一种验证胼胝质介导的胞间连丝门控在向性反应中作用的策略

摘要

本文介绍了筛选控制质体连丝通透性及向性反应中生长素梯度相关基因的方法，包括子叶下胚轴向性反应程度的测定 的 拟南芥 通过8-羟基芘-1,3,6-三磺酸（HPTS）染料加载检测胞间连丝通透性，最后评估胼胝质水平。

摘要

植物激素生长素在多种生长和发育过程中发挥着重要作用，包括对光和重力的向性反应。生长素梯度的建立是导致向光性和向重性反应的关键事件。以往研究表明，生长素的极性运输（PAT）可在植物不同细胞区域中建立生长素梯度。然而，Han et al. 最近证明，为了正确形成生长素梯度，胞间连丝中胼胝质介导的共质体连通性在相邻细胞之间也是一个关键因素。本文讨论了一种研究特定基因功能的策略，这些基因可通过调控胞间连丝胼胝质的合成来改变共质体连通性，从而影响向光性和向重性反应。第一步是将突变体或某基因过表达株系与野生型材料一起，筛选3日龄黄化幼苗中异常的向性反应。这一初步筛选有助于鉴定出一系列在生长素极性运输或调控共质体连通性中起作用的基因。第二轮筛选则聚焦于那些通过影响共质体连通性而表现出向性反应改变的候选基因。为验证这些候选基因，需检测共质体示踪剂的移动情况以及胞间连丝处胼胝质的沉积水平。该策略将有助于发现新的候选基因，这些基因可在向性反应及其他发育过程中直接或间接地调控共质体连通性。

引言

植物作为固着生物，已进化出高度复杂的细胞间信号传导网络，以应对各种环境刺激。向性反应是植物响应环境刺激的现象之一。植物主要表现出两种向性反应：向光性和向重力性。光合植物通过向光性朝向光源弯曲，以获取最大能量。同样，向重力性使植物朝向地心引力方向生长。引发此类向性反应的基本机制涉及植物激素生长素的不对称梯度形成¹局部生长素梯度形成的机制已有充分表征；参与该机制的基因为激素作用提供了分子路径图^2-8生长素外排载体（如PIN-FORMED（PIN）蛋白和P-糖蛋白）在细胞中的特定定位决定了生长素从供体细胞的细胞质向细胞壁的转运。^9,10此外，通过活性H⁺/IAA 共同转运活性的生长素输入载体（如 AUX1/LAX 家族蛋白）将生长素最终传递至相邻的受体细胞^2,11,12这种生长素的定向运输被称为极性生长素运输（PAT）。PAT 在不同发育阶段以及响应各种环境刺激时，可导致生长素的差异性分布。^13,14此外，任何一种生长素输入或输出载体的定位或表达发生紊乱，都会导致极性运输（PAT）的严重改变，进而破坏生长素浓度梯度，引起发育缺陷。最近，Han 等报道称，胞间连丝的调控对于维持生长素梯度也是必需的¹⁵迄今为止，已鉴定出30多种胞间连丝蛋白¹⁶在这些蛋白中，AtGSL8 被报道为在胞间连丝（PD）处介导胼胝质合成的关键酶，因此在维持胞间连丝大小排阻极....

方案

1. 筛选光向性与重力向性反应异常的突变体

1. 实验前一天配制含0.8%琼脂的1×Murashige和Skoog（MS）培养基，pH 5.7。
   1. 向一个 2 L 锥形瓶中加入 800 ml 双蒸水，并用磁力搅拌子搅拌。
   2. 向锥形瓶中加入 4.4 g MS 盐。
   3. 加入0.5 g 2-(N-吗啉)乙磺酸（MES），搅拌至所有盐完全溶解。
   4. 用1 M KOH将培养基的pH值调节至5.7。
   5. 将培养基转移至量筒中，并用ddH₂O定容至1 L₂O.
   6. 将培养基倒回2 L锥形瓶中，加入8 g植物琼脂。
   7. 用铝箔将锥形瓶口紧密包裹。
   8. 高压灭菌 MS 培养基和 ddH₂O₂O 孵育 15 分钟 121 °C，15 psi，灭菌后，将培养基置于 60 °C 培养箱和ddH₂O₂室温下，O。
   9. 冷却至 60 °C，将培养基倒入125 x 125 x 20 mm的培养皿中³ 在层流工作台上将方形培养皿（每皿50 ml）放置。
   10. 在室温下静置培养皿约1小时，使琼脂凝固，期间保持培养皿部分敞开。若不立即使用，可用塑料薄膜密封后储存于 4 °C 在冰箱中。
2. 用1.1%次氯酸钠对种子进行表面灭菌，并将种子....

结果

在当前实验设置中，使用了地塞米松（dex）可诱导的AtGSL8基因RNAi株系[以下简称dsGSL8 (+dex/-dex)]，因为纯合的gsl8 T-DNA插入突变体在幼苗期即致死¹⁸。将dsGSL8株系和野生型幼苗在有无dex条件下培养至3日龄，进行黄化幼苗处理后，施加向光性和向重力性刺激。我们发现，dsGSL8 (+dex)幼苗在向光性和向重力性反应中均存在缺陷¹⁵。图5清楚显示，dsGSL8 (+dex)幼苗在向光性和向重力性刺激下均未出现弯曲现象。此外，通过HPTS染料加载实验分析了dsGSL8 (+dex)、dsGSL8 (-dex)以及Col-0中胞间连丝介导的共质体运输变化。结果与我们先前的研究发现一致，如图6所示，dsGSL8 (+dex)中HPTS染料的扩散范围显著.......

讨论

本文详细描述了一种筛选因胞间连丝（PD）胼胝质改变进而导致PD选择透过性（SEL）异常，从而在向光性和向地性反应中表现缺陷的突变体或过表达株系的策略。PD胼胝质的合成与降解主要由胼胝质合酶和β-1,3-葡聚糖酶完成，但这些酶的调控受到多种上游因子的影响。为了寻找直接参与PD调控的上游因子或候选基因，我们建立了该筛选方法。该方法存在一定局限性，例如调控PD胼胝质生物合成的关键酶基因突变体（如gsl8）具有致死性¹⁵，因此该筛选体系难以获得此类突变体。此外，若候选基因在导致PD开放或关闭的同时，引起更快或更慢的向性反应，但胼胝质水平未发生变化，则需要进一步进行详细分析以表征此类候选基因。本文还详细阐述了各步骤中的关键因素及问题排查方法。首先，在培养基制备过程中，影响植物生长的关键因素之一是培养基的pH值，应控制在5.7–5.8之间。其次，琼脂平板表面的适当干燥至关重要；若琼脂平板含水量过高，则难以无损伤地挑取3日龄幼苗。然而，若琼脂平板干燥过度，可能在培养过程中导致培养基开裂，从而引起幼苗生长不对称。在使用次氯酸钠溶液对种子进行表面灭菌时，必须通过反复使用高压灭菌的ddH₂O清洗.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HPTS（8-羟基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐）	Sigma	H1529-1G	作为共质体示踪剂的荧光染料
LE琼脂糖	Dongin-Genomic	GEL001-500G	用于制备HPTS琼脂糖块
微波炉	LG-Goldstar		用于煮沸琼脂糖凝胶的设备
100 ml玻璃锥形瓶	Dong Kwang	A0205	用于煮沸HPTS琼脂糖凝胶
培养皿（35 mm × 10 mm）	SPL life sciences	SPL10035	用于制备HPTS琼脂糖块及清洗植物样品
显微镜盖玻片和载玻片（24 mm × 50 mm）	Marienfeld Laboratory Glassware	101222	用于HPTS琼脂糖块及显微样品制备
MS培养基平板（125 mm × 125 mm × 20 mm）	SPL life sciences	SPL11125	用于制备MS琼脂培养基的平板
剪刀	Germany Stainless	HSB 942-11	用于切除植物样品的钩状区域
Murashige和Skoog（MS）基础盐混合物	Duchefa	P10453.01	包含维生素的MS培养基。
（N-吗啉代）乙磺酸（MES）一水合物	Bioshop	3G30212	用于配制MS培养基。
植物琼脂	Duchefa	P1001.1000	用于固化MS培养基。
高压灭菌器	ALP	CL-40L
摇床	Wise Mix	SHO-1D	用于轻柔地洗去苯胺蓝染色缓冲液和HPTS染料。
1 ml蓝色吸头	Sorenson	10040
1 ml移液器	BioPette	L-1101-2
医用胶带	MIcropore	1530-0	用于密封MS平板
苯胺蓝（甲基蓝）	Sigma	M5528-25G	用于配制苯胺蓝染色缓冲液。
甘氨酸	Bioshop	GLN001	用于配制苯胺蓝染色缓冲液。
DDG	Sigma	D8375-1G	用于抑制胼胝质合酶。
共聚焦显微镜	Olympus	FV1000MPE SIM	用于检测苯胺蓝染色和HPTS染料加载结果。
搅拌器	I lab	K400	用于混合培养基溶液。
铝箔	SW cooking foil		用于在避光条件下包裹培养板。
次氯酸钠	Samjin Industry		用于种子表面灭菌