Summary
이 문서에서는 열대 응답 중 plasmodesmal 투과성 때문에 옥신 기울기를 제어하는 유전자를 선별하기위한 방법을 설명합니다. 이것은 배축 트로픽 반응의 정도의 측정을 포함 애기 장대와 8-hydroxypyrene-1,3,6- trisulfonic 산 (HPTS)로드 그리고 마지막으로 callose 수준의 평가에 의해 plasmodesmal 투과성을 체크.
Abstract
식물 호르몬 옥신 빛과 중력 트로픽 응답을 포함하여 많은 성장과 발달 과정에서 중요한 역할을한다. 옥신 구배의 설립은 굴광성과 굴지성을 선도하는 키 이벤트입니다. 이전에는 극성 옥신 수송 (PAT)는 식물의 다른 세포 도메인에 옥신 그라데이션을 설정 줬습니다. 그러나 한은 외. 최근 적합한 옥신 구배 형성에, 인접 셀 사이 plasmodesmal callose 매개 symplasmic 연결도 중요한 인자임을 보여 주었다. 이 논문에서, 전략 plasmodesmal callose 합성 변조 통해 symplasmic 연결을 변경함으로써 굴광성 및 굴지성에 영향을 미칠 수있는 특정 유전자의 역할을 규명하기 위해 논의된다. 첫 번째 단계는 야생형과 함께 또는 돌연변이 유전자의 과발현 라인 3 일된 etiolated 모종으로부터 벗어난 트로픽 응답들을 선별한다. 이 심사PAT의 기능 또는 symplasmic 연결을 제어하는 유전자의 범위의 식별로 이어질 수 있습니다. 두 번째 심사는 symplasmic 연결에 영향을 미치는 의해 변경 열대 반응을 보여 후보자의 정렬을 포함한다. 이러한 후보를 해결하기 위해, symplasmic 트레이서의 움직임 plasmodesmal callose의 증착을 조사 하였다. 이 전략은 열대 반응과 다른 발달 과정에서 직접 또는 간접적으로 symplasmic 연결을 통제 할 수있는 새로운 후보 유전자를 탐색하는 것이 유용 할 것이다.
Introduction
식물, 정착 생물체와 같은 다양한 환경 자극을 해결하는 세포 간 신호의 매우 정교한 네트워크를 개발 하였다. 트로픽 응답은 식물이 환경 자극에 반응하는 현상 중 하나입니다. 식물은 두 가지 열대 응답, 굴광성과 굴지성을 보여줍니다. 광합성 식물은 최대 에너지를 수확 굴광성에 의해 광원으로 구부리십시오. 마찬가지로, 굴지성는 무게 중심을 향해 성장하는 식물을합니다. 같은 열대 응답을 유도하는 근본적인 메커니즘은 phytohormone 옥신 1의 비대칭 경사 형성을 포함한다. 로컬 옥신 그라데이션 형성 법은 잘 특징으로한다; 이 메커니즘에 관여하는 유전자는 호르몬 작용 2-8에 대한 로드맵을 제공합니다. 옥신 등 PIN 형성 (PIN)와 같은 유출 담체, 및 p- 당 단백질의 특정 위치는 공여 세포 9,10의 세포벽을 세포질에서 옥신의 이동을 실행한다. 에프urthermore, 이러한 AUX1 / LAX 가족 단백질과 같은 옥신 유입 캐리어의 활성 H + / IAA의 symport 활동에 의해, 옥신은 마지막으로 인접 수신기 세포 2,11,12에 전달된다. 옥신이 방향 운동은 극성 옥신 수송 (PAT)로 알려져있다. PAT는 다양한 개발 단계에서 서로 다른 환경 적 자극 (13, 14)에 응답하는 차동 옥신 분포로 이끈다. 또한, 이러한 옥신 유입 또는 유출 사업자의 국산화 또는 식의 중단 발달 결함으로지도하는 옥신 그라데이션의 지장을 PAT에 심각한 변화로 이어집니다. 최근, 한 등. plasmodesmal 규제는 옥신 구배 (15)를 유지하는 것도 필요하다는 것을 밝혔다. 현재까지 30 개 이상의 plasmodesmal 단백질은 16 발견되었습니다. 이 단백질 중 AtGSL8는 plasmodesmata를 (PD)에 callose 합성의 핵심 효소로보고 따라서 MAINT에서 중요한 역할을하고있다는 PD 크기 배제 제한 (SEL)을 aining. 억압 AtGSL8 발현은 야생형 모종 15 대비에는 트로픽 응답 선도 왜곡 옥신 그라데이션 패턴 결과.
이 논문에서, 방법이 제공된다 PD 조절에 관여하는 새로운 후보 유전자를 탐색합니다. 이 callose 생합성 PD에 기여 주요 효소이기 때문에 AtGSL8 이러한 방법을 테스트하기 위해 모델 단백질로 사용 하였다. 때문에 녹 - 아웃 gsl8 돌연변이 체 (17)의 종묘 - 치사로, 덱사메타손 (덱스) -inducible RNAi의 라인은 이전에 게시 된 보고서 (15)에 따라 사용되었다. 여기서 제공 전략은 PD SEL 제어 배축 트로픽 응답에 관련되는 유전자를 선별하도록 구성 될 수있다.
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Protocol
변경된 Phototropic 및 Gravitropic 응답과 돌연변이 1. 심사
- 실험 전에 0.8 % 한천 한 주에 1 배 무라 시게 및 스쿡 (MS) 중간, pH가 5.7을 준비합니다.
- 2 L 삼각 플라스크에 증류수 800 ml에 추가하고 자기 바 저어.
- 원추형 플라스크에 MS 염 4.4 g을 추가합니다.
- 2- (N- 모르 폴리 노) 에탄 설 폰산 (MES) 0.5 g을 추가하고 염 모두가 완전히 용해 될 때까지 교반한다.
- 1 M KOH와 5.7 매체의 pH를 조정합니다.
- 매스 실린더에 매체를 전송하고 DDH 2 O.과 1 L로 최종 부피를 가지고
- 2 L 삼각 플라스크에 매체를 다시 붓고 식물 한천 8g을 추가합니다.
- 알루미늄 호일로 단단히 삼각 플라스크의 입구를 랩.
- 121 ° C, 15 psi에서 15 분 동안 MS 매체와 DDH 2 O를 압력솥 및 고압 증기 멸균 한 후, 60 ° C 배양기 및 RT의 DDH 2 O의 매체를 유지.
- 60 ° C로 냉각 한 후, 층류 벤치에 125 X 125 X 20mm 3 정사각형 판에 매체 (각 접시에 50 ml)에 붓는다.
- 한천이 부분적으로 개방 판을 유지하여 약 1 시간 동안 실온에서 응고 할 수 있습니다. 플레이트를 즉시 사용하지 않는 경우, 냉장고에 4 ° C에서 플라스틱 랩 저장소를 사용하여이를 밀봉.
- 1.1 %의 차아 염소산 나트륨과 씨앗을 표면 소독 및 섹션 1.1 제조 하였다 1X MS 한천 접시에 씨앗을 점.
참고 :. 여기에서, 애기 장대 {골-0 씨앗, dsGSL8 (골-0)} 15 트로픽 응답, callose 염색 및 HPTS로드 애기 장대 {골-0 및 dsGSL8 (골-0) EMS 돌연변이} 씨앗 (사용된다 ) 게시되지 않은 그림 2에서 열대 응답에 사용됩니다.- 병에 DDH 2 O의 300 ml의 압력솥.
- 각 배경에 대해 약 백 씨앗을 추가, 즉,돌연변이 / 과발현 라인과 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 야생형 (골-0) 씨.
- 4 ° C 형 냉장고에서 1 배 MS 한천 플레이트를 꺼내 부분적으로 개방 위치에 층류 벤치에 그들을 건조.
- 0.2X 표백제 용액 (1.1 % 차아 염소산 나트륨) 1 ㎖를 첨가하여 종자를 표면 - 멸균하고 5 분 동안 250 rpm에서 진탕 기에서 마이크로 원심 튜브를 유지한다.
- 씨앗은 중력에 의해 바닥에 정착 한 후 마이크로 피펫으로 표백제 용액을 제거 할 수 있습니다.
- 씨앗에 신선한 DDH (멸균) 2 O 1 ㎖를 추가하고 microcentrifuge 관을 여러 번 반전 잘 섞는다. 씨앗이 다시 정착 한 후 물을 제거 할 수 있습니다.
- 단계를 반복 1.2.6 5-6 번.
- 최종 세척 후 남아 있던 씨의 볼륨에 물 두 배를 추가합니다.
- 도트 씨의 200 μl를 함유하는 1 ml의 마이크로 피펫 팁을 사용하는 반 건조 1X MS 한천 플레이트에 소독 종자 (투입CLUDING 물).
- 이 씨와이 씨의 행 사이에 1.8 cm의 최소 사이에 약 0.1 cm의 거리를 유지. 사각 접시 (125 X 125 X 20mm 3)에 5 수평 행에 씨앗을 점. 물이 접시에 뚜껑을 배치하기 전에 약간 건조하도록 허용합니다.
- 수술 테이프로 밀봉 판을 수직 플레이트의 모든 스택 및 알루미늄 호일로 래핑.
- (빛없이 액세스) 어두운 상자에 포장 판을 전송합니다. 그런 다음 3 일 동안 4 °의 C 룸 / 냉장고에 어두운 상자를 유지합니다.
- 이 단계에서 시작, 변경되지 않은 판의 방향을 유지합니다. 감기 치료 3 일 후, 다음 3 일 동안 22 ° C에서 식물 배양 방에 어두운 상자를 유지합니다. 삼일 후, 어두운 방에 녹색 빛 아래 씨앗의 발아 상태를 확인합니다.
참고 : 일반적으로 삼일짜리 골-0 etiolated 모종의 길이가 1.6 cm까지 증가 할 수 있습니다.
- 변경된 phototropic 분석특정 유전자의 라인 돌연변이 또는 과발현 차 gravitropic 응답. 어두운 방에 녹색 빛 아래에서만 비슷한 크기와 수직 성장 직선 모종을 선택합니다. 멸균 이쑤시개의 끝을 사용하여 신선한 1X MS 한천 플레이트에 선택 모종을 전송합니다.
- 조심스럽게 다른 부분을 건드리지 않고 자신의 배축의 가장 낮은 부분에서 모종을 선택합니다. 묘목이 모두 같은 자엽 / 후크 방향이 있는지 확인하고 전송 한 후, 종묘 후크의 방향은 동일하게 유지있다. 각 행의 각 배경 및 추가 분석을 위해 각 시점 두 판의 최소 20 모종의 최소 사용합니다.
참고 : 네 개의 서로 다른 배경은 각 플레이트 (4 행)에 비교 될 수있다.
덱사메타손 (dexamethasone)을 (덱스) -inducible의 RNAi / 과발현 라인을 사용하는 동안, 1 배 MS에 위의 모종을 전송 (1 배 MS를 포함 플레이트, 0.8 % 한천 배지 20 μM의 덱스 보충) 수 fo + 덱스 MS 판과 함께 판 : 선택R 3 시간 어두운 상자에 수직으로 판을 유지한다. - phototropic 응답을 확인하려면, 열 하나의면이 블랙 박스에 수직으로 위의 접시를 전송합니다. 일방적 백색광 식물 성장 챔버로 플레이트를 포함하는 블랙 박스로 이동. 일방적 광을 보장하기 위해, 광원 (아닌 전방 측)을 향해 판의 가장자리를 놓는다. 그림 1에서 설치를 참조하십시오.
- 마찬가지로, 상기 gravitropic 응답을 확인 수직 전송 모종으로 판을 유지하고 알루미늄 호일로 커버한다. 다음으로, 90 ° 수직 플레이트 방향을 변경하고 모든면에서 적용되는 블랙 박스 안에 보관하십시오. 그림 1에서 설치를 참조하십시오.
- 주어진 시점 후 (일반적으로 1.5 시간, 3 시간, 6 시간, 12 시간)는 스캐너와 함께 접시를 검색하고, JPEG 형식으로 사진을 저장합니다.
- (그림 ImageJ에 소프트웨어 (http://imagej.nih.gov/ij/index.html)를 사용하여 모종의 굽힘 각도를 측정URE 2).
- 더블 클릭 (그림 2A)에 의해 ImageJ에 프로그램을 시작합니다.
주 : 각도 측정에 사용 된 주요 도구는도 2b에 도시되어있다. - 서브 옵션을 "열기"를 ImageJ에 도구 모음 및 열대 굽힘 각도 (그림 2C)을 측정하기 위해 JPEG 파일 형식으로 저장 열려있는 사진 뒤에 "파일"옵션을 클릭합니다.
- 왼쪽 또는 오른쪽 마우스 버튼을 클릭하면, 각각으로도 2b에 도시로 사진을 확대 또는 축소 할 수있는 돋보기 도구를 클릭합니다.
- 사진 (그림 2D) 다음 내용을 드래그하여 위치로 스크롤 도구를 클릭합니다 (그림 2E)를 굽힘 각도를 측정하는 각도 도구를 클릭합니다.
- 원래 배축 성장 방향 점 'A', 굽힘 개시 포인트 (b) '(그림 2 층)에 마우스를 드래그하여 왼쪽 엉덩이 클릭에 두 번 왼쪽 버튼을 클릭합니다에 첫 번째 줄 (그림 2G)를 그립니다.
- 굴곡 종점 'C'로 B 지점에서 마우스를 드래그하고 두 번째 줄 (그림 2H)를 그릴 왼쪽 버튼을 클릭하고 고정을 형성
A. 참고 진정한 굽힘 각도는 180과 동일하다 B, - A. (그림 2 층). - 측정 및 기록 키보드의 'M'을 눌러. 도 2I에 도시 된 바와 같이, 결과 파일은 별도 열리고. 측정 한에 의해 모종의 일을 모두 기록한다. 예를 들어, 첫 번째 돌연변이 라인에 대한 다음 골-0에서 배축의 모든 굽힘 각도를 측정합니다.
- 더블 클릭 (그림 2A)에 의해 ImageJ에 프로그램을 시작합니다.
- 는 AV를 만들기 위해 스프레드 시트 파일에 ImageJ에에서 데이터 집합을 전송각 배경의 각도를 굽힘 erage.
- 정량 분석을위한 표준 오차 막대와 확률값 (도 2 참조)를 포함하여 통계적 시험 결과와 막대 그래프도를 만든다.
- 진정한 굽힘 계산 B, 그리고 즉, 스프레드 시트를 이용하여 수식을 설계 B = 180 ° - A. 참고 : A는 ImageJ에 분석에서 파생 된 값입니다.
- 평균 굽힘 각도를 측정 각 배경 사용하여 스프레드 시트 도구 (그림 2J)에 대한 B.
- 스프레드 시트의 "공식"도구 (그림 2J)를 사용하여 각 측정에 대한 복제 사이의 표준 편차를 분석합니다.
- SIG는 테스트평균 굽힘 각도와 전술 한 바와 같이 계산 된 표준 편차 값들에 t 검정을 적용하여 결과 nificance.
- 그래픽 스프레드 시트 '삽입'도구 (그림 2K)를 사용하여 두 개의 서로 다른 배경 사이의 굽힘 각도의 양적 차이를 나타 내기 위해 위의 값을 사용하여 막대 그림을 그립니다.
참고 : 강력한 후보 유전자의 돌연변이 / 과발현 라인은 빠른 구부리거나 느린 굽힘, 같은 더 굽힘 등의 야생 유형에 대한 명확한 차이를 보여 것입니다.
- 진정한 굽힘 계산
- 조심스럽게 다른 부분을 건드리지 않고 자신의 배축의 가장 낮은 부분에서 모종을 선택합니다. 묘목이 모두 같은 자엽 / 후크 방향이 있는지 확인하고 전송 한 후, 종묘 후크의 방향은 동일하게 유지있다. 각 행의 각 배경 및 추가 분석을 위해 각 시점 두 판의 최소 20 모종의 최소 사용합니다.
변경된 PD Callose 수준으로 인해 PD SEL의 변화에 결함 트로픽 응답 2. 화면 공장 라인
- HPTS 아가로 오스 블록과 모종의 상위 8-hydroxypyrene-1,3,6- trisulfonic 산 (HPTS) 염료로드하여 배축로드 분석을 수행하고 돌연변이 사이에 염료의 운동을 비교 / 이상 표현 라인과 골-0.
- HPTS의 아가를 준비배축 로딩 분석을위한 자체 블록.
- 50㎖의 삼각 플라스크에 DDH 2 O 10 mL를 취하여 1 % 아가 로스 겔을 제조 아가 0.1 g을 추가한다. 간헐적 흔들림 1-2 분 동안 전자 레인지에 아가로 오스를 삶아하고, 5 분 동안 냉각 할 수 있습니다.
- 1 % 아가로 오스 용액 10 ㎖에 HPTS 50 mg을 추가하고, 용액이 녹색으로 바뀔 때까지 잘 섞는다.
- 10mm 페트리 접시에 상기 혼합물을 붓고, 그리고 15 분 동안 응고 할 수 있습니다.
- 작은 아가로 오스 블록 (0.5 × 2cm 2)를 만들기 위해 날카로운 해부 블레이드와 아가로 오스 응고 HPTS을 잘라.
- HPTS 염료 로딩 분석을위한 식물 샘플을 준비합니다.
- HPTS 염료 로딩 분석을위한 플랫폼을 설정; 도 3a에 도시 된 바와 같이, 새로운 MS 배지 플레이트에 현미경 커버 슬라이드 (24 × 50 ㎜ × 2)를 배치했다.
- 날카로운 외과 가위를 사용하여 후크의 기지에서 소비세 삼일 된 etiolated 모종.
- 바로적출 위치로부터 배축의 0.5 cm 커버 슬라이드에 남아 있어야하는 방식으로 현미경 커버 글라스의 표면에 상기 모종 (각각 배경 5 모종 최소)로 전송하고, 배축 나머지 닿아 야 도 3b에 도시 된 바와 같이 매체.
- 적출 된 영역이 HPTS 아가로 오스 블록을 터치하는 방식으로 5 분 동안 (AN 절제 후크)를 배축의 상단에 HPTS 아가로 오스 블록을 배치합니다.
- 로드의 5 분 후, DDH 2 O가 포함 된 10mm 페트리 접시에 배축을 전송하고 지속적으로 흔들림과 함께 15 분 동안 DDH 2 O의 배축을 씻어의 배축면에서 아가로 오스 블록을 제거합니다.
- 공 초점 현미경에 대한 샘플을 준비합니다.
- 공 초점 레이저 주사 현미경으로 관찰 각 배경에서 5 모종의 최소를 선택합니다.
- 레이저 채널 특정 EXC 488 nm의 파장을 설정itation 밴드 패스 발광 500 내지 550nm.
- DDH 2 O.로 세척 한 후 새로운 현미경 슬라이드에 2 세트에 전송 모종 (한 골-0 + 하나의 돌연변이) 슬라이드에 두 번 증류수 100 ~ 150 μl를 추가하고, 커버 슬라이드 커버. 공 초점 현미경의 무대에 슬라이드를 이동.
- 밝은 필드 (백색광) 조명을 사용하여 (20 배 또는 40 배 대물 렌즈 포함) 배축 영역을 초점을 맞 춥니 다. 그런 다음, 형광의 슬라이드를 스캔합니다.
- 10 세트의 최소 화상을 찍어 로딩 지점에서 염료 운동의 정도를 검사함으로써 두 배경을 비교한다.
참고 : 변경된 symplasmic 운동에 돌연변이 / 과발현 라인은 야생형 골-0에 비해 염료 로딩의 다른 패턴을 보여줍니다.
- HPTS의 아가를 준비배축 로딩 분석을위한 자체 블록.
- 돌연변이의 Callose 수준을 분석 / 고유 HPTS 염료 운동 비교 예를 변경된 Phototropic 및 Gravitropic 응답 표시 및 표시 오버 식 선에드는 COL-0입니다.
- 아닐린 블루 callose 염색 염료를 준비합니다.
- 멸균 DDH 2 O.에서 1 M 글리신, pH를 9.5 및 0.1 % (W / V) 아닐린 블루 확인
- 3 볼륨 비율 : 0.1 % 아닐린 블루 2 1 M 글리신을 혼합하여 염색 버퍼를 확인합니다. 예를 들어, 염색 완충액 50ml를 들면 블루 20 0.1 % 아닐린 ㎖의 1 M 글리신 30 mL를 취하여. 주 : 염색 사용할 어두운에 저장되기 전에 48 시간의 최소 버퍼합니다.
- 얼룩은 굽거나 callose 특정 아닐린 블루 염료와 모종 비 굽.
- 염색 공정 동안 callose 드 노보 합성을 억제하는 것으로, 염색 완충액 50ml로 1.5 mM의 2- 데 옥시 -D- 글루코스 (DDG)의 최종 부피를 추가한다.
- (또는 열대 응답 없음) callose 염색 3 일 된 etiolated 모종을 가져 가라.
- 얇은 수술 용 가위를 사용하여 후크 지역에서 모종을 잘라.
- 포함 작은 배양 접시에 모종 이동이쑤시개의 팁을 사용하여 염색 완충액 2 ㎖를 보내고.
- 30 rpm에서 연속 흔들림 2 시간 동안 어둠 속에서 염색 버퍼와 모종을 품어.
- 염색 후 과잉 염색 버퍼를 제거하기 위해 2 분 동안 DDH 2 O와 모종을 씻는다.
- 공 초점 레이저 주사 현미경으로 관찰 각 공장 배경 5 모종의 최소를 선택합니다.
- 공 초점 현미경 샘플을 준비 :
- 현미경을 청소 세트에서 모종을 전송 (한 골-0 + 하나의 돌연변이는) DDH 2 O.로 세척 한 후 슬라이드
- DDH 2 O의 100 ~ 150 μl를 추가하고 커버 슬라이드 커버. 공 초점 현미경의 무대에 슬라이드를 이동.
- 레이저 채널에서 특정 자극에 대한 405 nm의 아닐린 블루 형광 이미징을위한 500 550 nm의 방출에 파장을 설정합니다.
- 10X 늦은 먼저, 초점에 배축 영역을 가져와밝은 필드 (백색광) 조명을 사용하여 20 배 또는 40 배 대물 렌즈와 연구.
- 그런 다음, 필터링 된 빛에 전환 형광의 슬라이드를 스캔하고 이미지를 저장합니다.
- ImageJ에 소프트웨어 (http://imagej.nih.gov/ij/index.html)와 callose 신호 강도를 측정한다 (도 4 참조).
- JPEG 파일 형식으로 올림푸스 이미지 바이너리 형식 (* .oib)에서 공 초점 현미경 사진의 형식을 변경합니다. 참고 : JPEG 포맷 ImageJ에 소프트웨어가 지원된다.
- 더블 클릭 (그림 4A)에 의해 ImageJ에 프로그램을 시작합니다. 주 : 화살표는 callose 강도 측정 (도 4b)에 사용되는 직사각형 도구를 나타낸다.
- callose 강도 (그림 4C)을 측정하기 위해 JPEG 파일 형식으로 저장된 상기 ImageJ에 도구 모음에서 "열기"서브 옵션, 오픈 현미경 사진 뒤에 "파일"옵션을 클릭합니다.
- 이마에 직사각형 아이콘을 클릭합니다geJ 도구 모음 (그림 4D).
- 상기 신호 세기를 분석하여 화면에 커서를 드래그하여 영역을 선택 검사한다 (도 4E)
- 측정 및 키보드 (그림 4E)의 'M'을 눌러 신호 강도의 수치를 기록한다. 참고 : 결과 파일은 별도로 (그림 4 층) 열립니다.
- 측정하고 강도가 각 공장 배경에서 모종의 모든 하나 하나 값을 기록한다.
참고 ImageJ에있어서, 그 결과 파일은 "평균"선택 "영역"의 신호 강도를 나타낸다.
- ImageJ에 결과 파일의 평균 값을 복사 및 정량 분석을 위해 스프레드 시트 파일에 붙여 넣습니다.
- 정량 분석을 위해, 표준 오차 막대 확률 값 (그림 4)을 포함하여 통계 테스트와 막대 그래프도합니다.
- 평균 신호 세기를 측정스프레드 시트의 "공식"도구 (그림 4 세대)를 사용하여 각각의 배경 (ImageJ에에서 의미).
- 스프레드 시트의 "공식"도구 (그림 4 세대)를 사용하여 각 측정에 대한 복제 사이의 표준 편차를 분석합니다.
- thespreadsheet "수식"도구를 사용하여 표준 오차 (SE)를 계산합니다.
(S)는 모집단의 표준 편차이고, (n)은 샘플의 크기 (관측 횟수)이고, SE의가 S / N √ 참고. - 평균 신호 강도와, 상술 한 바와 같이 계산 된 표준 오차 값에 t 테스트를 적용하여 결과의 중요성을 테스트한다.
- 그래픽 스프레드 시트 '삽입'도구 (그림 4H)를 사용하여 두 개의 서로 다른 배경의 callose 수준의 양적 차이를 나타 내기 위해 위의 값을 사용하여 막대 그래프 그림을 그립니다.
참고 : 강력한 후보의 돌연변이 / 과발현 줄 것들어떻게 다른 예를 더 callose, 작은 callose 또는 하이퍼 PD의 callose 축적으로 야생형에 비해 callose의 수준.
- 아닐린 블루 callose 염색 염료를 준비합니다.
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Representative Results
동형 접합 gsl8 T-DNA 삽입 돌연변이가 치명적인 18 모종대로 현재 설정에서 AtGSL8의 덱사메타손 (덱스) -inducible RNAi의 라인을 사용 하였다 [(+ 덱스 / -dex)가 dsGSL8을 이하]. dsGSL8 및 ±의 덱스 야생 유형 모종의 3 일 된 etiolated 모종은 phototropic 및 gravitropic 자극에 노출되었다. 우리는 dsGSL8 (+ 덱스) 모종 굴광성과 굴지성 (15)에 결함이있는 것으로 나타났다.도 5를 명확하게 dsGSL8이 (+ 덱스) 더 굴광성과 굴지성 모두의 영향을 받아 굽힘 전시 없다는 것을 보여줍니다. 또한, dsGSL8 (+ 덱스) 및 dsGSL8 (-dex) 또는 골 - 0 symplasmic 운동의 변화는 HPTS 로딩 분석에 의해 분석 하였다. 우리의 이전 연구 결과와 일치의 HPTS 염료 dsGSL8의 이동 (+ 덱스)는 dsGSL8 (-dex) 또는 골-0보다 실질적으로 더 광범위했다 그림에서와 같이> 6. Callose은 PD SEL의 주요 규제 기관 중 하나이며, AtGSL8는 PD의 callose 합성 효소 (16)로 알려져있다. 또한 callose 아닐린 블루 염색을 실시하고,도 7에 도시 된 바와 같이 dsGSL8 (+ 덱스) 지속적 전과 트로픽 반응 후 낮은 PD의 callose 수준을 보여 주었다.
phototropic 및 gravitropic 반응의 자극에 관여하는 단계의 그림 1. 플로우 차트. (A) 전송 수직으로 다른 식물의 배경을 하나의 판에 있지만 별도의 라인에서 모종을 재배. (B) 굴광성를 들어, 한면에 열 어두운 상자에 일방적 흰색 빛을 향해 직면하고있는 판을 유지한다. 굴지성를 들어, 첫 번째 회전, 90도를 알루미늄 호일로 접시를 포장하고, (어두운 상자 커버 ③ 전송디 모든면에서). 스캐너를 사용하여 (C)는, 같은 1.5 시간, 3 시간, 6 시간, 12 시간 등 시간의 다른 간격, 후 번호판을 검사합니다. (D 및 E)이 패널은 스프레드 시트 파일을 사용 ImageJ에 데이터 분석 데이터 생성을 보여, 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
ImageJ에 의한 굽힘 각도의 그림 2. 측정. (A)을 두 번 클릭하여 이미지 J 프로그램을 볼 수 있습니다. (B), 각도 측정에 사용 된 주요 도구. (C) JPEG 파일 형식으로 저장 한 현미경 사진을 열 수있는 이미지 J 도구 모음의 하위 옵션을 "열기"다음에 "파일"옵션을 엽니 다. (D (F) 개요 : 
ABC는 고정을 정의 A, 및 실제 굽힘 각도는 다음과 같이 계산된다 180과 동일하다 B, - 지점에서 B 지점까지의 거리를 나타내는 A. (G) 라인. (H) 연속성 라인의 AB를 다 결정을 가리 키도록 A. (I) 이미지 J 게재의 결과 파일 값입니다. (J) 스탠 평균 굽힘 각도 측정을 표시하는 대표적인 스프레드 시트 파일바 닥 편차, 표준 오차와 t-test를 계산. (K) 막대 그래프 다이어그램은 두 개의 다른 식물 배경 골-0 dsGSL8 EMS 변이체의 굽힘 각도 측정을 표시. 오차 막대는 SEM (평균 + 표준 오차)이며, *** T 테스트 (p 값> 0.001)로 의미를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
HPTS 로딩 분석에 관련된 단계를도 3 개요. HPTS 아가 블록의 제조 방법을 나타내는 (A) 패. (B) 패널은 절단 및 모종의 전송 및 HPTS 아가 블록의 로딩을 나타내는. (C) 샘플에 포함되어있는 단계를 표시 패널공 촛점 이미징을위한 준비. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
ImageJ에 의해 callose 강도의 그림 4. 측정. (A)을 더블 클릭하여 ImageJ에 프로그램을 볼 수 있습니다. (B)에 callose 강도 측정에 사용 된 주요 도구. (C) JPEG 파일 형식으로 저장 한 현미경 사진을 엽니 다 ImageJ에 도구 모음에서 "열기"서브 옵션 다음에 "파일"옵션을 엽니 다. (D) ImageJ에 도구 모음에서 사각형 아이콘입니다. (E)에 callose 강도를 분석하기위한 이미지의 선택된 영역. "평균"로 callose 강도 값을 표시 (F) ImageJ에 결과 파일. (G)평균 callose 강도 측정, 표준 편차, 표준 오차와 t-test를 계산을 표시하는 대표적인 스프레드 시트 파일. 두 식물 배경 사이의 callose 강도 차이를 나타내는 (H) 막대 그래프도. 오차 막대는 SEM (평균 + 표준 오차)이며, *** T 테스트 (p 값> 0.001)로 의미를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
AtGSL8 식의 그림 5. 감소는 열대 응답하자가에 연결됩니다. (A)가 Phototropic 응답 (덱스 ±) dsGSL8으로 나타났다과 함께 골-0. (B) (덱스 ±) dsGSL8으로 표시 Gravitropic 응답 등 옹 골-0. dsGSL8 (+ 덱스)와 함께. 더 phototropic 또는 gravitropic 응답을 보여줍니다 dsGSL8 (+ 덱스) 및 dsGSL8은 (-dex) 각각 덱사메타손 처리 및 치료 dsGSL8 -inducible RNAi의 라인을 상징한다. 스케일 바는 0.2 cm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. symplasmic 운동은 야생형 골-0과 함께 덱스 배축 절단면 ± dsGSL8에 HPTS 로딩 후 찍은 AtGSL8. 형광 이미지의 억제 후 증가했다. dsGSL8 (+ 덱스가) HPTS 염료의 더 광범위한 움직임을 보여 주었다 증가 시연 symplasmic 운동. 스케일 바는 0.2 mm를 나타냅니다.COM / 파일 / ftp_upload / 53513 / 53513fig6large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
라인을 억제 그림 7. AtGSL8은 배축의 조명과 음영면 사이의 대칭 PD의 callose 분포를 보였다. 0 시간에서 dsGSL8 (-dex)에 대한 아닐린 블루 callose 염색을 보여주는 (A) 형광 이미지입니다. 굴광성의 6 시간 후 dsGSL8 (-dex)에 대한 아닐린 블루 callose 염색을 보여주는 (B) 형광 이미지입니다. 굴광성의 6 시간 후 dsGSL8 (+ 덱스)에 대한 아닐린 블루 callose 염색을 보여주는 (C) 형광 이미지입니다. 노란색 화살표는 배축의 음영 지역에 callose 축적을 나타냅니다. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. (D)를시를 나타내는 막대 그래프도이전과 굴광성의 3 시간과 6 시간 후 PD의 (덱스 ±) dsGSL8에 축적 callose 배축의 ount. 형광 초점 강도가 열 독립적 인 배축에서 측정 하였다 (데이터는 SD ± 평균이다; 학생의 t-test를, * P <0.01). 이 그림은에서 수정되었습니다 (한 등의 알., 2014) 15. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 원고에서 전략으로 인해 따라서, PD SEL이 자세히 설명되어 변경된 PD의 callose과에 phototropic 및 gravitropic 응답에 결함이 돌연변이 / 과발현 라인을 화면합니다. PD callose의 합성 및 분해는 주로 callose 신타 제와 β-1,3- Glucanases함으로써 달성되지만, 이들 효소의 조절은 여러 요인에 의해 상향 조절된다. 이러한 상류 요인 또는 직접 PD 조절에 관여하는 후보를 검색하려면, 우리는 선별이 방법을 설정했습니다. 이 설정 PD의 callose 생합성 (gsl8)을 조절하는 몇 가지 주요 효소의 돌연변이가 15 치명적이며,이 설정에 의해 제한 될 것 같은 돌연변이를 분류하는 일부 제한 사항이 있습니다. 후보 유전자가 빠르거나 개폐 PD 함께 트로픽 느린 응답 보여 주지만 callose 레벨을 그대로 유지하는 경우에도, 그 다음의 상세한 분석은 또한 그러한 후보를 특성화하는데 필요하다. 중요한 요인 및 문제 해결 proce을각 단계에서 SSES도 정교하다. 먼저, 매체 제조에있어서, 식물 성장에 영향을 줄 수있는 중요한 인자는 5.7-5.8 범위한다 매체의 pH이다. 둘째, 아가 플레이트의 적절한 표면이 건조 중요하다; 높은 수분 함량과 한천 플레이트에서 어떤 손상없이 3 일 된 모종을 들어 올릴 어렵다. 그러나, 한천 판을 너무 많이 건조 배양하는 동안 매체에 일부 균열의 원인 및 비대칭 모종의 성장의 원인이 될 수 있습니다. 이 강한 표백제 같이 차아 염소산 나트륨 용액을 사용하여 종자의 표면 살균 동안, 보관, 멸균 된 DDH 2 O로 반복 세척하여 차아 염소산 나트륨을 완전히 제거하기 위해주의해야한다. 오래된 주식은 MS 판에 곰팡이 오염이 발생할 수 있습니다 멸균 DDH 2 O, 갓 준비하고 무균 적으로 처리해야합니다. 살균 한 후, 씨앗이 발아를 동기화하는 감기 치료에 의해 계층화된다. 이 프로세스는 트랜스페린 의해 수행 될 수 어느g 직접 어두운 조건이나 먼저 MS 판에 씨앗을 찍는하고 어두운 곳에서 추운 방에 접시를 전송 추운 방에 젖은 씨앗을 소독. 이 모종의보다 균일 한 성장을 제공하기 때문에, 우리는 후자를 선호한다. 씨앗을 찍는 동안 매우 밀접 점선 씨앗 후속 실험에 전송하는 것은 매우 어렵다 종묘 중첩의 성장을 초래하기 때문에, 두 개의 인접한 씨 사이의 거리가 적어도 0.1 cm이어야한다.
적절한 phototropic 및 gravitropic 응답을, 모종은 빛에 노출되지 않아야하고 손상을 유지해야한다. 식물이 녹색 빛에 반응하지 않는 흰색 빛의 배경 효과를 방지하기 위해 조심스럽게 어두운 방에서 녹색 광원에서 모종을 선택합니다. 녹색 광원 투명 녹색 비닐 시트를 사용하여 백색 광원을 피복함으로써 생성 될 수있다. 묘목을 선택, 멸균 이쑤시개은 최고의 선택이 될 것입니다. 번째 터치그들은 쉽게 새 플레이트로 전달 될 수 있도록 예를 이쑤시개로 배축의 매우 낮은 부분은 묘를 해제한다. 묘목의 모든 크기와 후크 방향에서 유사해야합니다. 실험 동안, 우리는 훅의 방향이 광원의 반대측에있는 경우, 식물이 광원과 같은 방향 후크 식물보다 빠른 응답을 보여 트로픽 것으로 보았다. 굴지성의 경우, 일반적으로 6-12 시간이 걸리는 반면 일반적 굴광성의 경우, 하나는, 3 시간 내에 참된 후보 골과 0 사이의 절곡 각도 명확한 차이를 볼 수있다. 마지막으로, 통계적으로 중요한 데이터, 세 생물학적 복제 20 모종마다 필요한 최소가있다.
이 정교한 도구와 장비를 필요로하지 않기 때문에 다른 식물의 배경 사이의 symplasmic 운동의 범위를 테스트하려면 HPTS 염료 로딩, 편리한 기술이다. HPTS로드 분석의 경우, g의 비율매우 부서지기 쉬운 또는 하드 젤 최적의 결과를 제공하지 않으므로 HPTS 아가로 오스 블록 엘은 매우 중요하다. 물 10 mL로 오스 비등하는 대용량 플라스크를 사용하는 이른바 고무 50㎖의 삼각 플라스크를 사용하지 않는 것이 좋다. 4 ℃에서 알루미늄 호일로 싸서 보관하면 HPTS 아가 블록을 제조 한 후 1 주일 동안 사용될 수있다. HPTS 로딩 분석에서 또 다른 주요 요인은 배축 후크 지역의 절제입니다. 절제는 날카로운 해부 가위와 모종의 모든 유사한 위치에서 수행되어야한다. 무딘 가위로 절단 모종에 불필요한 손상을 일으킬 수 HPTS 로딩을 방해 할 수 있습니다. callose 축적 마침내 염료 운동에 방해를 차지 이러한 변화에 응답하는 경향이기 때문에 또한, 묘목의 성장 조건 및 발달 단계는, 염료 운동에 중요한 역할을 할 수 있습니다. 따라서, 최적의 조건에서 모종을 성장하는 것이 필요하다. PD에서 Callose이에 중요한 역할을옥신 그라데이션 형성 (15)에 대한 중요 PD SEL을 조절함으로써 etiolated 모종의 열대 응답. Callose 레벨 아닐린 블루 또는 immunogold 라벨로 염색하여 검출 할 수있다. 아닐린 블루로 염색하면 callose 레벨을 검출하기위한 간단하고 신속한 방법이다. 배축 세포 높은 팽압 및 에피 큐티클 층을 가지고 있기 때문에, 색소 세포에 침투하기가 용이하지 않다. 따라서 아닐린 블루 염료가 쉽게 침투 할 수 있도록 절단 염색법을 개발 하였다. 그러나, 통상 callose 염색법의 한계 인 염색 결과를 새로운 영향을 미칠 수 callose 합성 우려가있다. 이러한 영향을 피하기 위해, 염색 프로토콜은 염색 버퍼로 callose 신타 아제 억제제 2-D 데 옥시 글루코오스 (DDG)를 가산함으로써 수정된다. 따라서,이 프로토콜은 완전히 절단 부위 아래의 배축 하부 영역에서 기존 callose의 측정을 포함한다. 갓 위해 준비 할의 사용을 피하십시오에드 아닐린 블루, 사용하기 전에 48 시간 이상 동안 RT에서 아닐린 블루 용액을 유지한다. 우리는 신선한 아닐린 블루 용액으로 염색하는 것이 최적의 callose 염색 결과를 제공하지 않는 것으로 나타났습니다.
전체적으로, 우리는 직접 또는 간접적으로 조절 된 PD callose 의해 PD의 SEL를 변경하여 결함 또는 향상된 트로픽 응답 돌연변이 / 과발현 라인의 신속한 스크리닝에 사용될 수있는 전략 세트를 제안 하였다. 열대 응답에 대한 이전 사실 majorly 같은 PINIOD 2-14로 옥신 캐리어 및 신호 플레이어의 행동에 제한되었다. 또,도 15 배축 시스템에서 옥신 구배를 유지 옥신의 symplasmic 운동의 중요한 역할을 확립 하였다. 이 방법의 단순성과 기능성은 의심 할 여지없이하여 열대 응답을 포함하여 식물 개발에 중요한 역할을, 연주, PD SEL 자신의 규제 후보 유전자 조사에서 자사의 유틸리티를 강화한다.
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Disclosures
저자는 더 공개가 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 한국 연구 재단 (NRF-2015R1A2A1A10053576)에서 지원하고, 차세대 BioGreen 21 프로그램에서 연구비 (SSAC는 PJ01137901을 부여), 농촌 진흥청, 대한민국. RK, WS, ABB와 DK는 두뇌 한국 21 플러스 프로그램 (BK21 +)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt) | Sigma | H1529-1G | Fluorescent dye as symplasmic tracer |
| LE Agarose | Dongin-Genomic | GEL001-500G | Used for HPTS agarose block |
| Microwave oven | LG-Goldstar | Machine for boiling agarose gel | |
| 100 ml glass conical flask | Dong Kwang | A0205 | Used to boil HPTS agarose gel |
| Petri dish (35 mm x 10 mm) | SPL life sciences | SPL10035 | Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples |
| Microscope cover slides and glass slides (24 mm x 50 mm) | Marienfeld Laboratory Glassware | 101222 | Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation |
| MS medium plates 125 mm x 125 mm x 20 mm | SPL life sciences | SPL11125 | Plates to make MS agar medium |
| Scissors | Germany Stainless | HSB 942-11 | Used to excise hook region of plant samples |
| Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture | Duchefa | P10453.01 | MS medium including vitamins. |
| (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate | Bioshop | 3G30212 | To make MS media. |
| Plant agar | Duchefa | P1001.1000 | To solidify MS media. |
| Autoclave | ALP | CL-40L | |
| Shaker | Wise Mix | SHO-1D | To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way. |
| 1 ml Blue tips | Sorenson | 10040 | |
| 1 ml pipette | BioPette | L-1101-2 | |
| Surgical tape | MIcropore | 1530-0 | To seal the MS plate |
| Aniline blue (Methyl blue) | Sigma | M5528-25G | Used to prepare aniline blue staining buffer. |
| Glycine | Bioshop | GLN001 | Used to prepare aniline blue staining buffer. |
| DDG | Sigma | D8375-1G | Used for the inhibition of callose synthases. |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000MPE SIM | To check aniline blue staining and HPTS dye loading result. |
| Stirrer | I lab | K400 | To mix media solution. |
| Aluminium foil | SW cooking foil | To wrap plates in a dark condition. | |
| Sodium hypochlorite | Samjin Industry | To surface-sterilized seeds |
References
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