Summary
本文介绍了筛选基因控制的热带响应期间plasmodesmal渗透性，因此生长素梯度的方法。这包括在胚轴热带反应程度的测量 拟南芥和8羟基芘-1,3,6-三磺酸（HPTS）装载终于胼胝质水平评估检查plasmodesmal渗透性。
Abstract
植物激素生长素起着许多生长和发育过程，包括对光和重力热带反应中起重要作用。生长素梯度的建立是导致向光性和向地关键事件。先前，生长素极性运输（PAT）的结果表明在植物中的不同蜂窝结构域建立生长素梯度。然而，韩等人最近证明为正确生长素梯度的形成，在相邻小区之间plasmodesmal胼胝质介导的共质体连通也是一个关键的因素。在此手稿，策略阐明特定基因，其中可通过改变通过调制plasmodesmal胼胝质合成的共质体连通影响向光性和向地的作用，进行了讨论。第一步是筛选从突变体或基因的过表达的行3天龄的黄化苗异常嗜应答与野生型一起。这初步筛选可导致一系列基因PAT功能或控制共质体连通的识别。第二次筛选涉及候选人，显示通过影响共质体连通改变热带响应的排序。为了解决这样的候选人，一个共质体示踪剂的运动和plasmodesmal胼胝质的沉积进行检测。探索新的候选基因可以在热带的反应和其他发育过程直接或间接调节共质体连通这一战略将是有益的。
Introduction
植物，如固着活的生物体，已经开发了细胞 - 细胞信号传导的高度复杂的网络，以解决各种环境刺激。热带反应是由植物对环境刺激作出反应的现象之一。植物显示出两个主要的热带响应，向光性和向地。光合植物朝向光源通过弯曲向光性收获最大的能量。同样地，向重力使植物朝向重心生长。导致这些热带反应的基本机制涉及到植物激素生长素1的不对称形成梯度。当地生长素梯度的形成的行为被很好地表征;所涉及的这种机制的基因提供激素作用2-8的路线图。生长素流出载体，如个人识别码形成的（PIN）和P糖蛋白的特定位置，从细胞质到供体细胞9,10的细胞壁执行生长素的运动。 Furthermore，通过将活性的 H + / IAA同向转运生长素涌入载体，如AUX1 / LAX家族蛋白的活性，生长素最终递送到邻近的接收器单元2,11,12。生长素的这个方向的运动被称为极性生长素输送（PAT）。 PAT中各个发育阶段以及响应于不同的环境刺激13,14导致差分生长素分布。此外，在任何这些生长素流入或流出的载体的定位或表达的破坏导致的PAT严重改变，这会导致生长素梯度的破坏，导致发育缺陷。近日，韩寒等人 。报告说plasmodesmal调节也有必要保持生长素梯度15。迄今为止，已有30 plasmodesmal蛋白质已经确定了16个 。在这些蛋白质，AtGSL8已被报告为在胞间连丝（PD），用于胼胝质合成的关键酶，因此起着MAINT至关重要的作用癌宁对PD尺寸排阻极限（SEL）。压抑AtGSL8表达导致扭曲的生长素梯度图案导致在对比野生型幼苗15没有嗜响应。
在这份手稿，方法，探索参与PD调控提供了新的候选基因。 AtGSL8用作模型蛋白来测试这些方法，因为它是促进PD胼胝质的生物合成的关键酶。由于gsl8敲除突变体17秧苗杀伤力，地塞米松（DEX）诱导型的RNAi线按照使用了与以前公布的报告15。这里提供的策略可适于筛选了在用PD SEL受控胚轴嗜响应牵连的基因。
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Protocol
1突变体筛选与改变向光性和向重力响应
- 制备1×Murashige和Skoog（MS）培养基，pH值5.7，用0.8％的琼脂一天实验之前。
- 加800毫升双蒸水至一个2升的锥形烧瓶中，并用磁力棒搅拌。
- 4.4克MS盐添加到锥形瓶中。
- 加入0.5克2-（N-吗啉代）乙烷磺酸（MES），搅拌直到所有的盐的完全溶解。
- 调整培养基至5.7用1M KOH的pH。
- 介质传送到海量缸和使终体积到1L的DDH 2 O
- 倒回介质到2升锥形瓶中，加入8克植物琼脂。
- 用铝箔紧紧包裹锥形烧瓶口。
- 高压灭菌的MS培养基和DDH 2 O的15分钟，在121℃，15磅，和高压灭菌后，保持介质，在60℃培养箱和DDH 2 O的室温。
- 冷却至60℃之后，倒入介质成125×125×20mm的3方板的层流长凳上（50毫升每块板）。
- 允许琼脂通过保持所述板部分打开在RT固化约1小时。如果板被不立即使用，通过在冰箱用保鲜膜和储存在4℃下密封。
- 表面消毒用1.1％的次氯酸钠的种子点在1.1节制备的1倍MS琼脂平板上的种子。
注：在这里， 拟南芥 {Col-0中的种子，dsGSL8（Col-0中 ）} 15用于热带响应，胼胝质染色和HPTS装载拟南芥 {Col-0中和dsGSL8（Col-0中 ）EMS突变}种子（。未公布的）被用于在图2中嗜响应。- 高压灭菌300毫升的DDH 2 O的瓶子。
- 添加大约为一百种子为每个背景， 即突变体/过表达系与野生型（Col-0中 ）种子，到1.5ml微量离心管中。
- 取出从4℃的冰箱1倍的MS琼脂平板上，在部分打开位置晾干层流工作台上。
- 通过加入1ml的0.2×漂白溶液（1.1％次氯酸钠）的表面消毒的种子，并保持在微量离心管在摇床上以250rpm进行5分钟。
- 让种子通过重力沉在底部，然后取出用微量漂白粉溶液。
- 加入1毫升的新鲜的DDH 2 O（灭菌）的种子并颠倒离心管数次拌匀。让种子再次沉降，然后除去水分。
- 重复步骤1.2.6 5-6倍。
- 水双倍量加入到最终洗涤之后被留下的种子的体积。
- 点上使用含有200微升的种子1毫升微量移液器尖端的半干燥1倍的MS琼脂平板上的消毒的种子（在cluding水）。
- 保持两个种子和至少两种行之间1.8厘米之间约0.1厘米的距离。圆点每平方板（125×125×20mm的3）五横行的种子。让水将盖到前盘稍干。
- 密封采用外科胶带板，堆栈中的所有板垂直，并用铝箔包裹。
- 转移包裹板，以暗箱（没有进入光）。然后，保持暗箱在4℃的室温/冰箱3天。
- 从该步骤开始，保持板不变的方向。经过冷处理3天，保持在22℃，植物培养室在接下来的3天暗箱。 3天后，检查在黑暗的房间在绿灯种子的发芽状态。
注：通常3日龄的Col-0黄化苗可长到1.6厘米长。
- 分析改变向光性一个在突变体或过度表达的特定基因的线十二次向地响应。在黑暗的房间中选择下绿灯只有同样大小和垂直生长的直苗。传送所选苗使用杀菌牙签的前端的新鲜的1X MS琼脂板上。
- 轻轻地选择自己的下胚轴的最低部分秧苗时不接触任何其他部分。确保所有的苗木具有相同的子叶/挂钩方向，转让后，即苗挂钩的方向保持不变。使用最少20苗每行中的每个背景和用于进一步分析每个时间点至少两个板组成。
注意：四种不同的背景可以在每个板（4行）进行比较。
可选：在使用地塞米松（DEX）诱导型的RNAi /过表情纹，上面的苗转移到1X MS与+ DEX MS板块沿（含有1x MS板，0.8％琼脂培养基中添加20μMDEX）FOR 3小时，并在暗箱保持垂直板。 - 要检查趋光反应，垂直转移上述板到黑匣子只开了一边。包含板的黑盒单侧白光转移到植物生长室。以确保单侧光，将朝向光源（未前侧）的板的边缘。指设置在图1中。
- 同样，检查向地反应，保持与平板转移苗垂直，并用铝箔覆盖。其次，改变垂直板方向90度，并保持它从四面八方覆盖的黑盒子里面。指设置在图1中。
- 在给定的时间点后，（通常为1.5小时，3小时，6小时和12小时）扫描所述板用扫描器，并保存在JPEG格式的图片。
- 测量使用ImageJ软件（http://imagej.nih.gov/ij/index.html）幼苗的弯曲角度（ 图URE 2）。
- 启动通过双击（ 图2A）的ImageJ的程序。
注意：在角度测量中使用的主要工具是图2B所示。 - 点击“文件”选项后面的子选项“打开”ImageJ的工具栏，并保存在JPEG文件格式来衡量热带弯曲角度（ 图2C）打开图片。
- 点击放大镜工具，通过点击鼠标左右键，分别如图2B所示放大或缩小图片。
- 点击滚动工具拖动和放置图像（ 图2D）。接下来，单击角度工具来测量弯曲（ 图2E）的角度。
- 使原始胚轴生长方向点'A'，拖动鼠标弯曲起始点'B'（ 图2F），然后单击左屁股左键双击上绘制的第一行（ 图2G）。
- 从b点鼠标拖动到弯曲结束点“C”，并单击左键绘制第二行（ 图2H）和形成固定
A.注意：真正的弯曲角 B，它等于180° - A.（ 图2F）。 - 测量和记录通过按下键盘上的'M'A。 如图2I结果文件将单独打开。测量和一个记录所有苗木之一。例如，第一测量对于所有从Col-0中的下胚轴的弯曲角度，然后为突变品系。
- 启动通过双击（ 图2A）的ImageJ的程序。
- 从ImageJ的转移数据集电子表格文件，使AV弯曲每个后台的角度erage。
- 进行定量分析，使用统计测试结果，包括标准误差棒和概率的值（参见图2）的柱状图图。
- 计算真实弯曲 B，使用电子表格设计一个公式， 即： B = 180° - 一张纸条： A是一个从ImageJ的分析得出的值。
- 测量平均弯曲角度 B中各使用后台电子表格工具（ 图2J）。
- 分析使用电子表格“公式”的工具（ 图2J）每次测量重复之间的标准偏差。
- 测试SIG结果通过施加t-试验对平均弯曲角度和上述计算出的标准偏差值的着性。
- 使用上述值来使用的电子表格“插入”工具（ 图2K）以图形方式表示在两个不同的背景之间的弯曲角度的定量差绘制一个直条图。
注：强有力的候选基因突变/过度表达线将显示方面明显的差异野生型，如无弯曲，弯曲快或慢弯曲。
- 计算真实弯曲
- 轻轻地选择自己的下胚轴的最低部分秧苗时不接触任何其他部分。确保所有的苗木具有相同的子叶/挂钩方向，转让后，即苗挂钩的方向保持不变。使用最少20苗每行中的每个背景和用于进一步分析每个时间点至少两个板组成。
2.屏幕株系有缺陷的热带响应由于PD SEL变化具有改变PD胼胝质水平
- 8羟基芘- -1,3,6-三对顶部幼苗与HPTS琼脂糖块酸（HPTS）染料加载执行下胚轴加载分析，比较染料的突变体之间的运动/过表达线和Col-0中 。
- 准备HPTS琼胶SE块胚轴加载试验。
- 取10毫升DDH 2 O的在50ml锥形瓶中，并添加0.1克琼脂糖以制备1％琼脂糖凝胶。煮沸琼脂糖在微波炉1-2分钟间歇摇动，并让它冷却5分钟。
- 50毫克HPTS的可加10毫升1％琼脂糖溶液，搅拌均匀，直到溶液变为绿色。
- 倒入上述混合物至10毫米培养皿，并允许它固化15分钟。
- 用锋利的刀片解剖剪琼脂糖凝固HPTS做小琼脂糖块（0.5×2 平方厘米）。
- 准备植物样品的HPTS染料加载试验。
- 设置了HPTS染料负载测定的平台;上放置一个新的MS培养基平板的显微镜盖玻片（24×50毫米2）， 如图3A所示 。
- 从钩的基地使用锋利手术剪消费为期3天的老黄化苗。
- 立即传送上述秧苗（从每个背景最少5苗），以微观盖玻璃的表面中，使得只有0.5厘米处的切除位置胚轴的应保留在盖玻片上的方式，和胚轴的其余部分应该接触如在图3B中所示的介质。
- 放置在胚轴的顶部HPTS琼脂糖块（带有一个切钩）中5分钟以这样的方式使切下的区域接触HPTS琼脂糖块。
- 5分钟装载后，从胚轴表面去除琼脂糖块中，下胚轴转移到含有DDH 2 O的10毫米的培养皿并在DDH 2 O洗胚轴与连续摇动15分钟。
- 准备共聚焦显微镜的样品。
- 从激光扫描共聚焦显微镜下的每个背景观察选择至少5苗。
- 在激光信道，波长设置为特定EXC 488纳米itation和500至550nm为带通发射。
- 在2台传送秧苗（一个的Col-0 +一个突变）到一个新的显微镜载玻片用的DDH 2 O洗涤后添加100-150微升双蒸水至滑动，并用盖玻片覆盖。移幻灯片以共焦显微镜的阶段。
- 采用亮场（白光）照明聚焦下胚轴区域（具有20X 40X或物镜）。然后，扫描荧光的幻灯片。
- 拍摄图像最少10套，并通过从装货点检查染料移动的范围的两个背景进行比较。
注意：突变/过表达系具有改变的共质体的运动将表现出与野生型相比Col-0中染料载荷不同的模式。
- 准备HPTS琼胶SE块胚轴加载试验。
- 分析胼胝质水平突变/过度表达线条显示修改过的向光性和向重力响应和显示鲜明HPTS染料运动<br/>比较教育署COL-0。
- 准备苯胺蓝染色胼胝质染色。
- 使1M甘氨酸，pH为9.5和0.1％（W / V）的苯胺蓝在高压灭菌的DDH 2 O
- 3体积比：通过混合0.1％苯胺蓝和2 1M甘氨酸使染色缓冲液。例如，对于50毫升染色缓冲液中，取20毫升0.1N％苯胺蓝和30毫升的1M甘氨酸。注意：请染色缓冲最低使用和储存在黑暗中前48小时。
- 染色弯曲或无弯曲与特定的胼胝质苯胺蓝染色苗。
- 以在染色过程中抑制从头胼胝质合成，1.5mM的2-脱氧-D-葡萄糖（DDG）的最终体积加至50ml染色缓冲液中。
- 就拿胼胝质染色（有或无响应热带）3日龄的黄化苗。
- 切薄用手术剪从他们的钩地区的苗。
- 转移苗小培养皿中含有ING用牙签的尖端2毫升染色缓冲液中。
- 孵化用染色缓冲幼苗在黑暗中2小时连续摇动以30rpm。
- 染色后，清洗与DDH 2 O的幼苗2分钟以除去过量的染色缓冲液中。
- 选择一个最小的5苗的激光扫描共聚焦显微镜下每个工厂背景观察。
- 准备共聚焦显微镜的样品：
- 转移苗组（单的Col-0 +一个突变）清洁显微镜的DDH 2 O.洗涤后滑
- 添加DDH 2 O的100-150微升，并用盖滑盖。移幻灯片以共焦显微镜的阶段。
- 在激光信道，波长设置为特定激发405nm和500至550nm发射苯胺蓝荧光的成像。
- 与10X和后期带来胚轴区成为关注的焦点，第一R，其中采用亮场（白光）照明20X 40X或物镜。
- 然后，打开过滤光线，扫描幻灯片荧光，并保存图像。
- 衡量ImageJ的软件（http://imagej.nih.gov/ij/index.html）胼胝质信号强度（ 见图4）。
- 改变从奥林巴斯图像二进制格式（* .oib）到JPEG文件格式共聚焦显微镜图像的格式。注意：只有JPEG格式是由ImageJ的软件支持。
- 启动通过双击（ 图4A）的ImageJ的程序。注：箭头指示矩形工具在胼胝质强度测量（ 图4B）被使用。
- 点击“文件”选项后面的子选项“打开”ImageJ的工具栏，然后打开显微镜照片中保存的JPEG文件格式来测量胼胝强度（ 图4C）。
- 点击伊玛矩形图标GEJ工具栏（ 图4D）。
- 分析信号强度，拖动光标在画面和选择区域进行检查（ 图4E）
- 测量，按“M”键盘（ 图4E）上录制的信号强度的数值。注：结果文件将开立单独的（ 图4F）。
- 测量和记录的强度值逐一对所有从每个工厂背景的苗木。
注意：在ImageJ的，结果文件“平均”表示所选择的“区域”的信号强度。
- 平均值从ImageJ的结果文件的拷贝，并在定量分析的电子表格文件粘贴。
- 进行定量分析，使用统计检验，包括标准误差棒和概率值（ 图4）的柱状图图。
- 测量的平均信号强度（从ImageJ的意思）使用电子表格“公式”工具（ 图4G）每个后台。
- 分析使用电子表格“公式”的工具（ 图4G）用于每次测量重复之间的标准偏差。
- 计算使用thespreadsheet“公式”工具的标准误差（SE）。
注意：SE = S /√n，其中（s）是总体的标准偏差，和（n）是该样品的尺寸（观测数）。 - 通过施加t检验到的平均信号强度，并且如上所述计算出的标准误差值测试结果的意义。
- 使用上述值来使用的电子表格“插入”工具（ 图4H）以图形方式表示在两个不同的背景之间的胼胝质水平的定量差绘制的柱状图图。
注：强有力的候选人的突变/过度表达线将小号与野生型胼胝质的水平，如无胼胝质，胼胝质很少或超PD胼胝质的积累有什么不同。
- 准备苯胺蓝染色胼胝质染色。
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Representative Results
在当前的设置，AtGSL8的地塞米松（DEX）诱导型的RNAi线[以下dsGSL8（+ DEX / -dex）]中使用，作为纯合子gsl8 T-DNA插入突变体幼苗致死18。 dsGSL8和野生型苗±DEX三日龄的黄化苗暴露于向光性和向地刺激。我们发现，dsGSL8（+ DEX）幼苗中向光性和向地15有缺陷。 图5清楚地表明，dsGSL8（+ DEX）呈现既向光性和向地的影响下没有弯曲。此外，改变在dsGSL8（+ DEX）和dsGSL8（-dex）或Col-0中共质体运动是由一个HPTS加载试验分析。与我们以前的发现是一致的，在dsGSL8的HPTS染料运动（+ DEX）是大大高于dsGSL8（-dex）或Col-0中更广泛， 如图6胼胝质为PD SEL的关键调节因子之一，并且AtGSL8称为PD胼胝质合成酶16。此外，胼胝质苯胺蓝染色进行，dsGSL8（+ DEX）之前和之后的嗜响应已持续所示的低PD胼胝质的水平， 如图7。
图1中所涉及的向光性和向地应答的刺激的步骤的流程图（A）转移垂直生长幼苗从不同的植物背景的一块板，但在不同的行。 （B）对于向光性，保持在该被打开的一侧暗箱朝单方面白色光朝向所述板。对于向地，首套用铝箔板，旋转90°，并转移到一个暗箱（covereð 来自四面八方的）。 （c）使用一个扫描器，不同的时间间隔，例如1.5小时，3小时，6小时和12小时后进行扫描板。 （D和E）这些面板使用的电子表格文件从ImageJ的数据分析显示数据产生，分别为。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.测量由ImageJ的弯曲角度。（A）查看通过双击的Image J程序。 （B）在角度测量中使用的主要工具。 （C）打开“文件”选项，后跟子选项“打开”的Image J工具栏打开被保存为JPEG文件格式显微图像，。 （D （F）的角度测量概要： 
ABC定义了一个固定的 A，以及真正的弯曲角被计算为 B，它等于180° - 代表从A点到B点的距离A.（G）线。行（H）连续性AB到C点制作答：（I）的Image J表现的结果文件的值。 （J）代表电子表格文件显示，平均弯曲角度的测量，STAN准偏差，标准误差和t检验计算。 （K）条形图显示图两种不同的植物背景的Col-0和dsGSL8 EMS突变体之间的弯曲角度的测量。误差棒是SEM（平均值+标准误差）和***表示通过T检验（p值> 0.01）的意义。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3 概要中所涉及的HPTS装载测定的步骤。（A）中示出HPTS琼脂糖块的制备面板。 （B）的小组表示切除和幼苗转移和HPTS琼脂糖块的加载。 （C）的面板显示中涉及样品中的步骤对于共焦成像的准备。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.测量由ImageJ的胼胝质的强度。（A）看双击ImageJ的程序。 （B）在胼胝质强度测量中使用的主要工具。 （C）打开“文件”选项，后跟子选项“打开”ImageJ的工具栏打开被保存为JPEG文件格式显微图像，。 （D）的ImageJ工具栏上的矩形图标。 （E），用于分析的胼胝质强度图像的选中区域。 （F）的ImageJ结果文件显示胼胝质的强度值，因为“中庸”。 （G）代表电子表格文件显示平均胼胝质强度测量，标准偏差，标准误差和t检验计算。代表两个工厂背景之间的胼胝质的强度差（H）条形图图。误差棒是SEM（平均值+标准误差）和***表示通过T检验（p值> 0.01）的意义。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5. AtGSL8 表达 的减少 导致有缺陷的热带反应。（A）趋光反应显示出由dsGSL8（±DEX）以及Col-0中。（B）由dsGSL8（±DEX）所示重力性反应人翁与Col-0中 。dsGSL8（+ DEX）没有显示出向光性或向地性反应。dsGSL8（+ DEX）和dsGSL8（-dex）象征地塞米松处理和未处理dsGSL8诱导型的RNAi线，分别为。比例尺代表0.2厘米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6.共质体运动 HPTS加载后被送往dsGSL8±DEX胚轴切割面与野生型Col-0中一起AtGSL8。荧光图像的抑制后增加 。dsGSL8（+ DEX）显示HPTS染料的更广泛的运动，这表明增加共质体运动。比例尺条为0.2mm左右。COM /文件/ ftp_upload / 53513 / 53513fig6large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图7. AtGSL8 压制线呈下胚轴照明和阴影双方对称PD胼胝质的分布 。 （A）荧光图像显示为0小时的dsGSL8（-dex）苯胺蓝染色胼胝质。 （B）荧光图像显示向光性后的6小时的dsGSL8（-dex）苯胺蓝染色胼胝质。 （C）荧光图像显示向光性后的6小时的dsGSL8（+ DEX）苯胺蓝染色胼胝质。黄色箭头表示对下胚轴的阴影区域的胼胝质的积累。比例尺代表50微米。 （D）代表上午条形图图在dsGSL8累计（±DEX）PD胚轴胼胝质前后向光性的3小时和6小时的'mount。荧光灶强度从十个独立胚轴测定（数据是平均值±标准差;学生t检验，* P <0.01）。这个数字已经从修改（Han等，2014年），15。 请点击此处查看本图的放大版本。
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Discussion
在此手稿，一个策略来筛选由于改变的PD胼胝质，因此，PD SEL中详细描述的突变体/过表达系是在向光性和向地响应缺陷的。 PD胼胝质合成和降解主要由胼胝质合成酶和β-1,3-葡聚糖酶来实现，但这些酶的调节是通过许多上游因素控制。要搜索这样的上游因素或直接参与PD调控的候选人，我们已建立了筛选此方法。这种设置有一些限制，调节PD胼胝质合成（gsl8）的一些关键酶的突变体是致命的15和理清这些突变将这个设置限制。此外，如果候选基因示出更快的或具有开放或封闭的PD沿慢嗜响应，但胼胝质水平保持不变，则需要详细分析，以进一步表征这些候选人。关键因素和故障排除PROCE在每一步小规模企业也详细阐述。首先，在介质制剂，可以影响植物生长的关键因素是媒体，其范围应为5.7-5.8的pH。第二，琼脂平板的适当的表面的干燥是重要的;这将是难以解除3天龄幼苗不与水含量高的琼脂平板的任何损害。但是，琼脂平板的过分干燥可以孵育期间引起媒体一些裂缝并导致非对称幼苗生长。在使用次氯酸钠溶液种子表面消毒，必须小心通过反复洗涤蒸压DDH 2 O的彻底清除次氯酸钠，因为它是一个强大的漂白剂。蒸压DDH 2 O的应新鲜配制和无菌处理，因为老股可能会导致MS板真菌污染。灭菌后，种子由冷处理分层同步发芽。可以通过转任一执行该过程摹消毒湿种子直接到寒冷的房间在黑暗条件下或先点睛种子到MS板，然后将板转移到寒冷的房间在黑暗条件下。然而，我们优选后者，因为它给苗更均匀的生长。而打点种子，两个相邻的种子之间的距离应在为0.1cm至少因为很密切点缀种子会导致重叠苗，这是非常困难的在随后的实验转移的生长。
为了正确向光性和向地反应，苗不应该被曝光并应保持完好。为了避免白光的背景效果，慎重选择在黑暗的房间在一个绿色光源幼苗为植物不绿光回应。可以通过使用透明绿色乙烯板覆盖所述白色光源来产生绿色光源。对于选择种苗，消毒的牙签是最好的选择。触摸日e为牙签胚轴的非常下部解除幼苗，使它们可以很容易地转移到新的板上。所有的幼苗在尺寸上应与钩方向相似。在我们的实验中，我们看到，如果钩子方向是在光源的相反侧，植物会表现出比具有相同的钩子方向作为光源植物更快嗜响应。通常情况下，在向光性的情况下，人们可以看到3小时内于真正的候选和Col-0之间的弯曲角的明显的差异，而在向地的情况下，通常需要6-12小时。最后，有统计学上相关的数据，最少三个生物学重复和20苗每次都需要。
测试不同的植物背景之间共质体运动的程度，HPTS染料加载是一种方便的技术，因为它不需要复杂的工具和仪器。为HPTS装载测定中，克的百分比埃尔在HPTS琼脂糖块是非常重要的，因为一个非常脆的或硬的凝胶不会给最佳的结果。最好是使用50毫升的锥形瓶中以松散橡胶和不使用大容量的烧瓶中，用10ml的水琼脂糖沸腾。 HPTS琼脂糖块可用于一周制备之后，如果保持在4℃下用铝箔包裹。在HPTS装载测定另一关键因素是胚轴钩区域的切除。切除应锐性剥离的剪刀，在所有苗木类似的立场进行。切除钝的剪刀可能会导致不必要的幼苗损失和可能阻碍HPTS加载。此外，幼苗生长条件和发育阶段可能在染料移动了至关重要的作用，因为胼胝质堆积是更容易发生这种变化，最终占染料运动障碍作出响应。因此，在最佳条件下生长的幼苗是必要的。胼胝质在PD起着的关键作用通过调节PD SEL，这是生长素梯度形成15重要黄化苗的热带响应。胼胝质的水平可通过与苯胺蓝或免疫标记染色来检测。与苯胺蓝染色是用于检测胼胝质水平的一个简单而快速的方法。因为胚轴细胞具有高膨压和外延角质层层，这是不容易的染料渗透到细胞中。因此，我们开发了切口染色方法，以允许苯胺蓝染料容易渗入。然而，有新的胼胝质，可以影响染色的结果，这是正常的胼胝质染色方法的一个限制的合成的危险。为了避免这种影响，染色协议通过添加胼胝质合成酶抑制剂2-D-脱氧葡萄糖（DDG）到染色缓冲液进行修改。因此，该协议包括预先存在的胼胝质只在这正是切割部位下方的胚轴的下部区域的测量。避免使用新鲜prepar的ED苯胺蓝，并保持在室温苯胺蓝溶液最少使用前48小时。我们注意到，新鲜苯胺蓝染色解决方案不提供最佳的胼胝质染色的结果。
总体而言，我们已经提出了一组可用于突变体/过表达系的快速筛选以通过直接或间接地调节PD胼胝质改变PD SEL有缺陷的或增强的嗜应对策略。关于热带响应一个较早事实被majorly限于生长素载体和信令球员，如PINIOD 2-14的作用。此外，我们还建立在维持胚轴系统15生长素梯度生长素共质体运动的一个重要的作用。这种方法的简单性和通用性无疑加强调查候选基因的PD SEL的调节，从而起到在植物发育中的重要作用，包括热带响应其效用。
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Disclosures
作者没有披露。
Acknowledgments
韩国国家研究基金会（NRF-2015R1A2A1A10053576），这项研究得到支持，从下一代BioGreen 21计划的资助（SSAC，授予PJ01137901），农村振兴厅，韩国。 RK，WS，ABB和DK经脑韩国21 Plus计划（BK21 +）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt) | Sigma | H1529-1G | Fluorescent dye as symplasmic tracer |
| LE Agarose | Dongin-Genomic | GEL001-500G | Used for HPTS agarose block |
| Microwave oven | LG-Goldstar | Machine for boiling agarose gel | |
| 100 ml glass conical flask | Dong Kwang | A0205 | Used to boil HPTS agarose gel |
| Petri dish (35 mm x 10 mm) | SPL life sciences | SPL10035 | Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples |
| Microscope cover slides and glass slides (24 mm x 50 mm) | Marienfeld Laboratory Glassware | 101222 | Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation |
| MS medium plates 125 mm x 125 mm x 20 mm | SPL life sciences | SPL11125 | Plates to make MS agar medium |
| Scissors | Germany Stainless | HSB 942-11 | Used to excise hook region of plant samples |
| Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture | Duchefa | P10453.01 | MS medium including vitamins. |
| (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate | Bioshop | 3G30212 | To make MS media. |
| Plant agar | Duchefa | P1001.1000 | To solidify MS media. |
| Autoclave | ALP | CL-40L | |
| Shaker | Wise Mix | SHO-1D | To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way. |
| 1 ml Blue tips | Sorenson | 10040 | |
| 1 ml pipette | BioPette | L-1101-2 | |
| Surgical tape | MIcropore | 1530-0 | To seal the MS plate |
| Aniline blue (Methyl blue) | Sigma | M5528-25G | Used to prepare aniline blue staining buffer. |
| Glycine | Bioshop | GLN001 | Used to prepare aniline blue staining buffer. |
| DDG | Sigma | D8375-1G | Used for the inhibition of callose synthases. |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000MPE SIM | To check aniline blue staining and HPTS dye loading result. |
| Stirrer | I lab | K400 | To mix media solution. |
| Aluminium foil | SW cooking foil | To wrap plates in a dark condition. | |
| Sodium hypochlorite | Samjin Industry | To surface-sterilized seeds |
References
- Went, F. W., Thimann, K. V., et al. Phytohormones. Experimental biology monographs. Bard, P., et al. , The Macmillan Company. New York. 204 (1937).
- Bennett, M. J., et al. Arabidopsis AUX1 gene: a permease-like regulator of root gravitropism. Science. 273 (5277), 948-950 (1996).
- Christensen, S. K., Dagenais, N., Chory, J., Weigel, D. Regulation of auxin response by the protein kinase PINOID. Cell. 100 (4), 469-478 (2000).
- Jurgens, G., Geldner, N. The high road and the low road: trafficking choices in plants. Cell. 130 (6), 977-979 (2007).
- Michniewicz, M., et al. Antagonistic regulation of PIN phosphorylation by PP2A and PINOID directs auxin flux. Cell. 130 (6), 1044-1056 (2007).
- Noh, B., Bandyopadhyay, A., Peer, W. A., Spalding, E. P., Murphy, A. S. Enhanced gravi- and phototropism in plant mdr mutants mislocalizing the auxin efflux protein PIN1. Nature. 423 (6943), 999-1002 (2003).
- Weijers, D., Friml, J. Snap Shot: auxin signaling and transport. Cell. 136 (6), 1172-1172 (2009).
- Wisniewska, J., et al. Polar PIN localization directs auxin flow in plants. Science. 312 (5775), 883 (2006).
- Murphy, A. S., Hoogner, K. R., Peer, W. A., Taiz, L. Identification, purification, and molecular cloning of N-1-naphthylphthalmic acid-binding plasma membrane-associated aminopeptidases from Arabidopsis. Plant Physiol. 128 (3), 935-950 (2002).
- Kleine-Vehn, J., Friml, J. Polar targeting and endocytic recycling in auxin-dependent plant development. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 24, 447-473 (2008).
- Yang, Y., Hammes, U. Z., Taylor, C. G., Schachtman, D. P., Nielsen, E. High-affinity auxin transport by the AUX1 influx carrier protein. Curr. Biol. 16 (11), 1123-1127 (2006).
- Geisler, M., Murphy, A. S. The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development. FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).
- Band, L. R., et al. Root gravitropism is regulated by a transient lateral auxin gradient controlled by a tipping point mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 109 (12), 4668-4673 (2012).
- Vanneste, S., Friml, J. Auxin: a trigger for change in plant development. Cell. 136 (6), 1005-1016 (2009).
- Han, X., et al. Auxin-callose-mediated plasmodesmal gating is essential for tropic auxin gradient formation and signaling. Dev. Cell. 28 (2), 132-146 (2014).
- Kumar, R., Kumar, D., Hyun, T. K., Kim, J. Y.
- Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiol. 150, 105-113 (2009).
