一种验证胼胝质介导的胞间连丝门控在向性反应中作用的策略

摘要

本文介绍了筛选控制质体连丝通透性及向性反应中生长素梯度相关基因的方法，包括子叶下胚轴向性反应程度的测定 的 拟南芥 通过8-羟基芘-1,3,6-三磺酸（HPTS）染料加载检测胞间连丝通透性，最后评估胼胝质水平。

摘要

植物激素生长素在多种生长和发育过程中发挥着重要作用，包括对光和重力的向性反应。生长素梯度的建立是导致向光性和向重性反应的关键事件。以往研究表明，生长素的极性运输（PAT）可在植物不同细胞区域中建立生长素梯度。然而，Han et al. 最近证明，为了正确形成生长素梯度，胞间连丝中胼胝质介导的共质体连通性在相邻细胞之间也是一个关键因素。本文讨论了一种研究特定基因功能的策略，这些基因可通过调控胞间连丝胼胝质的合成来改变共质体连通性，从而影响向光性和向重性反应。第一步是将突变体或某基因过表达株系与野生型材料一起，筛选3日龄黄化幼苗中异常的向性反应。这一初步筛选有助于鉴定出一系列在生长素极性运输或调控共质体连通性中起作用的基因。第二轮筛选则聚焦于那些通过影响共质体连通性而表现出向性反应改变的候选基因。为验证这些候选基因，需检测共质体示踪剂的移动情况以及胞间连丝处胼胝质的沉积水平。该策略将有助于发现新的候选基因，这些基因可在向性反应及其他发育过程中直接或间接地调控共质体连通性。

引言

植物作为固着生物，已进化出高度复杂的细胞间信号传导网络，以应对各种环境刺激。向性反应是植物响应环境刺激的现象之一。植物主要表现出两种向性反应：向光性和向重力性。光合植物通过向光性朝向光源弯曲，以获取最大能量。同样，向重力性使植物朝向地心引力方向生长。引发此类向性反应的基本机制涉及植物激素生长素的不对称梯度形成¹局部生长素梯度形成的机制已有充分表征；参与该机制的基因为激素作用提供了分子路径图^2-8生长素外排载体（如PIN-FORMED（PIN）蛋白和P-糖蛋白）在细胞中的特定定位决定了生长素从供体细胞的细胞质向细胞壁的转运。^9,10此外，通过活性H⁺/IAA 共同转运活性的生长素输入载体（如 AUX1/LAX 家族蛋白）将生长素最终传递至相邻的受体细胞^2,11,12这种生长素的定向运输被称为极性生长素运输（PAT）。PAT 在不同发育阶段以及响应各种环境刺激时，可导致生长素的差异性分布。^13,14此外，任何一种生长素输入或输出载体的定位或表达发生紊乱，都会导致极性运输（PAT）的严重改变，进而破坏生长素浓度梯度，引起发育缺陷。最近，Han 等报道称，胞间连丝的调控对于维持生长素梯度也是必需的¹⁵迄今为止，已鉴定出30多种胞间连丝蛋白¹⁶在这些蛋白中，AtGSL8 被报道为在胞间连丝（PD）处介导胼胝质合成的关键酶，因此在维持胞间连丝大小排阻极限（SEL）方面发挥着至关重要的作用。受抑制 AtGSL8 表达导致生长素梯度模式发生扭曲，与野生型幼苗相反，无法产生向性反应¹⁵.

本文提供了探索参与胞间连丝（PD）调控的新的候选基因的方法。以AtGSL8作为模型蛋白来验证这些方法，因为它是参与PD胼胝质生物合成的关键酶。由于gsl8基因敲除突变体具有幼苗致死性¹⁷，因此根据先前发表的研究¹⁵，采用了地塞米松（dex）诱导型RNA干扰（RNAi）株系。本文提供的策略可适用于筛选参与由PDSEL调控的下胚轴向性反应的相关基因。

方案

1. 筛选光向性与重力向性反应异常的突变体

1. 实验前一天配制含0.8%琼脂的1×Murashige和Skoog（MS）培养基，pH 5.7。
   1. 向一个 2 L 锥形瓶中加入 800 ml 双蒸水，并用磁力搅拌子搅拌。
   2. 向锥形瓶中加入 4.4 g MS 盐。
   3. 加入0.5 g 2-(N-吗啉)乙磺酸（MES），搅拌至所有盐完全溶解。
   4. 用1 M KOH将培养基的pH值调节至5.7。
   5. 将培养基转移至量筒中，并用ddH₂O定容至1 L₂O.
   6. 将培养基倒回2 L锥形瓶中，加入8 g植物琼脂。
   7. 用铝箔将锥形瓶口紧密包裹。
   8. 高压灭菌 MS 培养基和 ddH₂O₂O 孵育 15 分钟 121 °C，15 psi，灭菌后，将培养基置于 60 °C 培养箱和ddH₂O₂室温下，O。
   9. 冷却至 60 °C，将培养基倒入125 x 125 x 20 mm的培养皿中³ 在层流工作台上将方形培养皿（每皿50 ml）放置。
   10. 在室温下静置培养皿约1小时，使琼脂凝固，期间保持培养皿部分敞开。若不立即使用，可用塑料薄膜密封后储存于 4 °C 在冰箱中。
2. 用1.1%次氯酸钠对种子进行表面灭菌，并将种子点种于1.1节中制备的1×MS琼脂平板上。
   注意：此处， 拟南芥 {Col-0 种子，dsGSL8（Col-0)}¹⁵ 用于向性反应、胼胝质染色和HPTS负载。 拟南芥 {Col-0 和 dsGSL8（Col-0EMS突变体种子（未发表）用于向性反应研究 图2.
   1. 将 300 ml ddH₂O 高压灭菌₂瓶中的氧。
   2. 每种遗传背景加入约一百粒种子， 即， 突变/过表达株系与野生型（Col-0) 种子加入 1.5 ml 微型离心管中。
   3. 从1x MS琼脂平板中取出 4 °C 冰箱中并在层流台中保持半开状态干燥。
   4. 用1 ml 0.2倍稀释的次氯酸钠溶液（1.1% 次氯酸钠）对种子进行表面灭菌，将微量离心管置于摇床中，250 rpm振荡5分钟。
   5. 让种子依靠重力沉降至底部，然后用微量移液器吸除次氯酸钠溶液。
   6. 加入1 ml新鲜的ddH₂O₂将 O（已高压灭菌）加入种子中，通过反复倒置微量离心管数次充分混匀。让种子再次沉降后，移去上清液。
   7. 重复步骤 1.2.6 五到六次。
   8. 加入的水量为最后一次洗涤后剩余种子体积的两倍。
   9. 用装有1 ml微量移液器吸头的无菌种子点样于半干燥的1x MS琼脂平板上 200 µl 种子（包括水分）
      1. 保持两粒种子之间约0.1 cm的距离，两行种子之间的距离至少为1.8 cm。在每个方形培养皿（125 × 125 × 20 mm）中，将种子点成五行水平排列。³）。在将盖子盖到培养皿上之前，让水分稍微干燥。
   10. 用手术胶带密封板，将所有板垂直叠放，并用铝箔包裹。
   11. 将包好的培养皿转移至暗盒中（避光）。然后，将暗盒置于 4 °C 室温/冰箱中放置3天。
   12. 从这一步开始，保持培养皿的方向不变。经过3天的低温处理后，将暗盒置于植物培养室中 22 °C 接下来的3天内。3天后，在暗室中用绿光检查种子的萌发状态。
       注意：通常为3日龄 Col-0 黄化幼苗的长度可生长至1.6 cm。
3. 分析特定基因突变体或过表达株系中向光性和向重力性反应的变化。在暗室中绿色光下选择大小相近且直立生长的幼苗。用灭菌牙签尖端将选好的幼苗转移至新的1x MS琼脂平板上。
   1. 轻轻选取幼苗下胚轴最底部的位置，避免触碰其他任何部位。确保所有幼苗的子叶/弯钩朝向一致，转移后仍保持幼苗弯钩的相同朝向。每次时间点每行至少使用20株每种遗传背景的幼苗，且每个时间点至少设置两块培养板用于后续分析。
      注：每块培养板可比较四种不同的背景（4行）。
      可选：在使用地塞米松（dex）诱导型RNAi/过表达品系时，将上述幼苗转移至1x MS培养基平板，同时转移至含dex的MS平板（培养基含1x MS、0.8%琼脂并补充 20 µM 在黑暗盒子中垂直放置培养板，孵育3小时。
   2. 为检测向光性反应，将上述平板垂直转移至一个仅一侧开口的黑色盒子中。将装有平板的黑色盒子转移至具有单向白光的植物培养室中。为确保单侧光照，应将平板的边缘朝向光源放置（而非平板的正面）。参见图示装置。 图1.
   3. 同样，为检测向重力性反应，将转移了幼苗的培养皿保持垂直放置，并用铝箔包裹。随后，将培养皿的朝向垂直旋转180° 90° 并将其置于四周遮光的黑色盒子内。参考装置设置如 图1.
   4. 在指定时间点（通常为 1.5 小时、3 小时、6 小时和 12 小时）后，使用扫描仪扫描培养板，并将图像以 JPEG 格式保存。
   5. 使用 ImageJ 软件（http://imagej.nih.gov/ij/index.html）测量幼苗的弯曲角度图2).
      1. 双击启动 ImageJ 程序图2A).
         注：角度测量中使用的主要工具如图所示 图2B.
      2. 单击 ImageJ 工具栏中的“file”选项，然后选择子选项“open”，打开以 JPEG 文件格式保存的图片，以测量向性弯曲角度（图2C).
      3. 单击放大工具，分别通过点击鼠标左键或右键来放大或缩小图片，如图所示。 图2B.
      4. 单击滚动工具以拖动和定位图片（图2D）。接下来，点击角度工具以测量弯曲角度（图 2E).
         1. 在原始下胚轴生长方向点“a”处双击左键，拖动鼠标至弯曲起始点“b”图2F），单击鼠标左键绘制第一条线（图2G).
         2. 从点 b 拖动鼠标至弯曲终点 c，单击左键绘制第二条线图 2H）并形成固定 A. 注意：真实弯曲角度为 B，其值等于 180°-A.（图2F).
         3. 测量并记录 按键盘上的“M”键。结果文件将单独打开，如图所示 图 2I逐一测量并记录所有幼苗的数据。例如，首先测量所有下胚轴的弯曲角度 Col-0 然后对突变品系进行相同操作。
   6. 将数据集从 ImageJ 转移到电子表格文件，以计算每个背景的弯曲角度平均值。
   7. 用于定量分析，绘制带有统计检验结果的柱状图，包括标准误差条和概率值（参见 图2).
      1. 计算真实弯曲度 B，并使用电子表格设计公式， 即， B = 180°-A. 注意： A 是通过 ImageJ 分析得出的数值。
      2. 测量平均弯曲角度 B 使用电子表格工具对每种背景进行分析（图2J).
      3. 使用电子表格的“公式”工具分析每次测量重复样本之间的标准差图 2J).
      4. 使用上述计算得到的平均弯曲角度和标准差值进行 t 检验，以评估结果的显著性。
      5. 使用电子表格的“插入”工具，根据上述数值绘制柱状图，以图形化方式表示两种不同背景下弯曲角度的定量差异图 2K).
         注意：强候选基因的突变体/过表达株系应表现出与野生型明显的差异，例如无弯曲、快速弯曲或缓慢弯曲。

2. 利用胞间连丝胼胝质水平改变导致的胞间连丝通透性（PD SEL）缺陷筛选向性反应异常的植物品系

1. 通过在幼苗顶端放置HPTS琼脂糖块，对8-羟基芘-1,3,6-三磺酸（HPTS）染料进行下胚轴加载实验，并比较突变体/过表达株系间染料的运输情况 Col-0.
   1. 为下胚轴加载实验制备 HPTS 琼脂糖块。
      1. 取 10 ml ddH₂O₂在50 ml锥形瓶中加入O，并加入0.1 g琼脂糖以制备1%琼脂糖凝胶。将琼脂糖在微波炉中加热煮沸1–2分钟，期间间歇振荡，随后静置冷却5分钟。
      2. 将50 mg HPTS加入10 ml 1%琼脂糖溶液中，充分混合直至溶液变为绿色。
      3. 将上述混合物倒入10 mm的培养皿中，静置15分钟使其凝固。
      4. 用锋利的解剖刀将凝固的HPTS琼脂糖切成小块琼脂糖块（0.5 × 2 cm）²).
   2. 为HPTS染料负载实验准备植物样品。
      1. 设置HPTS染料负载实验平台；放置一片显微镜盖玻片（24 × 50 mm）²) 转移至一块新的MS培养基平板上，如图所示 图 3A.
      2. 使用锋利的手术剪从弯钩基部切下生长3天的黄化幼苗。
      3. 立即将上述幼苗（每种遗传背景至少5株幼苗）转移至显微镜盖玻片表面，使切除位置以下仅保留0.5 cm的下胚轴在盖玻片上，其余部分下胚轴接触培养基，如图所示 图3B.
      4. 将HPTS琼脂糖块置于下胚轴（已切除钩状结构）之上，持续5分钟，使切除部位与HPTS琼脂糖块接触。
      5. 加载5分钟后，将琼脂糖块从下胚轴表面移除，然后将下胚轴转移至含有ddH₂O的10 mm培养皿中₂O 并用 ddH₂O 清洗下胚轴₂O 培养 15 分钟，持续振荡。
   3. 共聚焦显微镜样品制备
      1. 从每种遗传背景下至少选取5株幼苗，用于共聚焦激光扫描显微镜观察。
      2. 在激光通道中，将激发波长设置为488 nm，发射波长设置为500至550 nm的带通范围。
      3. 将幼苗分为两组转移（一组 Col-0 + 一个突变体）在用ddH₂O洗涤后转移至新的显微载玻片₂O. 加入100-150 µl 向载玻片上滴加双蒸水，并加盖盖玻片。将载玻片移至共聚焦显微镜的载物台上。
      4. 使用明场（白光）照明，用20倍或40倍物镜对下胚轴区域进行聚焦。然后，扫描玻片以观察荧光。
      5. 至少拍摄10组图像，并通过比较染料从加样点扩散的程度来评估两种背景的差异。
         注：与野生型相比，胞间连丝运动发生改变的突变体/过表达株系会表现出不同的染料加载模式 Col-0.
2. 分析在光向性与重力向性反应发生改变、且HPTS染料移动模式与对照相比存在显著差异的突变体/过表达株系中的胼胝质水平 Col-0.
   1. 制备苯胺蓝胼胝质染色液。
      1. 配制 1 M 甘氨酸（pH 9.5）和 0.1%（W/V）苯胺蓝，溶于高压灭菌的 ddH₂O 中₂O.
      2. 通过将0.1%苯胺蓝与1 M甘氨酸按2:3的体积比混合配制染色缓冲液。例如，配制50 ml染色缓冲液时，取20 ml 0.1%苯胺蓝和30 ml 1 M甘氨酸。注意：染色缓冲液需至少在使用前48小时配制，并避光保存。
   2. 用特异性结合胼胝质的苯胺蓝染料对弯曲或非弯曲的幼苗进行染色。
      1. 为了抑制 从头合成 在染色过程中为抑制胼胝质合成，向50 ml染色缓冲液中加入终浓度为1.5 mM的2-脱氧-D-葡萄糖（DDG）。
      2. 取3日龄黄化幼苗进行胼胝质染色（可选是否具有向性反应）。
      3. 使用精细的外科剪刀从幼苗的钩状区域进行切割。
      4. 用牙签尖端将幼苗转移至含有2 ml染色缓冲液的小型培养皿中。
      5. 在黑暗条件下，将幼苗与染色缓冲液在30 rpm持续振荡孵育2小时。
      6. 染色后，用ddH₂O洗涤幼苗₂O 孵育 2 分钟以去除多余的染色缓冲液。
      7. 为每种植物背景至少选择5株幼苗，用于共聚焦激光扫描显微镜下的观察。
   3. 为共聚焦显微镜制备样品：
      1. 将第一组中的幼苗转移 Col-0 + 一个突变体）用于在用ddH₂O洗涤后清洁显微镜载玻片₂O.
      2. 加入100-150 µl 去离子水₂O，并用盖玻片覆盖。将玻片转移至共聚焦显微镜的载物台上。
      3. 在激光通道中，将激发波长设置为405 nm，发射波长设置为500至550 nm，用于成像苯胺蓝荧光。
      4. 使用明场（白光）照明，先用10倍物镜，再用20倍或40倍物镜将下胚轴区域调至清晰对焦。
      5. 然后，打开滤光光源，扫描载玻片上的荧光信号，并保存图像。
      6. 使用 ImageJ 软件（http://imagej.nih.gov/ij/index.html）测量胼胝质信号强度（参见 图 4).
         1. 将共聚焦显微镜图像从 Olympus Image Binary 格式（*.oib）转换为 JPEG 格式。注意：ImageJ 软件仅支持 JPEG 格式。
         2. 双击启动 ImageJ 程序图4A）。注意：箭头指示用于胼胝质强度测量的矩形工具（图4B).
         3. 单击 ImageJ 工具栏中的“file”选项，然后选择子选项“open”，打开以 JPEG 文件格式保存的显微图像，以测量胼胝质强度（图4C).
         4. 单击 ImageJ 工具栏上的矩形图标（图 4D).
         5. 为分析信号强度，将光标拖动至图像上并选择待检测区域（图4E)
         6. 按键盘上的“M”键，测量并记录信号强度的数值图4E）。注意：结果文件将单独打开（图4F).
         7. 逐一测量并记录每种植物背景下的所有幼苗的强度值。
            注意：在 ImageJ 中，结果文件中的“Mean”表示所选“Area”的信号强度。
      7. 将 ImageJ 结果文件中的平均值复制，并粘贴至电子表格文件中进行定量分析。
      8. 用于定量分析，绘制带有统计检验的柱状图，包括标准误差条和概率值（图4).
         1. 使用电子表格中的“公式”工具，测量每个背景的平均信号强度（来自 ImageJ 的平均值）图4G).
         2. 使用电子表格的“公式”工具分析每次测量重复样本之间的标准差图 4G).
         3. 使用电子表格的“公式”工具计算标准误（SE）。
            注：SE = s/√n, 其中（s）为总体的标准差，（n）为样本的大小（观测值数量）。
         4. 使用上述计算得到的平均信号强度和标准误值进行 t 检验，以评估结果的显著性。
         5. 使用电子表格的“插入”工具，根据上述数值绘制柱状图，以图形化展示两种不同背景下胼胝质水平的定量差异图 4H).
            注：强候选基因的突变体/过表达株系与野生型相比，胼胝质水平会表现出差异，例如无胼胝质、胼胝质极少或胞间连丝处胼胝质过度积累。

结果

在当前实验设置中，使用了地塞米松（dex）可诱导的AtGSL8基因RNAi株系[以下简称dsGSL8 (+dex/-dex)]，因为纯合的gsl8 T-DNA插入突变体在幼苗期即致死¹⁸。将dsGSL8株系和野生型幼苗在有无dex条件下培养至3日龄，进行黄化幼苗处理后，施加向光性和向重力性刺激。我们发现，dsGSL8 (+dex)幼苗在向光性和向重力性反应中均存在缺陷¹⁵。图5清楚显示，dsGSL8 (+dex)幼苗在向光性和向重力性刺激下均未出现弯曲现象。此外，通过HPTS染料加载实验分析了dsGSL8 (+dex)、dsGSL8 (-dex)以及Col-0中胞间连丝介导的共质体运输变化。结果与我们先前的研究发现一致，如图6所示，dsGSL8 (+dex)中HPTS染料的扩散范围显著...

讨论

本文详细描述了一种筛选因胞间连丝（PD）胼胝质改变进而导致PD选择透过性（SEL）异常，从而在向光性和向地性反应中表现缺陷的突变体或过表达株系的策略。PD胼胝质的合成与降解主要由胼胝质合酶和β-1,3-葡聚糖酶完成，但这些酶的调控受到多种上游因子的影响。为了寻找直接参与PD调控的上游因子或候选基因，我们建立了该筛选方法。该方法存在一定局限性，例如调控PD胼胝质生物合成的关键酶基因突变体（如gsl8）具有致死性¹⁵，因此该筛选体系难以获得此类突变体。此外，若候选基因在导致PD开放或关闭的同时，引起更快或更慢的向性反应，但胼胝质水平未发生变化，则需要进一步进行详细分析以表征此类候选基因。本文还详细阐述了各步骤中的关键因素及问题排查方法。首先，在培养基制备过程中，影响植物生长的关键因素之一是培养基的pH值，应控制在5.7–5.8之间。其次，琼脂平板表面的适当干燥至关重要；若琼脂平板含水量过高，则难以无损伤地挑取3日龄幼苗。然而，若琼脂平板干燥过度，可能在培养过程中导致培养基开裂，从而引起幼苗生长不对称。在使用次氯酸钠溶液对种子进行表面灭菌时，必须通过反复使用高压灭菌的ddH₂O清洗...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HPTS（8-羟基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐）	Sigma	H1529-1G	作为共质体示踪剂的荧光染料
LE琼脂糖	Dongin-Genomic	GEL001-500G	用于制备HPTS琼脂糖块
微波炉	LG-Goldstar		用于煮沸琼脂糖凝胶的设备
100 ml玻璃锥形瓶	Dong Kwang	A0205	用于煮沸HPTS琼脂糖凝胶
培养皿（35 mm × 10 mm）	SPL life sciences	SPL10035	用于制备HPTS琼脂糖块及清洗植物样品
显微镜盖玻片和载玻片（24 mm × 50 mm）	Marienfeld Laboratory Glassware	101222	用于HPTS琼脂糖块及显微样品制备
MS培养基平板（125 mm × 125 mm × 20 mm）	SPL life sciences	SPL11125	用于制备MS琼脂培养基的平板
剪刀	Germany Stainless	HSB 942-11	用于切除植物样品的钩状区域
Murashige和Skoog（MS）基础盐混合物	Duchefa	P10453.01	包含维生素的MS培养基。
（N-吗啉代）乙磺酸（MES）一水合物	Bioshop	3G30212	用于配制MS培养基。
植物琼脂	Duchefa	P1001.1000	用于固化MS培养基。
高压灭菌器	ALP	CL-40L
摇床	Wise Mix	SHO-1D	用于轻柔地洗去苯胺蓝染色缓冲液和HPTS染料。
1 ml蓝色吸头	Sorenson	10040
1 ml移液器	BioPette	L-1101-2
医用胶带	MIcropore	1530-0	用于密封MS平板
苯胺蓝（甲基蓝）	Sigma	M5528-25G	用于配制苯胺蓝染色缓冲液。
甘氨酸	Bioshop	GLN001	用于配制苯胺蓝染色缓冲液。
DDG	Sigma	D8375-1G	用于抑制胼胝质合酶。
共聚焦显微镜	Olympus	FV1000MPE SIM	用于检测苯胺蓝染色和HPTS染料加载结果。
搅拌器	I lab	K400	用于混合培养基溶液。
铝箔	SW cooking foil		用于在避光条件下包裹培养板。
次氯酸钠	Samjin Industry		用于种子表面灭菌