Une stratégie pour valider le rôle des Callose médiée Plasmodesmal Gating dans la réponse Tropic

Summary

Cet article décrit les méthodes de criblage des gènes contrôlant la perméabilité plasmodesmal et gradient donc auxine pendant la réponse tropique. Cela inclut la mesure du degré de réponse à tropisme hypocotyle d'Arabidopsis thaliana et de vérifier la perméabilité plasmodesmal par l' acide 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonique (HPTS) le chargement et l' évaluation du niveau finalement callose.

Abstract

L'auxine hormone végétale joue un rôle important dans de nombreux processus de croissance et de développement, y compris les réponses tropique à la lumière et la gravité. La mise en place d'un gradient d'auxine est un événement clé menant à phototropisme et gravitropisme. Auparavant, polaire transport de l'auxine (PAT) a été montré pour établir un gradient de auxine dans différents domaines cellulaires des plantes. Cependant, Han et al. , A récemment démontré que , pour la bonne formation du gradient de l' auxine, la connectivité plasmodesmal symplasmique callose à médiation entre les cellules adjacentes est également un facteur critique. Dans ce manuscrit, la stratégie visant à élucider le rôle des gènes particuliers, qui peuvent affecter phototropisme et gravitropisme en modifiant la connectivité symplasmique grâce à la modulation de la synthèse callose plasmodesmal, est discuté. La première étape consiste à filtrer les réponses tropique aberrantes de 3 jours-vieux plants étiolés de mutants ou surexpression lignes d'un gène ainsi que le type sauvage. Cet examen préliminairepeut conduire à l'identification d'une série de gènes fonctionnant en PAT ou contrôlant la connectivité symplasmique. La deuxième sélection comprend le tri des candidats qui montrent les réponses tropique modifiées en affectant la connectivité symplasmique. Pour remédier à de tels candidats, le mouvement d'un traceur symplasmique et le dépôt de callose plasmodesmal ont été examinés. Cette stratégie serait utile d'explorer de nouveaux gènes candidats qui peuvent réguler la connectivité symplasmique directement ou indirectement au cours des réponses tropique et d'autres processus de développement.

Introduction

Les plantes, comme les organismes vivants sessiles, ont développé un réseau très sophistiqué de la signalisation de cellule à cellule pour traiter divers stimuli environnementaux. Réponses tropique sont l'un des phénomènes par lequel les plantes répondent à des stimuli environnementaux. Les plantes montrent deux principales réponses trophiques, phototropisme et gravitropisme. plantes photosynthétiques courbent vers la source lumineuse par phototropisme pour récolter un maximum d'énergie. De même, gravitropisme rend les plantes à croître vers le centre de gravité. Le mécanisme fondamental qui conduit à ces réponses tropique implique asymétrique formation de gradient de la phytohormone auxine ^1. L'acte de formation de gradient de auxine locale est bien caractérisée; les gènes qui sont impliqués dans ce mécanisme constituent un plan d'action de l' hormone de ^2-8. La position spécifique des transporteurs d'efflux auxine, tels que PIN FORMÉ (PIN) et les glycoprotéines P, exécute le mouvement de l' auxine à partir du cytoplasme de la paroi cellulaire des cellules donneuses ^9,10. Far ailleurs, par la H ⁺ / AAI activité symport active des transporteurs d'afflux auxine, tels que les protéines de la famille LAX AUX1 /, l' auxine est finalement délivré aux cellules réceptrices adjacentes ^2,11,12. Ce mouvement directionnel d'auxine est connu comme transport de l'auxine polaire (PAT). PAT conduit à une distribution de l' auxine différentielle à divers stades de développement et en réponse à différents stimuli environnementaux ^13,14. En outre, la perturbation de la localisation ou l'expression de l'un de ces transporteurs d'efflux ou afflux auxine conduit à une altération sévère PAT, ce qui entraîne une perturbation du gradient de l'auxine, ce qui conduit à des défauts de développement. Récemment, Han et al. a rapporté que la réglementation plasmodesmal est également nécessaire de maintenir le gradient de auxine ^15. À ce jour, plus de 30 protéines plasmodesmal ont été identifiés ^16. Parmi ces protéines, AtGSL8 a été rapporté comme une enzyme clé pour la synthèse de callose à plasmodesmes (PD) et joue donc un rôle essentiel dans maintaining la limite PD d'exclusion de taille (SEL). AtGSL8 expression réprimée a donné lieu à un motif de gradient de auxine déformé conduisant à aucune réponse à tropisme contrairement aux plants de type sauvage ^15.

Dans ce manuscrit, les méthodes d'explorer de nouveaux gènes candidats qui sont impliqués dans la régulation de PD sont fournis. AtGSL8 a été utilisé comme protéine modèle pour tester ces méthodes, il est une enzyme clé qui contribue à la biosynthèse PD callose. En raison de la plantule létalité gsl8 de mutants knock-out ^17, la dexaméthasone (Dex) les lignes ont été utilisées inductible par ARNi selon un rapport publié antérieurement ^15. La stratégie fournie ici peut être adapté pour cribler des gènes qui sont impliqués dans la réponse hypocotyle tropic commandé par PD SEL.

Protocol

1. Dépistage des Mutants avec réponses phototropiques et gravitropique Altered

1. Préparer 1x Murashige et Skoog (MS) Medium, pH 5,7, avec 0,8% Agar Un jour avant l'expérience.
   1. Ajouter 800 ml d'eau distillée deux fois à un 2 L fiole conique et remuer avec un barreau magnétique.
   2. Ajouter 4,4 g de MS sel dans la fiole conique.
   3. Ajouter 0,5 g de 2- (N-morpholino) l'acide éthanesulfonique (MES) et remuer jusqu'à ce que tous les sels sont complètement dissous.
   4. Ajuster le pH du milieu à 5,7 avec KOH 1 M.
   5. Transférez le moyen d'un cylindre de masse et porter le volume final à 1 L avec ddH ₂ O.
   6. Verser retour du milieu dans un 2 L fiole conique et ajouter 8 g d'agar-agar de la plante.
   7. Enveloppez la bouche de la fiole conique hermétiquement avec du papier d'aluminium.
   8. Autoclave le milieu MS et ddH ₂ O pendant 15 min à 121 ° C, 15 psi, et après autoclavage, maintenir le milieu dans un incubateur à 60 ° et le ddH ₂ O à la température ambiante.
   9. Après refroidissement à 60 ° C, verser le milieu dans 125 x 125 x 20 mm ³ plaques carrées sur un banc à flux laminaire (50 ml dans chaque plaque).
   10. Laisser la gélose se solidifier à la température ambiante pendant environ 1 h en maintenant les plaques partiellement ouverte. Si les plaques ne sont pas utilisés immédiatement, les sceller à l'aide d'une pellicule de plastique et conserver à 4 ° C dans un réfrigérateur.
2. Surface-stériliser les graines avec de l'hypochlorite de sodium à 1,1% et dot les graines sur des plaques de gélose 1x MS qui ont été préparés à l'article 1.1.
   Note: Ici, Arabidopsis thaliana {Col-0 Source, dsGSL8 (Col-0)} ¹⁵ sont utilisés pour la réponse de tropique, callose coloration et HPTS chargement Arabidopsis thaliana {Col-0 et dsGSL8 (Col-0) EMS mutant} graines (. non publié) sont utilisés pour la réaction tropic sur la figure 2.
   1. Autoclave de 300 ml d'ddH ₂ O dans une bouteille.
   2. Ajouter environ une centaine de graines pour chaque fond, à savoir,surexpression lignée mutante / et de type sauvage (Col-0) les graines, à un tube de 1,5 ml.
   3. Sortez plaques 1x MS agar à partir d'un C réfrigérateur à 4 ° C et les sécher sur un banc d'écoulement laminaire dans une position partiellement ouverte.
   4. Surface-stériliser les graines en ajoutant 1 ml d'une solution d'eau de Javel 0,2x (hypochlorite de sodium à 1,1%) et de garder les tubes à centrifuger sur un agitateur à 250 tours par minute pendant 5 minutes.
   5. Laissez les graines se déposent au fond par gravité puis retirez la solution d'eau de Javel par micropipette.
   6. Ajouter 1 ml de ddH frais ₂ O (autoclavés) pour les graines et bien mélanger en inversant le tube de microcentrifugeuse plusieurs fois. Laissez les graines se déposent à nouveau, puis éliminer l'eau.
   7. Répétez l'étape 1.2.6 5-6 fois.
   8. Ajouter le double de la quantité d'eau au volume des graines qui ont été laissés après le lavage final.
   9. Dot les graines stérilisées sur un 1x MS plaque de semi-séchées de gélose en utilisant une pointe 1 ml de micropipette contenant 200 pi de graines (eneau comprise).
      1. Gardez une distance d'environ 0,1 cm entre deux graines et un minimum de 1,8 cm entre deux rangées de semences. Dot les graines en cinq rangées horizontales par plaque carrée (125 x 125 x 20 mm ^3). Laisser l'eau sécher légèrement avant de placer le couvercle sur la plaque.
   10. Sceller les plaques avec du ruban adhésif chirurgical, empiler toutes les plaques verticalement, et l'envelopper de papier d'aluminium.
   11. Transférer les plaques enveloppées dans une boîte noire (sans accès à la lumière). Alors, gardez la boîte noire dans un 4 ° C chambre / réfrigérateur pendant 3 jours.
   12. A partir de cette étape, garder la direction des plaques inchangées. Après 3 jours de traitement par le froid, garder la boîte noire dans une chambre de culture de plantes à 22 ° C pour les 3 prochains jours. Après 3 jours, vérifier l'état de germination des graines sous la lumière verte dans une pièce sombre.
       NOTE: Habituellement 3 jours d'âge Col-0 plants étiolés peuvent atteindre jusqu'à 1,6 cm de longueur.
3. Analyser le un phototropique modifiénd réponse gravitropique dans des mutants ou surexpression lignes d'un gène spécifique. Sélectionnez plantules droites seulement taille similaire et verticalement cultivés sous une lumière verte dans une pièce sombre. Transfert des plants sélectionnés sur une plaque de gélose 1x MS frais en utilisant la pointe d'un cure-dent stérilisé.
   1. sélectionnez délicatement les semis de la partie la plus basse de leur hypocotyle sans toucher les autres parties. Assurez-vous que tous les plants ont même orientation cotylédons / crochet, et après le transfert, que l'orientation des semis crochets restent les mêmes. Utiliser un minimum de 20 plants de chaque fond de chaque rangée et un minimum de deux plaques pour chaque point de temps pour une analyse plus approfondie.
      Remarque: Quatre milieux différents peuvent être comparés dans chaque plaque (4 lignes).
      Facultatif: Lors de l'utilisation de la dexaméthasone (dex) inductible par ARNi / surexpression lignes, transférer les plants ci-dessus à un 1x MS plaque le long de la plaque MS + dex (plaque contenant 1x MS, milieu de gélose à 0,8% complété par 20 uM dex) for 3 h et de garder les plaques verticalement dans la boîte noire.
   2. Pour vérifier la réponse phototropique, transférer les plateaux au-dessus verticalement à une boîte noire avec un seul côté ouvert. Transférer la boîte noire contenant des plaques à une chambre de croissance de la plante avec une lumière blanche unilatérale. Pour assurer la lumière unilatérale, placez le bord de la plaque vers la source de lumière (pas la face avant). Reportez - vous à la configuration de la figure 1.
   3. De même, pour vérifier la réponse gravitropique, garder les plaques avec des plants transférés verticaux, et couvrir de papier d'aluminium. Ensuite, changer l'orientation de la plaque verticale à 90 ° et garder à l'intérieur de la boîte noire couverte de tous les côtés. Reportez - vous à la configuration de la figure 1.
   4. Après les points de temps donnés, (généralement 1,5 h, 3 h, 6 h et 12 h) analyser les plaques avec un scanner et d'enregistrer les images au format JPEG.
   5. Mesurer l'angle de pliage des semis en utilisant le logiciel ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (Figure 2).
      1. Démarrez le programme ImageJ en double cliquant (figure 2A).
         Remarque: Les principaux outils qui ont été utilisés dans la mesure d'angle sont présentés dans la figure 2B.
      2. Cliquez sur l'option "fichier" suivi de sous-option "ouverte" dans la barre d' outils ImageJ, et les images ouvertes enregistrées au format de fichier JPEG pour mesurer le tropique angle de flexion (figure 2C).
      3. Cliquez sur l'outil loupe pour zoomer ou sur l'image en cliquant sur ​​le bouton gauche de la souris ou la droite, respectivement , comme le montre la figure 2B.
      4. Cliquez sur l'outil de défilement pour faire glisser et positionner l'image (figure 2D) .Next, cliquez sur l'outil d'angle pour mesurer l'angle de flexion (figure 2E).
         1. Faire un double clic gauche sur l'hypocotyle originale du point de direction de plus en plus 'a', faites glisser la souris sur le point d'initiation de pliage 'b' (Figure 2F), et cliquez sur les fesses gaucheà dessiner la première ligne (figure 2G).
         2. Faites glisser la souris à partir du point b au point d'extrémité de pliage 'c', et cliquez sur le bouton gauche pour dessiner la deuxième ligne (figure 2H) et former un fixe A. Note: Le vrai angle de pliage est B, qui est égal à 180 ° - A. (Figure 2F).
         3. Mesure et enregistrer A en appuyant sur 'M' sur le clavier. Le fichier résultat sera ouvert séparément comme le montre la figure 2I. Mesurer et enregistrer l'ensemble des jeunes plants une par une. Par exemple, mesurer d' abord l'angle de pliage pour toutes les hypocotyles de Col-0, puis pour les lignes mutantes.
   6. Transférer le jeu de données ImageJ dans le fichier tableur pour faire le avcouver- des angles de flexion de chaque fond.
   7. Pour l' analyse quantitative, faire un diagramme graphique à barres avec les résultats des tests statistiques, y compris les barres d'erreur standard et des valeurs de probabilité (voir la figure 2).
      1. Calculer la vraie flexion B, et concevoir une formule utilisant une feuille de calcul, à savoir, B = 180 ° - Une note: A est la valeur qui a été dérivée à partir de l'analyse ImageJ.
      2. Mesurer l'angle de flexion moyenne B pour chaque fond en utilisant des outils de tableur (Figure 2J).
      3. Analyser l'écart type entre les répétitions pour chaque mesure à l' aide de la feuille de calcul "formules" outil (Figure 2J).
      4. Testez le significance des résultats en appliquant un test t à l'angle de flexion valeurs moyennes et d'écarts-types calculés comme mentionné ci-dessus.
      5. Dessiner un diagramme à barres en utilisant les valeurs ci - dessus pour représenter graphiquement la différence quantitative de l'angle de flexion entre deux milieux différents en utilisant la feuille de calcul "insert" outil (Figure 2K).
         Note: Mutant / over-expression lignes de gènes candidats forts montreraient des différences claires par rapport à type sauvage, comme aucune flexion, rapide pliage ou cintrage lent.

2. Lignes de plantes d'écran avec réponses défectueux Tropic raison de changements dans PD SEL avec une Altered PD Callose Level

1. Effectuer un test en cours de chargement Hypocotyle par 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonique acide (HPTS) Dye Chargement sur ​​le haut de plantules avec HPTS Agarose Blocks et comparer le Mouvement des Dye Entre Mutant / Over-expression Lines et Col-0.
   1. Préparer HPTS agaroblocs soi pour le dosage hypocotyle de chargement.
      1. Prélever 10 ml de ddH ₂ O dans une fiole de 50 ml et ajouter 0,1 conique g d'agarose pour préparer un gel d'agarose à 1%. Faire bouillir l'agarose dans un four à micro-ondes pendant 1-2 min avec une agitation intermittente, et le laisser refroidir pendant 5 minutes.
      2. Ajouter 50 mg de HPTS à 10 ml de solution d'agarose à 1%, et bien mélanger jusqu'à ce que la solution vire au vert.
      3. Verser le mélange ci-dessus dans une boîte de Petri de 10 mm, et lui permettre de se solidifier pendant 15 minutes.
      4. Couper les HPTS solidifiées agarose avec une lame de bistouri pour faire de petits blocs d'agarose (0,5 x 2 cm ^2).
   2. Préparer des échantillons de plantes pour le dosage de colorant de chargement HPTS.
      1. Définir une plate-forme pour le dosage HPTS colorant de chargement; placer une lamelle de microscope (24 x 50 mm ²⁾ sur une nouvelle plaque de milieu MS , comme représenté sur la figure 3A.
      2. Accise 3 jours-vieux plants étiolés de la base du crochet à l'aide d'un ciseau chirurgical pointu.
      3. Immédiatementtransférer les plants ci-dessus (un minimum de 5 plants de chaque arrière-plan) à la surface d'un verre de couverture microscopique d'une manière telle que seulement 0,5 cm de hypocotyle de la position d'excision devraient rester sur le couvercle coulissant, et le reste de l'hypocotyle doit toucher le moyen tel que représenté sur la figure 3B.
      4. Placer le bloc d'agarose HPTS au-dessus de l'hypocotyle (avec un crochet excisé) pendant 5 minutes de manière à ce que la zone excisée en contact avec le bloc d'agarose HPTS.
      5. Après 5 min de chargement, retirez le bloc d'agarose de la surface de l' hypocotyle, transférer les hypocotyles à l'antenne 10 mm de Pétri contenant ddH ₂ O et laver hypocotyles en ddH ₂ O pendant 15 min avec agitation continue.
   3. Préparer les échantillons pour la microscopie confocale.
      1. Sélectionnez un minimum de 5 plants de chaque fond pour l'observation au microscope confocal à balayage laser microscope.
      2. Dans le canal de laser, régler la longueur d'onde de 488 nm pour exc spécifiqueitation et 500 à 550 nm pour le passe-bande d'émission.
      3. Plantules de transfert dans 2 ensembles (une Col-0 + un mutant) à une nouvelle lame microscopique après lavage avec ddH ₂ O. Ajouter 100-150 ul d'eau distillée deux fois à la diapositive, et couvrir avec une lamelle. Déplacer le curseur vers la platine du microscope confocal.
      4. Concentrez la région de l'hypocotyle (avec un objectif 20X ou 40X) en utilisant champ lumineux (lumière blanche) illumination. Puis, numériser les diapositives de fluorescence.
      5. Prendre des images pour un minimum de 10 ensembles, et de comparer les deux milieux en vérifiant l'étendue du mouvement de colorant à partir du point de chargement.
         Note: Mutant / over-expression lignes avec le mouvement symplasmique modifié montreront différents modèles de charge de colorant par rapport au type sauvage Col-0.
2. Analyser le niveau Callose dans Mutant / Over-expression Lignes Affichage Réponse Phototropic et gravitropique Altered et Affichage Distinct HPTS Dye Mouvement Compared à Col-0.
   1. Préparer le bleu d'aniline callose coloration colorant.
      1. Faire 1 M de glycine, pH 9,5 et 0,1% (W / V) bleu aniline dans autoclavé ddH ₂ O.
      2. Faire le tampon de coloration en mélangeant 0,1% de bleu d'aniline et 1 M glycine en 2: 3 rapports de volume. Par exemple, pour 50 ml de tampon de coloration, de prendre 20 ml de 0,1% de bleu d'aniline et 30 ml de 1 M de glycine. Note: Faire la coloration tampon un minimum de 48 heures avant de l'utiliser et de le stocker dans l'obscurité.
   2. Stain bended ou semis avec l'aniline colorant bleu spécifiques callose non-fléchie.
      1. Pour inhiber la synthèse de novo callose pendant le processus de coloration, ajouter le volume final de 1,5 mM de 2-désoxy-D-glucose (DDG) à 50 ml de tampon de coloration.
      2. Prenez 3 jours-vieux plants étiolés pour callose coloration (avec ou sans réponse tropique).
      3. Couper les plants de leur région de crochet à l'aide de ciseaux chirurgicaux minces.
      4. Transférer les plants dans une petite boîte de Pétri contienttion 2 ml de tampon de coloration à l'aide de la pointe d'un cure-dent.
      5. Incuber les plants avec un tampon de coloration dans l'obscurité pendant 2 heures avec agitation continue à 30 tours par minute.
      6. Après coloration, laver les semis avec ddH ₂ O pendant 2 minutes pour éliminer le tampon de coloration en excès.
      7. Sélectionnez un minimum de 5 plants pour chaque fond végétal pour l'observation au microscope confocal à balayage laser microscope.
   3. Préparer des échantillons pour la microscopie confocale:
      1. Transférer les plants dans la série (un Col-0 + un mutant) pour nettoyer le microscope glisse après lavage avec ddH ₂ O.
      2. Ajouter 100-150 pi de ddH ₂ O et couvrir avec une lamelle. Déplacer le curseur vers la platine du microscope confocal.
      3. Dans un canal de laser, régler la longueur d'onde de 405 nm pour une excitation spécifique et 500-550 nm pour l'émission de l'imagerie de fluorescence bleue d'aniline.
      4. Apportez la région de l'hypocotyle au point, d'abord avec 10X et finr avec 20X ou 40X lentilles de l'objectif à l'aide de champ lumineux (lumière blanche) illumination.
      5. Ensuite, allumez la lumière filtrée, scanner les diapositives pour la fluorescence, et enregistrer les images.
      6. Mesurer l'intensité du signal de callose avec le logiciel ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (voir la figure 4).
         1. Modifier le format de la microscopie confocale images de l'image Olympus Format binaire (* .oib) au format de fichier JPEG. Remarque: Seul le format JPEG est pris en charge par le logiciel ImageJ.
         2. Démarrez le programme ImageJ en double cliquant (figure 4A). Nota: Les flèches indiquent l'outil de rectangle pour être utilisé dans la mesure de l' intensité de callose (figure 4B).
         3. Cliquez sur l'option "fichier" suivi de la sous-option "ouverte" dans la barre d' outils ImageJ, et ouvrir des images de microscopie qui ont été enregistrées au format de fichier JPEG pour mesurer l'intensité de callose (figure 4C).
         4. Cliquez sur l'icône rectangulaire sur le Imabarre d' outils gej (Figure 4D).
         5. Pour analyser l'intensité du signal, faites glisser le curseur sur l'image et sélectionnez la zone à examiner (Figure 4E)
         6. Mesurer et enregistrer les valeurs numériques pour l' intensité du signal en appuyant sur ​​'M' sur le clavier (Figure 4E). Remarque: Le fichier résultat sera ouvert séparément (Figure 4F).
         7. Mesurer et enregistrer les valeurs d'intensité, un par un pour tous les plants de chaque fond végétal.
            Remarque: Dans ImageJ, le fichier résultat "moyenne" indique l'intensité du signal de la «zone» sélectionnée.
      7. Copiez les valeurs moyennes à partir du fichier de résultat de ImageJ, et coller dans le fichier de feuille de calcul pour l'analyse quantitative.
      8. Pour l' analyse quantitative, faire un diagramme graphique à barres avec des tests statistiques, y compris les barres d'erreur standard et des valeurs de probabilité (figure 4).
         1. Mesurer l'intensité de signal moyenne(moyenne de ImageJ) pour chaque fond en utilisant la feuille de calcul "formules" outil (Figure 4G).
         2. Analyser l'écart type entre les répétitions pour chaque mesure à l' aide de la feuille de calcul "formules" outil (Figure 4G).
         3. Calculer l'erreur standard (SE) en utilisant thespreadsheet outil "formules".
            Note: SE = s / √ n, où (s) est l'écart type de la population, et (n) est la taille (nombre d'observations) de l'échantillon.
         4. Tester la significativité des résultats en appliquant un test t à l'intensité moyenne du signal d'erreur et les valeurs types calculés comme mentionné ci-dessus.
         5. Dessinez un diagramme graphique à barres en utilisant les valeurs ci - dessus pour représenter graphiquement la différence quantitative du niveau de callose entre deux milieux différents en utilisant la feuille de calcul "insert" outil (Figure 4H).
            Note: Mutant / over-expression lignes de candidats forts seront scomment les différents niveaux de callose par rapport au type sauvage, comme aucun callose, peu callose ou hyper accumulation PD callose.

Representative Results

Dans la configuration actuelle, la dexaméthasone (dex) inductible par lignes ARNi de AtGSL8 [ci - après dsGSL8 (+ dex / -Dex)] ont été utilisés, comme les mutants d'insertion ADN-T gsl8 homozygotes sont des plantules létale ^18. Trois jours-vieux plants étiolés de dsGSL8 et plants de type sauvage avec dex ± ont été exposés à des stimuli phototrophes et gravitropique. Nous avons constaté que dsGSL8 (+ dex) plantules étaient défectueuses dans phototropisme et gravitropisme ^15. La figure 5 montre clairement que dsGSL8 (+ dex) ne présente pas de flexion sous l'influence des deux phototropisme et gravitropisme. En outre, la modification dans le mouvement symplasmique dans dsGSL8 (+ dex) et dsGSL8 (-Dex) ou Col-0 a été analysée par un essai de chargement HPTS. Conformément à notre constatation précédente, le mouvement HPTS de colorant dans dsGSL8 (+ dex) était beaucoup plus étendue que dans dsGSL8 (-Dex) ou Col-0, figure 6. callose est l' un des régulateurs clés de la maladie de Parkinson SEL et AtGSL8 est connu en tant que PD - synthase callose ^16. En outre, callose aniline coloration bleue a été réalisée, et dsGSL8 (+ dex) ont constamment montré un niveau de callose PD faible avant et après les réponses tropique, comme le montre la Figure 7.

Figure 1. Diagramme des étapes qui sont impliqués dans la stimulation des réponses phototrophes et gravitropique. (A) Transfert cultivées verticalement plants issus de plantes différentes à une plaque , mais dans des lignes séparées. (B) Pour phototropisme, garder les plaques tournées vers la lumière blanche unilatérale dans une boîte sombre qui est ouvert sur ​​un côté. Pour gravitropisme, d'abord envelopper les plaques avec du papier d'aluminium, une rotation de 90 °, et de transférer à une boîte noire (remré de tous les côtés). (C) A l' aide d' un scanner, numériser les plaques après différents intervalles de temps, tels que 1,5 h, 3 h, 6 h et 12 h. (D et E) Ces panneaux montrent la génération de données à partir de ImageJ et l' analyse des données en utilisant des feuilles de calcul, respectivement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Mesure de l'angle de flexion par ImageJ. (A) Voir l'image J programme en double - cliquant. (B) Les principaux outils qui ont été utilisés dans la mesure de l' angle. (C) Ouvrez l'option "Fichier" puis la sous-option "ouverte" à l'image J barre d' outils pour ouvrir des images de microscopie qui ont été enregistrés au format de fichier JPEG. (D (F) Aperçu de la mesure d'angle: abc définit un fixe A et l'angle réel de courbure est calculée en B, qui est égal à 180 ° - A. (G) Ligne représentant la distance du point a au point b. (H) La continuité de la ligne ab au point c de décision A. (I) fichier Résultat d'Image J démontrant Une valeur. (J) de fichier tableur représentant affichant la moyenne des mesures d'angle de flexion, stanécarts de dard, des erreurs standard et les calculs t-test. (K) Bar graphique diagramme affichant les mesures d'angle de flexion entre deux milieux différents végétaux Col-0 et mutantes dsGSL8 EMS. Les barres d'erreur sont SEM (erreur standard de la moyenne +) et *** représente la signification par T-test (valeur p> 0,001). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Schéma des étapes qui sont impliqués dans l'essai de chargement HPTS. (A) Panneau montrant la préparation de blocs d'agarose HPTS. (B) Panneau représentant l'excision et le transfert des plants et le chargement des blocs d'agarose HPTS. (C) Panneau de visualisation des étapes impliquées dans l' échantillonpréparation pour l' imagerie confocale. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Mesure de l'intensité de callose par ImageJ. (A) Voir le programme de ImageJ en double - cliquant. (B) Les principaux outils qui ont été utilisés dans la mesure de l' intensité callose. (C) Ouvrez l'option "Fichier" puis la sous-option "ouverte" dans la barre d' outils ImageJ pour ouvrir des images de microscopie qui ont été enregistrés au format de fichier JPEG. (D) L'icône rectangulaire sur la barre d' outils ImageJ. (E) la zone sélectionnée de l'image pour analyser l'intensité de callose. (F) ImageJ fichier résultat affichant la valeur d'intensité de callose comme "moyenne". (G)fichier tableur représentant l'affichage des mesures moyennes callose d'intensité, les écarts-types, erreurs standard et calculs t-test. (H) Bar schéma graphique représentant la différence d'intensité callose entre les deux milieux de plantes. Les barres d'erreur sont SEM (erreur standard de la moyenne +) et *** représente la signification par T-test (valeur p> 0,001). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. Réduction de l' expression AtGSL8 conduit à un défaut de réponses tropique. (A) Réponse Phototropic montré par dsGSL8 (± dex) avec Col-0. (B) de réponse gravitropique montré par dsGSL8 (± dex) al ong avec Col-0. dsGSL8 (+ dex) montre aucune réponse phototrophes ou gravitropique. dsGSL8 (+ dex) et dsGSL8 (-Dex) symbolisent les lignes ARNi inductible par la dexaméthasone traitées et non traitées dsGSL8, respectivement. La barre d'échelle représente 0,2 cm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6. Le mouvement symplasmique a augmenté après la suppression des AtGSL8. Images Fluorescence ont été prises après HPTS chargement dsGSL8 ± surfaces dex hypocotyle coupées ainsi que le type sauvage Col-0. DsGSL8 (+ dex) a montré plus vaste mouvement de HPTS colorant, démontrant augmenté mouvement symplasmique. La barre d'échelle représente 0,2 mm.com / fichiers / ftp_upload / 53513 / 53513fig6large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7. AtGSL8 lignes supprimées ont montré la distribution PD callose symétrique entre les côtés lumineux et ombragé de l'hypocotyle. (A) l' image de fluorescence montrant l' aniline coloration de callose bleu pour dsGSL8 (-Dex) à 0 h. L' image (B) Fluorescence montrant l' aniline coloration de callose bleu pour dsGSL8 (-Dex) après 6 h de phototropisme. (C) Fluorescence image montrant l' aniline coloration de callose bleu pour dsGSL8 (+ dex) après 6 h de phototropisme. Les flèches jaunes indiquent l'accumulation de callose sur la région ombrée de hypocotyle. La barre d'échelle représente 50 um. (D) Bar diagramme graphique représentant le amontant du PD callose qui se sont accumulés dans dsGSL8 (± dex) hypocotyles avant et après 3 h et 6 h de phototropisme. Fluorescence intensités de foyers ont été mesurées à partir de dix hypocotyles indépendants (données sont la moyenne ± SD; test t de Student, * p <0,01). Ce chiffre a été modifié depuis (Han et al., 2014) ^15. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Dans ce manuscrit, une stratégie pour l'écran mutant / over-expression lignes qui sont défectueux dans les réponses phototrophes et gravitropique en raison de callose modifié PD et, par conséquent, PD SEL est décrite en détail. synthèse de callose PD et à la dégradation est principalement accomplie par synthases callose et β-1,3-glucanases, mais la régulation de ces enzymes est contrôlée par de nombreux facteurs en amont. Pour rechercher ces facteurs en amont ou les candidats qui sont directement impliqués dans la régulation de PD, nous avons mis en place cette méthode pour le dépistage. Cette mise en place a quelques limitations que les mutants de certaines enzymes clés de régulation PD callose biosynthèse (gsl8) sont mortels ¹⁵ et de trier ces mutants seraient limités par cette mise en place. En outre, si le gène candidat montre plus rapide ou plus lente réponse du tropique avec PD ouvert ou fermé, mais le niveau de callose reste inchangé, puis une analyse détaillée est nécessaire pour caractériser davantage ces candidats. Les facteurs critiques et dépannage processes à chaque étape sont également élaborés. Tout d'abord, en préparation du milieu, un facteur critique qui peut affecter la croissance des plantes est le pH du milieu, qui devrait varier de 5,7 à 5,8. Deuxièmement, le séchage de la surface appropriée des plaques d'agar-agar est important; il serait difficile de lever les trois jours semis âgés sans aucun dommage à partir de plaques de gélose avec forte teneur en eau. Cependant, trop de séchage des plaques de gélose peut provoquer des fissures dans le support pendant l'incubation et entraîner la croissance des semis asymétrique. Lors de la stérilisation de surface des graines en utilisant une solution d'hypochlorite de sodium, des précautions doivent être prises pour éliminer complètement l' hypochlorite de sodium par lavage répété avec ddH autoclavée ₂ O, car il est un agent de blanchiment solide. Autoclavé ddH ₂ O doit être préparée fraîchement et manipulée de façon aseptique, que les anciens stocks pourraient causer une contamination fongique dans des plaques de sclérose en plaques. Après stérilisation, les graines sont stratifiées par traitement à froid pour synchroniser la germination. Ce procédé peut être effectué soit par la transferrineg stérilisé les graines humides directement à une chambre froide dans des conditions sombres ou première parsemant les graines sur des plaques de sclérose en plaques et transférer ensuite les plaques à une chambre froide dans des conditions sombres. Cependant, nous préférons que le second parce qu'il donne une croissance plus uniforme des plants. Alors que parsemant les graines, la distance entre deux graines adjacentes doit être au moins de 0,1 cm parce que les graines de très près en pointillés se traduirait par la croissance du chevauchement des semis, qui sont très difficiles à transférer dans des expériences ultérieures.

Pour les réponses phototrophes et gravitropique appropriées, les semis ne devraient pas être exposés à la lumière et doivent rester en bon état. Pour éviter les effets de fond de lumière blanche, choisir soigneusement les semis sous une source de lumière verte dans la pièce sombre que les plantes ne répondent pas à la lumière verte. source de lumière verte peut être généré en recouvrant la source de lumière blanche en utilisant des feuilles vertes transparentes de vinyle. Pour sélectionner les plants, un cure-dent stérile est la meilleure option. Appuyez sur ee partie très faible de l'hypocotyle avec le cure-dent pour soulever les plants afin qu'ils puissent être facilement transférés vers une nouvelle plaque. Tous les plants devraient être similaires en taille et l'orientation du crochet. Au cours de nos expériences, nous avons vu que si la direction du crochet se trouve sur le côté opposé de la source lumineuse, les plantes présentent une réponse à tropisme plus rapidement que les plantes avec la même direction de crochet comme source lumineuse. Normalement, dans le cas de phototropisme, on peut voir une nette différence dans l'angle de flexion entre les vrais candidats et Col-0 à moins de 3 heures, alors que dans le cas de gravitropisme, il faut habituellement 6-12 h. Enfin, pour avoir des données statistiquement pertinentes, un minimum de trois répétitions biologiques et 20 plants sont nécessaires chaque fois.

Pour tester l'étendue du mouvement symplasmique entre milieux de plantes différentes, HPTS charge de colorant est une technique commode, car il n'a pas besoin d'outils sophistiqués et de l'instrumentation. Pour le dosage de chargement HPTS, le pourcentage de gel en HPTS des blocs d'agarose est d'une grande importance, comme un gel très cassant ou dur ne donnera pas des résultats optimaux. Il est préférable d'utiliser une fiole de 50 ml conique avec caoutchouc lâche et ne pas utiliser un ballon de grand volume pour faire bouillir agarose avec 10 ml d'eau. blocs d'agarose HPTS peuvent être utilisés pendant une semaine après la préparation si elle est conservée enveloppée de papier d'aluminium à 4 ° C. Un autre facteur clé dans l'essai de chargement HPTS est l'excision de la région hypocotyle de crochet. Excision doit être réalisée avec des ciseaux de dissection pointus et à une position similaire pour tous les plants. Excision avec des ciseaux émoussés peut causer des dommages indésirables aux semis et peut entraver HPTS chargement. En outre, les conditions de croissance des semis et des stades de développement peuvent jouer un rôle crucial dans le mouvement de colorant, comme l'accumulation de callose est plus enclin à répondre à ces changements, qui représentent finalement pour la gêne dans le mouvement de colorant. Ainsi, la croissance des plants dans des conditions optimales est nécessaire. Callose au PD joue un rôle clé dans laréponses tropique de plants étiolés en régulant PD SEL, qui est important pour la formation de l' auxine gradient ^15. les niveaux de callose peuvent être détectés par coloration au bleu de marquage ou immunomarquage aniline. La coloration avec le bleu d'aniline est une méthode simple et rapide pour détecter le niveau de callose. Parce que les cellules d'hypocotyle ont la pression de turgescence élevée et une couche epi-cuticule, il est pas facile pour le colorant de pénétrer dans les cellules. Par conséquent, nous avons développé la méthode de coupe-coloration pour permettre un colorant bleu aniline de pénétrer facilement. Cependant, il existe un risque de synthèse de nouveaux callose qui peuvent influencer les résultats de la coloration, ce qui est une limitation de la méthode de coloration à la callose normale. Pour éviter de tels effets, le protocole de coloration est modifiée en ajoutant l'inhibiteur de la synthase de callose du glucose en 2-D-désoxy- (DDG) dans le tampon de coloration. Ainsi, ce protocole implique la mesure de callose préexistante seulement dans la région inférieure de l'hypocotyle qui est exactement en dessous du site de coupe. Évitez l'utilisation de fraîchement prépared bleu d'aniline, et de garder la solution de bleu d'aniline à température ambiante pendant un minimum de 48 heures avant l'utilisation. Nous avons remarqué que la coloration avec une solution de bleu d'aniline fraîche ne donne pas des résultats optimaux callose de coloration.

Dans l'ensemble, nous avons présenté un ensemble de stratégies qui peuvent être utilisés pour le dépistage rapide des mutants / surexpression lignes avec une réponse tropique défectueux ou amélioré en modifiant PD SEL en modulant directement ou indirectement PD callose. Un fait plus tôt au sujet des réponses tropique a été majorly limitée à l'action des transporteurs d'auxine et les joueurs de signalisation, tels que PINIOD ^2-14. En outre, nous avons également établi un rôle critique du mouvement symplasmique d'auxine dans le maintien d' un gradient d'auxine dans le système de hypocotyle ^15. La simplicité et la polyvalence de cette méthode renforcent sans aucun doute son utilité dans les enquêtes sur les gènes candidats pour leur régulation de PD SEL, jouant ainsi un rôle essentiel dans le développement des plantes, y compris les réponses tropique.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt)	Sigma	H1529-1G	Fluorescent dye as symplasmic tracer
LE Agarose	Dongin-Genomic	GEL001-500G	Used for HPTS agarose block
Microwave oven	LG-Goldstar		Machine for boiling agarose gel
100 ml glass conical flask	Dong Kwang	A0205	Used to boil HPTS agarose gel
Petri dish (35 mm x 10 mm)	SPL life sciences	SPL10035	Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples
Microscope cover slides and glass slides (24 mm x 50 mm)	Marienfeld Laboratory Glassware	101222	Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation
MS medium plates 125 mm x 125 mm x 20 mm	SPL life sciences	SPL11125	Plates to make MS agar medium
Scissors	Germany Stainless	HSB 942-11	Used to excise hook region of plant samples
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture	Duchefa	P10453.01	MS medium including vitamins.
(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate	Bioshop	3G30212	To make MS media.
Plant agar	Duchefa	P1001.1000	To solidify MS media.
Autoclave	ALP	CL-40L
Shaker	Wise Mix	SHO-1D	To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way.
1 ml Blue tips	Sorenson	10040
1 ml pipette	BioPette	L-1101-2
Surgical tape	MIcropore	1530-0	To seal the MS plate
Aniline blue (Methyl blue)	Sigma	M5528-25G	Used to prepare aniline blue staining buffer.
Glycine	Bioshop	GLN001	Used to prepare aniline blue staining buffer.
DDG	Sigma	D8375-1G	Used for the inhibition of callose synthases.
Confocal microscope	Olympus	FV1000MPE SIM	To check aniline blue staining and HPTS dye loading result.
Stirrer	I lab	K400	To mix media solution.
Aluminium foil	SW cooking foil		To wrap plates in a dark condition.
Sodium hypochlorite	Samjin Industry		To surface-sterilized seeds