Una strategia per convalidare il ruolo di callose mediata Plasmodesmal gating nella risposta Tropic

Summary

Questo articolo descrive i metodi per lo screening dei geni che controllano la permeabilità plasmodesmal e pendenza, quindi, auxina durante la risposta tropico. Ciò comprende la misurazione del grado di risposta tropico in hypocotyl di Arabidopsis thaliana e controllando la permeabilità plasmodesmal da acido 8-idrossipirene-1,3,6-trisolfonico (HPTS) carico e valutazione del livello di fine callose.

Abstract

L'ormone vegetale auxina gioca un ruolo importante in molti processi di crescita e sviluppo, comprese le risposte tropico alla luce e gravità. La creazione di un gradiente di auxina è un evento chiave che porta a fototropismo e gravitropismo. In precedenza, polare trasporto auxina (PAT) è stato mostrato per stabilire un gradiente di auxina in domini diversi cellulari delle piante. Tuttavia, Han et al. Recentemente dimostrato che per la corretta formazione dell'auxina pendenza, plasmodesmal connettività symplasmic callose mediata tra le celle adiacenti è anche un fattore critico. In questo manoscritto, la strategia per chiarire il ruolo di particolari geni, che possono influenzare fototropismo e gravitropismo alterando la connettività symplasmic attraverso la modulazione sintesi callose plasmodesmal, è discusso. Il primo passo è quello di vagliare le risposte tropicali aberranti da 3 giorni di età piantine eziolati di mutanti o sovra-espressione righe di un gene con il tipo selvatico. Questo screening preliminarepuò portare alla individuazione di una serie di geni che funzionano in PAT o di controllo della connettività symplasmic. La seconda proiezione prevede l'ordinamento dei candidati che mostrano risposte tropicali alterato da influenzare la connettività symplasmic. Per affrontare tali candidati, il movimento di un tracciante symplasmic e la deposizione di callose plasmodesmal stati esaminati. Questa strategia potrebbe essere utile per esplorare nuovi geni candidati che possono regolare la connettività symplasmic direttamente o indirettamente durante risposte tropicali e altri processi di sviluppo.

Introduction

Le piante, come gli organismi viventi sessili, hanno sviluppato una rete altamente sofisticata di cella-a-cella di segnalazione per affrontare i vari stimoli ambientali. risposte Tropic sono uno dei fenomeni con cui le piante rispondono agli stimoli ambientali. Le piante mostrano due principali risposte tropico, fototropismo e gravitropismo. piante fotosintetiche si piegano verso la fonte di luce da fototropismo per raccogliere il massimo di energia. Analogamente, gravitropismo rende le piante a crescere verso il centro di gravità. Il meccanismo fondamentale che porta a tali risposte tropicali comporta la formazione di pendenza asimmetrica del phytohormone auxina ^1. L'atto di formazione dell'auxina gradiente locale è ben caratterizzata; i geni che sono coinvolti in questo meccanismo di fornire una tabella di marcia per l'azione ormonale ^2-8. La posizione specifica dei vettori auxina di efflusso, come ad esempio il PIN-formate (PIN) e P-glicoproteine, esegue il movimento di auxina dal citoplasma alla parete cellulare delle cellule del donatore ^9,10. Fnoltre, dalla H ⁺ / IAA attività symport attiva dei vettori afflusso auxina, come le proteine ​​della famiglia LAX AUX1 /, auxina viene finalmente consegnato alle cellule adiacenti ricevitore ^2,11,12. Questo movimento direzionale di auxina è noto come trasporto auxina polare (PAT). PAT porta ad una distribuzione differenziale auxina durante le varie fasi di sviluppo e in risposta a differenti stimoli ambientali ^13,14. Inoltre, l'interruzione nella localizzazione o l'espressione di uno qualsiasi di questi vettori afflusso o di efflusso auxina porta a gravi alterazioni nel PAT, che causa una perturbazione del gradiente auxina, portando a difetti di sviluppo. Recentemente, Han et al. ha riferito che la regolamentazione plasmodesmal è anche necessario per mantenere il gradiente auxina ^15. Ad oggi, più di 30 proteine ​​plasmodesmal sono state identificate ^16. Tra queste proteine, AtGSL8 'stato segnalato come un enzima chiave per la sintesi callose a plasmodesmi (PD) e, quindi, svolge un ruolo fondamentale nel maintaining il limite PD dimensione di esclusione (SEL). Espressione AtGSL8 repressa ha determinato un modello di auxina gradiente distorto che porta a nessuna risposta tropico in contrasto con piantine di tipo selvatico ^15.

In questo manoscritto, i metodi di esplorare nuovi geni candidati che sono coinvolti nella regolazione PD sono forniti. AtGSL8 stato usato come una proteina modello per testare questi metodi, in quanto è un enzima chiave contribuendo a PD biosintesi callose. A causa della piantina-letalità di gsl8 knock-out mutanti ^17, desametasone (dex) -inducible linee RNAi sono stati utilizzati secondo un rapporto pubblicato in precedenza ^15. La strategia qui fornite può essere adattato a screening geni che sono implicati in risposta hypocotyl tropico controllata da PD SEL.

Protocol

1. Lo screening dei mutanti con Altered fototropico e gravitropica Risposte

1. Preparare 1x Murashige e Skoog (MS) Medium, pH 5.7, con il 0,8% Agar Un giorno prima dell'esperimento.
   1. Aggiungere 800 ml di acqua bidistillata in una beuta da 2 L e mescolare con una barra magnetica.
   2. Aggiungere 4,4 g di sale MS al pallone conico.
   3. Aggiungere 0,5 g di 2- (N-morfolino) etano solfonico (MES) e agitare fino a quando tutti i sali sono completamente disciolti.
   4. Regolare il pH del mezzo a 5,7 con 1 M KOH.
   5. Trasferire il mezzo per un cilindro di massa e portare il volume finale a 1 L con DDH ₂ O.
   6. Versare di nuovo il supporto in una beuta 2 L e aggiungere 8 g di agar impianto.
   7. Avvolgere la bocca della beuta ermeticamente con un foglio di alluminio.
   8. Autoclavare il mezzo MS e DDH ₂ O per 15 min a 121 ° C, 15 psi, e dopo autoclavaggio, tenere il mezzo in un incubatore a 60 ° e la DDH ₂ O a RT.
   9. Dopo raffreddamento a 60 ° C, versare il terreno in 125 x 125 x 20 mm ³ piastre quadrate su un banco a flusso laminare (50 ml in ciascuna piastra).
   10. Lasciare che l'agar solidificare a temperatura ambiente per circa 1 ora, mantenendo le piastre parzialmente aperta. Se i piatti non vengono utilizzati immediatamente, sigillarli utilizzando pellicola trasparente e conservare a 4 ° C in frigorifero.
2. Surface-sterilizzare i semi con ipoclorito di sodio 1,1% e punteggiano i semi su piastre di agar 1x SM che sono stati preparati nel paragrafo 1.1.
   Nota: Qui, Arabidopsis thaliana {Col-0 seeds, dsGSL8 (Col-0)} ¹⁵ vengono utilizzati per la risposta tropico, callose colorazione e HPTS carico Arabidopsis thaliana {Col-0 e dsGSL8 (Col-0) EMS mutante} semi (. non pubblicato) sono utilizzati per la risposta tropico in figura 2.
   1. Autoclave 300 ml di DDH ₂ O in una bottiglia.
   2. Aggiungere circa un centinaio di semi per ciascun fondo, cioè,mutante / linea sovra-espressione e wild type (Col-0) semi, in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
   3. Estrarre piastre 1x MS agar da un frigorifero a 4 ° C e asciugarli su un banco a flusso laminare in una posizione parzialmente aperta.
   4. Surface-sterilizzare i semi aggiungendo 1 ml di una soluzione 0.2x candeggiante (1,1% di sodio ipoclorito) e mantenere le provette da microcentrifuga su agitatore a 250 rpm per 5 min.
   5. Lasciate che i semi si depositano sul fondo per gravità e quindi rimuovere la soluzione di candeggina per micropipetta.
   6. Aggiungere 1 ml di DDH fresco ₂ O (autoclavato) per i semi e mescolare bene invertendo la provetta diverse volte. Lasciate che i semi di stabilirsi di nuovo e poi rimuovere l'acqua.
   7. Ripetere il punto 1.2.6 5-6 volte.
   8. Aggiungere il doppio della quantità di acqua al volume dei semi che sono stati lasciati dopo il lavaggio finale.
   9. Dot i semi sterilizzati su un 1x MS piastra di agar semi-secco con una punta di 1 ml micropipetta contenente 200 ml di semi (inacqua cluding).
      1. Mantenere una distanza di circa 0,1 centimetri tra due semi e un minimo di 1,8 cm tra due file di semi. Dot i semi in cinque file orizzontali per piastra quadrata (125 x 125 x 20 mm ^3). Lasciare l'acqua si asciughi un po 'prima di mettere il coperchio sulla piastra.
   10. Sigillare le piastre con nastro chirurgico, impilare tutti i piatti in verticale, e avvolgere con un foglio di alluminio.
   11. Trasferire le piastre avvolte ad una scatola buia (senza accesso alla luce). Quindi, conservare la scatola buio in un 4 ° C camera / frigorifero per 3 giorni.
   12. A partire da questa fase, mantenere la direzione di piastre invariato. Dopo 3 giorni di trattamento a freddo, conservare la scatola buia in una stanza cultura impianto a 22 ° C per i prossimi 3 giorni. Dopo 3 giorni, controllare lo stato di germinazione dei semi sotto la luce verde in una stanza buia.
       NOTA: solitamente 3 giorni di età Col-0 piantine eziolati possono crescere fino a 1,6 cm di lunghezza.
3. Analizzare l'un fototropico alteratand risposta gravitropica in mutanti o sovra-espressione righe di un gene specifico. Selezionare piantine rette solo di dimensioni simili e verticalmente coltivate in luce verde in una stanza buia. Trasferimento piantine selezionate ad una piastra di agar 1x MS fresco usando la punta di uno stuzzicadenti sterilizzato.
   1. selezionare delicatamente le piantine dalla parte più bassa della loro hypocotyl senza toccare altre parti. Assicurarsi che tutte le piantine hanno lo stesso orientamento cotiledone / gancio, e dopo il trasferimento, che l'orientamento di ganci piantine rimangono gli stessi. Utilizzare un minimo di 20 piantine di ciascun background in ogni riga e un minimo di due piastre per ciascun punto di tempo per ulteriori analisi.
      Nota: Quattro ambiti diversi possono essere confrontati in ciascun piatto (4 righe).
      Opzionale: Durante l'utilizzo di desametasone (dex) -inducible / over-espressione linee RNAi, trasferire le piantine di cui sopra per un 1x MS piastra lungo con la piastra di SM + dex (piatto contenente 1x MS, 0,8% agar integrato con 20 mM dex) FOR 3 ore e mantenere le piastre verticalmente in scatola buia.
   2. Per controllare la risposta fototropico, trasferire i piatti di cui sopra in verticale per una scatola nera con un solo lato aperto. Trasferire la scatola nera contenente le piastre di una camera di crescita delle piante con la luce bianca unilaterale. Per garantire luminosi unilaterali, posizionare il bordo della piastra verso la sorgente luminosa (non il lato anteriore). Fare riferimento alla configurazione in Figura 1.
   3. Allo stesso modo, per controllare la risposta gravitropica, tenere le piastre con piantine trasferiti verticali, e coprire con un foglio di alluminio. Successivamente, modificare l'orientamento piatto verticale a 90 ° e tenerlo dentro la scatola nera coperto da tutti i lati. Fare riferimento alla configurazione in Figura 1.
   4. Dopo che i dati punti di tempo, (di solito 1,5 ore, 3 ore, 6 ore e 12 ore) la scansione delle piastre con uno scanner, e salvare le immagini in formato JPEG.
   5. Misurare l'angolo di piegatura delle piantine utilizzando il software ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (Figure 2).
      1. Avviare il programma ImageJ facendo doppio clic (Figura 2A).
         Nota: I principali strumenti che sono stati utilizzati nella misurazione dell'angolo sono mostrati in Figura 2B.
      2. Selezionare l'opzione "file" seguito da sub-opzione "aperto" nella barra degli strumenti ImageJ, e le pagine aperte salvate in formato JPEG per misurare l'angolo di flessione tropico (Figura 2C).
      3. Fare clic sullo strumento di ingrandimento per ingrandire o ridurre l'immagine, cliccando con il tasto sinistro o destro del mouse, rispettivamente, come mostrato nella figura 2B.
      4. Fare clic sullo strumento di scorrimento per trascinare e posizionare l'immagine (Figura 2D) .Next, fare clic sullo strumento angolazione per misurare l'angolo di flessione (Figura 2E).
         1. Fare un doppio click sinistro sul hypocotyl originale crescente punto di direzione 'a', trascinare il mouse fino al punto di flessione iniziazione 'b' (Figura 2F), e fare clic su calcio sinistrasu per disegnare la prima linea (Figura 2G).
         2. Trascinare il mouse dal punto B al punto finale di flessione 'c', e fare clic sul pulsante sinistro per disegnare la seconda linea (Figura 2H) e formare una fissa A. Nota: Il vero angolo di curvatura è B, che è pari a 180 ° - A. (Figura 2F).
         3. Misurare e registrare Un premendo 'M' sulla tastiera. Il file risultato viene aperto separatamente come mostrato nella Figura 2I. Misurare e registrare tutte le piantine uno per uno. Ad esempio, prima di misurare l'angolo di flessione per tutti gli ipocotili di Col-0 e poi per linee mutanti.
   6. Trasferire il set di dati da ImageJ a file di foglio di calcolo per rendere l'average di piegare gli angoli di ciascun fondo.
   7. Per l'analisi quantitativa, fare un diagramma grafico a barre con i risultati dei test statistici, tra cui le barre di errore standard e valori di probabilità (vedi figura 2).
      1. Calcolare il vero flessione B, e progettare una formula utilizzando fogli di calcolo, vale a dire, B = 180 ° - Una nota: A è il valore che è stato derivato dall'analisi ImageJ.
      2. Misurare l'angolo di curvatura media B per ogni sfondo utilizzando strumenti di fogli di calcolo (Figura 2J).
      3. Analizzare la deviazione standard tra le repliche per ogni misurazione utilizzando il foglio di calcolo strumento di "formule" (Figura 2J).
      4. Testare il significance dei risultati applicando un t-test per l'angolo medio di curvatura e valori di deviazione standard calcolato come sopra indicato.
      5. Disegnare un diagramma a barre utilizzando i valori di cui sopra per rappresentare graficamente la differenza quantitativa in angolo di curvatura tra due ambienti diversi utilizzando il foglio di calcolo strumento "inserto" (Figura 2K).
         Nota: Mutant / over-espressione di linee di forti geni candidati avrebbe mostrato evidenti differenze rispetto al wild type, come l'assenza di flessione, veloce o lento flessione flessione.

2. Linee schermo piante con difettoso Tropic risposte dovute al mutamento di PD SEL con un Altered PD callose Livello

1. Eseguire un test Caricamento hypocotyl da 8-idrossipirene-1,3,6-trisolfonico acido (HPTS) Dye carico sulla cima di piantine con HPTS blocchi agarosio e confronta il Movimento di Dye Tra Mutant / sovra-espressione Linee e Col-0.
   1. Preparare HPTS AgaroBlocchi SE per il dosaggio hypocotyl carico.
      1. Prelevare 10 ml di DDH ₂ O in una beuta da 50 ml e aggiungere 0,1 g di agarosio per preparare un gel di agarosio 1%. Far bollire l'agarosio in un forno a microonde per 1-2 minuti con agitazione intermittente, e lasciarlo raffreddare per 5 minuti.
      2. Aggiungere 50 mg di HPTS a 10 ml di soluzione di agarosio 1%, e mescolare bene fino a quando la soluzione diventa verde.
      3. Versare il composto sopra per da 10 mm piastra di Petri, e lasciarlo solidificare per 15 min.
      4. Tagliare le HPTS solidificati agarosio con una lama affilata dissezione per fare blocchi agarosio piccoli (0,5 x 2 cm ^2).
   2. Preparare campioni di piante per il saggio dye-caricamento HPTS.
      1. Impostare una piattaforma per il saggio HPTS tintura di carico; posizionare un vetrino da microscopio coperchio (24 x 50 mm ²⁾ su una nuova piastra substrato MS, come mostrato nella Figura 3A.
      2. Accise tre giorni di età piantine eziolati dalla base del gancio con una forbice chirurgica tagliente.
      3. Subitotrasferire le piantine sopra (un minimo di 5 piantine da ciascuna sfondo) alla superficie di un vetro di copertura microscopica in modo tale che solo 0,5 cm di dell'ipocotilo dalla posizione escissione dovrebbero rimanere sul vetrino di copertura, e il resto dell'ipocotilo deve toccare il mezzo come mostrato nella Figura 3B.
      4. Posizionare il blocco di agarosio HPTS sopra dell'ipocotilo (con un gancio di asportato) per 5 minuti in modo tale che l'area asportato tocca il blocco di agarosio HPTS.
      5. Dopo 5 minuti di carico, rimuovere il blocco di agarosio dalla superficie hypocotyl, trasferire i ipocotili alla piastra Petri 10 millimetri contenente DDH ₂ O e lavare ipocotili in DDH ₂ O per 15 minuti con agitazione continua.
   3. Preparare i campioni per microscopia confocale.
      1. Selezionare un minimo di 5 piantine da ciascuna sfondo per l'osservazione al microscopio confocale a scansione laser.
      2. Nel canale laser, impostare la lunghezza d'onda di 488 nm per specifica excitazione 500 al 550 nm per l'emissione passa-banda.
      3. Piantine di trasferimento in 2 set (uno Col-0 + un mutante) a una nuova diapositiva microscopica dopo il lavaggio con DDH ₂ O. Aggiungere 100-150 ml di acqua bidistillata alla diapositiva, e coprire con un vetrino di copertura. Spostare il vetrino sul palco del microscopio confocale.
      4. Mettere a fuoco la regione ipocotile (con una lente obiettivo 20X o 40X) con campo chiaro di illuminazione (luce bianca). Poi, la scansione delle diapositive per fluorescenza.
      5. Prendere immagini per un minimo di 10 insiemi, e confrontare i due sfondi controllando il grado di movimento colorante dal punto di carico.
         Nota: linee mutanti / sovra-espressione con il movimento symplasmic alterato mostrerà diversi modelli di tintura di carico rispetto al wild type Col-0.
2. Analizzare il livello callose in Mutant / sovra-espressione Lines Visualizzazione Altered Phototropic e gravitropica risposta e mostrando distinto HPTS Dye Movimento Compared al Col-0.
   1. Preparare anilina colorante blu callose colorazione.
      1. Fare 1 M glicina, pH 9,5 e lo 0,1% (p / v) di anilina blu in autoclave DDH ₂ O.
      2. Rendere il buffer di colorazione mescolando 0,1% blu anilina e 1 M glicina in 2: 3 rapporti di volume. Ad esempio, per 50 ml di tampone colorazione, prendere 20 ml di 0,1% blu di anilina e 30 ml di 1 M glicina. Nota: verificare la colorazione buffer di un minimo di 48 ore prima dell'uso e conservarlo al buio.
   2. Stain piegato o piantine con anilina colorante blu-specific callose non piegato.
      1. Per inibire l'novo callose sintesi de durante il processo di colorazione, aggiungere il volume finale di 1,5 mM 2-deossi-D-glucosio (DDG) a 50 ml di tampone colorazione.
      2. Prendere 3-giorni di età piantine eziolati per callose colorazione (con o senza risposta tropico).
      3. Tagliare le piantine da loro regione gancio con le forbici chirurgiche sottili.
      4. Trasferire le piantine in una piccola scatola di Petri contienezione 2 ml di tampone di colorazione utilizzando la punta di uno stuzzicadenti.
      5. Incubare le piantine con buffer di colorazione al buio per 2 ore con agitazione continuo a 30 giri al minuto.
      6. Dopo la colorazione, lavare le piantine con DDH ₂ O per 2 minuti per rimuovere buffer di colorazione in eccesso.
      7. Selezionare un minimo di 5 piantine per ogni impianto di fondo per l'osservazione al microscopio confocale a scansione laser.
   3. Preparare i campioni per la microscopia confocale:
      1. Trasferire le piantine in set (uno Col-0 + un mutante) per pulire la vetrini da microscopio dopo il lavaggio con DDH ₂ O.
      2. Aggiungere 100-150 ml di DDH ₂ O e coprire con un vetrino di copertura. Spostare il vetrino sul palco del microscopio confocale.
      3. In un canale laser, impostare la lunghezza d'onda di 405 nm per specifiche di eccitazione 500 a 550 nm di emissione per l'imaging del blu di anilina fluorescenza.
      4. Portare la regione hypocotyl a fuoco, prima con 10X e in ritardoR con 20X o 40X lenti dell'obiettivo utilizzando in campo chiaro (luce bianca) illuminazione.
      5. Poi, accendere luce filtrata, scansione le diapositive per la fluorescenza, e salvare le immagini.
      6. Misurare l'intensità del segnale callose con il software ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (vedi figura 4).
         1. Modificare il formato di immagini di microscopia confocale Olympus immagine in formato binario (* .oib) in formato JPEG. Nota: solo il formato JPEG è supportato dal software ImageJ.
         2. Avviare il programma ImageJ facendo doppio clic (Figura 4A). Nota: Le frecce indicano lo strumento rettangolo da utilizzare nella misurazione dell'intensità callose (Figura 4B).
         3. Selezionare l'opzione "file" seguito dal sub-opzione "aperto" nella barra degli strumenti ImageJ, e le pagine aperte di microscopia che sono stati salvati in formato JPEG per misurare l'intensità callose (Figura 4C).
         4. Fare clic sull'icona rettangolare sul ImaBarra degli strumenti ġej (Figura 4D).
         5. Per analizzare l'intensità del segnale, trascinare il cursore sopra l'immagine e selezionare l'area da esaminare (Figura 4E)
         6. Misurare e registrare i valori numerici per l'intensità del segnale premendo 'M' sulla tastiera (Figura 4E). Nota: Il file risultato si aprirà separatamente (Figura 4F).
         7. Misurare e registrare l'intensità valori uno ad uno per tutte le piantine da ciascun sfondo pianta.
            Nota: in ImageJ, il file dei risultati "Mean" indica l'intensità del "Area" selezionato segnale.
      7. Copiare i valori medi dal file risultato ImageJ, e incollarlo nel file di foglio di calcolo per l'analisi quantitativa.
      8. Per l'analisi quantitativa, fare un diagramma grafico a barre con test statistici, tra cui le barre di errore standard e valori di probabilità (Figura 4).
         1. Misurare l'intensità media del segnale(media da ImageJ) per ogni sfondo utilizzando il foglio di calcolo strumento di "formule" (Figura 4G).
         2. Analizzare la deviazione standard tra le repliche per ogni misurazione utilizzando il foglio di calcolo strumento di "formule" (Figura 4G).
         3. Calcolare l'errore standard (SE) utilizzando thespreadsheet funzione "formule".
            Nota: SE = s / √ n, dove (s) è la deviazione standard della popolazione, e (n) è la dimensione (numero di osservazioni) del campione.
         4. Testare il significato dei risultati applicando un t-test per l'intensità media del segnale e valori di errore standard calcolato come sopra indicato.
         5. Disegnare un diagramma grafico a barre utilizzando i valori di cui sopra per rappresentare graficamente la differenza quantitativa del livello callose tra due ambienti diversi utilizzando il foglio di calcolo strumento "inserto" (Figura 4H).
            Nota: linee mutanti / sovra-espressione di candidati forte volontà scome i diversi livelli di callose rispetto al tipo selvaggio, come l'assenza di callose, poco callose o l'accumulo PD callose iper.

Representative Results

Nella configurazione attuale, desametasone (dex) -inducible linee RNAi di AtGSL8 [d'ora in poi dsGSL8 (+ dex / -dex)] sono stati utilizzati, come omozigote gsl8 mutanti di inserzione T-DNA sono piantina letale ^18. Tre giorni di età piantine eziolati di dsGSL8 e piantine wild type con Dex ± sono stati esposti a stimoli fototropiche e gravitropica. Abbiamo scoperto che dsGSL8 (+ DEX) piantine erano difettose in fototropismo e gravitropismo ^15. Figura 5 mostra chiaramente che dsGSL8 (+ dex) presenta alcuna flessione sotto l'influenza di entrambi fototropismo e gravitropismo. Inoltre, l'alterazione in movimento symplasmic a dsGSL8 (+ dex) e dsGSL8 (-dex) o Col-0 è stato analizzato da un test di carico HPTS. In linea con la nostra scoperta precedente, il movimento HPTS tintura a dsGSL8 (+ dex) era notevolmente più ampio rispetto a dsGSL8 (-dex) o Col-0, Figura 6. callose è uno dei regolatori chiave di PD SEL e AtGSL8 è noto come un PD callose sintasi ^16. Inoltre, callose blu di anilina colorazione è stata effettuata, e dsGSL8 (+ dex) hanno mostrato un livello persistentemente callose basso PD prima e dopo risposte tropico, come mostrato nella Figura 7.

Figura 1. Diagramma di flusso dei passaggi che sono coinvolti nella stimolazione di risposte fototropiche e gravitropica. (A) Trasferimento cresciuti verticalmente piantine di diversa provenienza della pianta per un piatto ma in linee separate. (B) Per phototropism, mantenere le piastre affacciate verso la luce bianca unilaterale in una scatola scura che si apre su un lato. Per gravitropismo, prima avvolgere le piastre con un foglio di alluminio, ruotare di 90 °, e il trasferimento ad una scatola scura (covered da tutti i lati). (C) Utilizzando uno scanner, la scansione delle piastre dopo diversi intervalli di tempo, come ad esempio 1,5 ore, 3 ore, 6 ore e 12 ore. (D ed E) Questi pannelli mostrano la generazione di dati da ImageJ e analisi dei dati utilizzando i file di fogli di calcolo, rispettivamente. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Misura dell'angolo di piega da ImageJ. (A) vedere l'immagine del programma J con un doppio clic. (B) I principali strumenti che sono stati utilizzati nella misurazione dell'angolo. (C) Aprire l'opzione "File", seguito dal sub-opzione "aperto" a immagine J barra degli strumenti per aprire le immagini di microscopia che sono stati salvati in formato JPEG. (D (F) Schema della misurazione dell'angolo: ABC definisce una fissa A, e l'angolo vero curvatura è calcolato come B, che è pari a 180 ° - A. (G) Linea rappresenta la distanza dal punto A al punto b. (H) La continuità della linea AB al punto c making A. (I) File Risultato di immagine J mostra Un valore. (J) foglio di calcolo Rappresentante visualizzazione delle misurazioni medie angolo di curvatura, standeviazioni Dard errori standard e calcoli t-test. (K) Bar schema grafico che visualizza le misure di angolo di curvatura tra due diversi ambiti di piante Col-0 e mutanti dsGSL8 SME. Le barre di errore sono SEM (errore standard della media +) e *** rappresenta il significato da T-test (valore p> 0,001). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Schema dei passi che sono coinvolti nel test di carico HPTS. (A) del pannello che mostra la preparazione dei blocchi agarosio HPTS. (B) del pannello che rappresenta l'escissione e il trasferimento delle piantine e il caricamento dei blocchi agarosio HPTS. (C) del pannello che visualizza i passi che sono coinvolti nel campionela preparazione per l'imaging confocale. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Misura dell'intensità callose da ImageJ. (A) Visualizza il programma ImageJ con un doppio clic. (B) I principali strumenti che sono stati utilizzati nella misurazione dell'intensità callose. (C) Aprire l'opzione "File", seguito dal sub-opzione "aperto" nella barra degli strumenti ImageJ per aprire le immagini di microscopia che sono stati salvati in formato JPEG. (D) L'icona rettangolare nella barra degli strumenti ImageJ. (E) L'area selezionata dell'immagine per analizzare l'intensità callose. (F) ImageJ file dei risultati che visualizza il valore di intensità callose come "Mean". (G)file di foglio rappresentante la visualizzazione delle misurazioni medie callose intensità, deviazioni standard, errori standard e calcoli t-test. Diagramma grafico (H) Bar che rappresenta la differenza di intensità callose tra i due ambiti di provenienza della pianta. Le barre di errore sono SEM (errore standard della media +) e *** rappresenta il significato da T-test (valore p> 0,001). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Riduzione di espressione AtGSL8 porta a difettosi risposte tropicali. (A) risposta Phototropic mostrato da dsGSL8 (± dex) insieme a Col-0. (B) risposta gravitropica mostrato da dsGSL8 (± dex) al ong con Col-0. dsGSL8 (+ dex) non mostra le risposte fototropiche o gravitropica. dsGSL8 (+ dex) e dsGSL8 (-dex) simboleggiano desametasone e non trattata dsGSL8 linee RNAi -inducible, rispettivamente. Barra di scala rappresenta 0,2 cm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6. Il movimento symplasmic aumentato dopo la soppressione di AtGSL8. Immagini di fluorescenza sono state scattate dopo HPTS carico di dsGSL8 ± superfici Dex hypocotyl tagliare lungo con wild type Col-0. DsGSL8 (+ dex) ha mostrato una più ampia circolazione di tintura HPTS, dimostrando aumentato il movimento symplasmic. Barra di scala rappresenta 0,2 mm.com / file / ftp_upload / 53513 / 53513fig6large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7. AtGSL8 linee soppresse hanno mostrato una distribuzione simmetrica PD callose tra i lati illuminati e ombreggiati del dell'ipocotilo. (A) immagine di fluorescenza che mostra anilina colorazione blu callose per dsGSL8 (-dex) a 0 ore. Immagine (B) fluorescenza che mostra di anilina colorazione blu callose per dsGSL8 (-dex) dopo 6 ore di fototropismo. (C) fluorescenza immagine che mostra anilina colorazione blu callose per dsGSL8 (+ dex) dopo 6 ore di fototropismo. Le frecce gialle indicano l'accumulo callose sulla regione ombreggiata del dell'ipocotilo. barra della scala rappresenta 50 micron. (D) Bar schema grafico che rappresenta l'amount di callose PD che si sono accumulati in dsGSL8 (± dex) ipocotili prima e dopo 3 ore e 6 ore di fototropismo. intensità foci di fluorescenza sono stati misurati da dieci ipocotili indipendenti (i dati sono media ± SD; test t, * p <0.01). Questo dato è stato modificato da (Han et al., 2014) ^15. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

In questo manoscritto, una strategia per lo screening linee mutanti / sovra-espressione che sono difettosi nelle risposte fototropiche e gravitropica a causa di alterata callose PD e, di conseguenza, PD SEL è descritto in dettaglio. sintesi callose PD e la degradazione avviene principalmente da sintasi callose e β-1,3-glucanasi, ma regolazione di questi enzimi è controllata da molti fattori a monte. Per verificare tali fattori a monte o candidati che sono direttamente coinvolti nella regolazione del PD, abbiamo creato questo metodo per lo screening. Questo set up ha alcune limitazioni come mutanti di alcuni enzimi chiave che regolano PD callose biosintesi (gsl8) sono letali ¹⁵ e di risolvere tali mutanti sarebbero limitati da questo set up. Inoltre, se il gene candidato mostra velocemente o più lentamente risposta tropico insieme PD aperta o chiusa, ma il livello callose rimane invariato, quindi analisi dettagliata è necessaria per caratterizzare ulteriormente tali candidati. I fattori critici e di risoluzione dei problemi proceSSES in ogni fase sono anche elaborato. Innanzitutto, in preparazione media, un fattore critico che può influenzare la crescita delle piante è il pH dei media, che dovrebbe variare da 5.7-5.8. In secondo luogo, adeguato essiccazione superficiale di piastre di agar è importante; sarebbe difficile sollevare i tre giorni piantine che senza alcun danno da piastre di agar con elevato contenuto di acqua. Tuttavia, troppo essiccazione di piastre di agar può causare alcune crepe nei media durante l'incubazione e il risultato in crescita delle piantine asimmetrica. Durante la sterilizzazione superficiale di semi utilizzando soluzione di ipoclorito di sodio, bisogna fare attenzione per rimuovere ipoclorito di sodio completamente mediante lavaggio ripetuto con DDH autoclavato ₂ O, in quanto è un forte agente sbiancante. Autoclavato DDH ₂ O deve essere preparata al momento e gestito in modo asettico, come vecchie scorte potrebbero causare la contaminazione da funghi in lastre MS. Dopo la sterilizzazione, i semi sono stratificati per il trattamento a freddo per sincronizzare la germinazione. Questo processo può essere eseguito mediante transferrinag sterilizzato semi bagnati direttamente in una stanza fredda in condizioni di buio o prima che punteggiano i semi su piastre MS e poi trasferire le piastre in una stanza fredda in condizioni di oscurità. Tuttavia, noi preferiamo quest'ultimo perché dà una crescita più uniforme delle piantine. Mentre punteggiano semi, la distanza tra due semi adiacenti deve essere almeno di 0,1 cm perché semi strettamente punteggiate comporterebbe la crescita di sovrapposizione piantina, che sono molto difficili da trasferire in successivi esperimenti.

Per una corretta risposte fototropiche e gravitropica, piante non dovrebbero essere esposti alla luce e devono rimanere integri. Per evitare gli effetti di luce bianca sfondo, selezionare con cura le piantine sotto una fonte di luce verde in camera oscura come le piante non rispondono alla luce verde. sorgente di luce verde può essere generato coprendo la fonte di luce bianca con trasparenti fogli vinile verde. Per selezionare le piantine, uno stuzzicadenti sterilizzato è l'opzione migliore. touch the parte molto bassa dell'ipocotilo con stuzzicadenti per sollevare le piantine in modo che possano essere facilmente trasferiti ad una nuova piastra. Tutte le piantine devono essere simili in termini di dimensioni e l'orientamento del gancio. Durante i nostri esperimenti, abbiamo visto che se la direzione del gancio si trova sul lato opposto della sorgente luminosa, piante mostrano una risposta più veloce tropico di piante con la stessa direzione del gancio come la sorgente luminosa. Normalmente, nel caso di phototropism, si può vedere una chiara differenza dell'angolo di flessione tra i veri candidati e Col-0 entro 3 ore, mentre nel caso di gravitropismo, richiede solitamente 6-12 ore. Infine, per avere dati statisticamente rilevanti, un minimo di tre repliche biologiche e 20 piantine sono necessari ogni volta.

Per testare il grado di movimento symplasmic tra diversi sfondi vegetali, HPTS colorante di caricamento è una tecnica conveniente, in quanto non necessita di strumenti sofisticati e strumentazione. Per il saggio di carico HPTS, la percentuale di gel in HPTS blocchi agarosio è di grande importanza, come un gel molto fragile o duro non darà risultati ottimali. È preferibile utilizzare una beuta da 50 ml di gomma sciolto e non utilizzare un matraccio di grande volume per bollire agarosio con 10 ml di acqua. blocchi agarosio HPTS possono essere usate per una settimana dopo la preparazione se conservato avvolto con un foglio di alluminio a 4 ° C. Un altro fattore chiave nel test di carico HPTS è l'escissione della regione gancio dell'ipocotilo. Escissione deve essere effettuata con forbici dissezione affilate e in una posizione simile per tutte le piantine. L'escissione con le forbici spuntate può causare danni indesiderati per piantine e può ostacolare HPTS carico. Inoltre, le condizioni di crescita piantina e le fasi di sviluppo potrebbe svolgere un ruolo cruciale nel movimento di tintura, come l'accumulo di callosio è più incline a rispondere a tali cambiamenti, che alla fine rappresentano l'ostacolo in movimento di tintura. Così, crescendo le piantine in condizioni ottimali è necessario. Callose al PD gioca un ruolo chiave nellarisposte tropico di piantine eziolati regolando PD SEL, che è importante per l'auxina formazione di pendenze ^15. livelli callose possono essere rilevati con la colorazione blu o etichettatura immunogold anilina. Colorazione con blu di anilina è un metodo semplice e rapido per rilevare il livello callose. Poiché le cellule ipocotile hanno alta pressione turgore ed uno strato epi-cuticola, non è facile per il colorante di penetrare nelle cellule. Pertanto, abbiamo sviluppato il metodo cut-colorazione per consentire colorante blu di anilina di penetrare facilmente. Tuttavia, vi è il rischio di sintesi di nuovo callose che possono influenzare i risultati della colorazione, che è una limitazione del metodo normale callose colorazione. Per evitare tali effetti, il protocollo di colorazione viene modificato aggiungendo l'inibitore sintasi callose glucosio 2-D-desossi (DDG) al buffer di colorazione. Così, questo protocollo prevede la misura callose preesistente solo nella regione inferiore dell'ipocotilo è esattamente sotto il sito di taglio. Evitare l'uso di prepar frescoed blu di anilina, e mantenere la soluzione di blu di anilina a temperatura ambiente per almeno 48 ore prima dell'uso. Abbiamo notato che la colorazione con anilina fresca soluzione blu non dà risultati ottimali callose di colorazione.

Nel complesso, abbiamo presentato una serie di strategie che possono essere utilizzati per lo screening rapido di mutanti / linee sovraespressione con una risposta tropico difettoso o migliorata modificando PD SEL modulando direttamente o indirettamente callose PD. Un fatto in precedenza circa le risposte tropicali è stato majorly limitato all'azione dei vettori auxina e giocatori di segnalazione, come PINIOD ^2-14. Inoltre, abbiamo anche istituito un ruolo critico di movimento symplasmic dell'auxina nel mantenere un gradiente di auxina nel sistema hypocotyl ^15. La semplicità e la versatilità di questo metodo senza dubbio rafforzare la sua utilità nelle indagini geni candidati per la loro regolazione del PD SEL, giocando così un ruolo fondamentale nello sviluppo delle piante, comprese le risposte tropicali.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt)	Sigma	H1529-1G	Fluorescent dye as symplasmic tracer
LE Agarose	Dongin-Genomic	GEL001-500G	Used for HPTS agarose block
Microwave oven	LG-Goldstar		Machine for boiling agarose gel
100 ml glass conical flask	Dong Kwang	A0205	Used to boil HPTS agarose gel
Petri dish (35 mm x 10 mm)	SPL life sciences	SPL10035	Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples
Microscope cover slides and glass slides (24 mm x 50 mm)	Marienfeld Laboratory Glassware	101222	Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation
MS medium plates 125 mm x 125 mm x 20 mm	SPL life sciences	SPL11125	Plates to make MS agar medium
Scissors	Germany Stainless	HSB 942-11	Used to excise hook region of plant samples
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture	Duchefa	P10453.01	MS medium including vitamins.
(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate	Bioshop	3G30212	To make MS media.
Plant agar	Duchefa	P1001.1000	To solidify MS media.
Autoclave	ALP	CL-40L
Shaker	Wise Mix	SHO-1D	To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way.
1 ml Blue tips	Sorenson	10040
1 ml pipette	BioPette	L-1101-2
Surgical tape	MIcropore	1530-0	To seal the MS plate
Aniline blue (Methyl blue)	Sigma	M5528-25G	Used to prepare aniline blue staining buffer.
Glycine	Bioshop	GLN001	Used to prepare aniline blue staining buffer.
DDG	Sigma	D8375-1G	Used for the inhibition of callose synthases.
Confocal microscope	Olympus	FV1000MPE SIM	To check aniline blue staining and HPTS dye loading result.
Stirrer	I lab	K400	To mix media solution.
Aluminium foil	SW cooking foil		To wrap plates in a dark condition.
Sodium hypochlorite	Samjin Industry		To surface-sterilized seeds