanzen spielen, einschließlich Tropic Antworten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt)	Sigma	H1529-1G	Fluorescent dye as symplasmic tracer
LE Agarose	Dongin-Genomic	GEL001-500G	Used for HPTS agarose block
Microwave oven	LG-Goldstar		Machine for boiling agarose gel
100 ml glass conical flask	Dong Kwang	A0205	Used to boil HPTS agarose gel
Petri dish (35 mm x 10 mm)	SPL life sciences	SPL10035	Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples
Microscope cover slides and glass slides (24 mm x 50 mm)	Marienfeld Laboratory Glassware	101222	Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation
MS medium plates 125 mm x 125 mm x 20 mm	SPL life sciences	SPL11125	Plates to make MS agar medium
Scissors	Germany Stainless	HSB 942-11	Used to excise hook region of plant samples
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture	Duchefa	P10453.01	MS medium including vitamins.
(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate	Bioshop	3G30212	To make MS media.
Plant agar	Duchefa	P1001.1000	To solidify MS media.
Autoclave	ALP	CL-40L
Shaker	Wise Mix	SHO-1D	To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way.
1 ml Blue tips	Sorenson	10040
1 ml pipette	BioPette	L-1101-2
Surgical tape	MIcropore	1530-0	To seal the MS plate
Aniline blue (Methyl blue)	Sigma	M5528-25G	Used to prepare aniline blue staining buffer.
Glycine	Bioshop	GLN001	Used to prepare aniline blue staining buffer.
DDG	Sigma	D8375-1G	Used for the inhibition of callose synthases.
Confocal microscope	Olympus	FV1000MPE SIM	To check aniline blue staining and HPTS dye loading result.
Stirrer	I lab	K400	To mix media solution.
Aluminium foil	SW cooking foil		To wrap plates in a dark condition.
Sodium hypochlorite	Samjin Industry		To surface-sterilized seeds