Een strategie om de rol van callose gemedieerde Plasmodesmal Poortsignalen in de Tropic Response valideren

Summary

Dit artikel beschrijft de methoden voor het screenen van de genen die plasmodesmal doorlaatbaarheid en dus auxine verloop tijdens trope respons. Dit omvat het meten van de mate van respons in tropische hypocotyl van Arabidopsis thaliana en controleren plasmodesmal permeabiliteit door 8-hydroxypyreen-1,3,6-trisulfonzuur (HPTS) laad- en tenslotte callose niveau assessment.

Abstract

Het plantenhormoon auxine speelt een belangrijke rol in veel groei en ontwikkelingsprocessen, waaronder tropische reacties op licht en zwaartekracht. De oprichting van een auxine gradiënt is een belangrijke gebeurtenis die leidt tot phototropism en gravitropisme. Voorheen polaire auxine transport (PAT) bleek een auxine gradiënt vestigen in verschillende cellulaire domeinen van planten. Echter, Han et al. Onlangs aangetoond dat juiste auxine gradiënt vorming plasmodesmal-gemedieerde callose symplasmic verbinding tussen aangrenzende cellen is ook een kritische factor. In dit manuscript, de strategie om de rol van bepaalde genen, die phototropism en gravitropisme kan beïnvloeden door het veranderen van symplasmic verbinding via moduleren plasmodesmal callose synthese verheldering besproken. De eerste stap is om afwijkende tropische antwoorden van 3 dagen oude geëtioleerde zaailingen mutanten of overexpressie lijnen van een gen te screenen met het wildtype. Deze eerste screeningkan leiden tot de identificatie van een reeks genen functioneren in PAT of het regelen van symplasmic connectiviteit. Het tweede onderzoek betreft de sortering van kandidaten die veranderde tropische reacties door het beïnvloeden van symplasmic connectiviteit te tonen. Om dergelijke kandidaten pakken, de beweging van een symplasmic tracer en de afzetting van plasmodesmal callose onderzocht. Deze strategie zou nuttig zijn om nieuwe kandidaat-genen die symplasmic verbinding direct of indirect tijdens de tropische reacties en andere ontwikkelingsprocessen kunnen reguleren verkennen.

Introduction

Planten, sessiele levende organismen hebben een zeer geavanceerde netwerk van cel-cel signalering naar diverse omgevingsstimuli aanpakken ontwikkeld. Trope reacties zijn een van de verschijnselen waarbij planten reageren op prikkels uit de omgeving. Planten vertonen twee belangrijke tropische reacties phototropism en gravitropisme. Fotosynthetische planten buigen in de richting van de lichtbron door phototropism om maximale energie te oogsten. Evenzo gravitropisme maakt de planten groeien naar het zwaartepunt. De fundamentele mechanisme dat leidt tot zulke tropische reacties impliceert asymmetrische gradiënt vorming van het plantenhormoon auxine ^1. De handeling van de lokale auxine gradient formatie goed gekarakteriseerd; de genen die betrokken zijn bij dit mechanisme te voorzien van een routekaart voor hormoon actie ^2-8. De specifieke positie van auxine efflux dragers, zoals PIN-GEVORMD (PIN) en P-glycoproteïnen, voert de beweging van auxine van het cytoplasma naar de celwand van donorcellen ^9,10. Furthermore, door de actieve H ⁺ / IAA symport activiteit van auxine instroom dragers, zoals AUX1 / LAX familie eiwitten, auxine is eindelijk geleverd aan de naastgelegen ontvanger cellen ^2,11,12. Deze gerichte beweging van auxine is bekend als polaire auxine transport (PAT). PAT leidt tot een differentiële auxine verdeling tijdens verschillende ontwikkelingsstadia en in reactie op verschillende omgevingsstimuli ^13,14. Bovendien, de verstoring van lokalisatie of expressie van een van deze auxine influx of efflux dragers leidt tot ernstige verandering in PAT, waarbij een verstoring van de auxine gradiënt oorzaken, wat leidt tot defecten in de ontwikkeling. Onlangs, Han et al. gemeld dat plasmodesmal verordening Ook moet de auxine gradiënt ¹⁵ handhaven. Tot op heden zijn meer dan 30 plasmodesmal eiwitten geïdentificeerd ^16. Van deze eiwitten is AtGSL8 gemeld als een sleutelenzym voor callose klanksynthese plasmodesmata (PD) en daardoor een belangrijke rol speelt in maintaining de PD uitsluiting op grootte limiet (SEL). Onderdrukte AtGSL8 expressie resulteerde in een vervormd auxine gradiëntpatroon leidt tot geen tropische reactie in tegenstelling tot wild type zaailingen ^15.

In dit manuscript, methoden om nieuwe kandidaat-genen die betrokken zijn bij PD regelgeving zijn voorzien verkennen. AtGSL8 werd gebruikt als een modeleiwit deze methoden te testen, omdat het een sleutelenzym bijdraagt ​​aan callose biosynthese PD. Door de zaailing-dodelijkheid van gsl8 knock-out mutanten ¹⁷ werden dexamethason (Dex) induceerbare RNAi lijnen gebruikt volgens een eerder gepubliceerd rapport ^15. De strategie die hier kan worden aangepast aan genen die zijn betrokken bij hypocotyl tropische reactie gecontroleerd door PD SEL screenen.

Protocol

1. Screening van mutanten met veranderde fototropische en gravitropic Responses

1. Bereid 1x Murashige en Skoog (MS) Medium, pH 5,7, met 0,8% Agar Een dag voor het experiment.
   1. Voeg 800 ml dubbel gedestilleerd water om een ​​2 L erlenmeyer en roer met een magneetstaaf.
   2. Voeg 4,4 g MS zout in de conische kolf.
   3. Voeg 0,5 g 2- (N-morfolino) ethaansulfonzuur (MES) en roer totdat al het zout is opgelost.
   4. De pH van het medium op 5,7 met 1 M KOH.
   5. Breng het medium tot een massa cilinder en breng uiteindelijke volume tot 1 L met DDH ₂ O.
   6. Giet terug het medium in een 2 L erlenmeyer en voeg 8 g van plantaardige agar.
   7. Wikkel de mond van de kolf goed af met aluminiumfolie.
   8. Autoclaaf het MS medium en DDH ₂ O 15 minuten bij 121 ° C, 15 psi en na autoclaveren, houdt het medium in een 60 ° C incubator en DDH ₂ O bij KT.
   9. Na afkoelen tot 60 ° C, giet het medium in 125 x 125 x 20 mm ³ vierkante platen op een laminaire stroming bank (50 ml per plaat).
   10. Laat de agar gestold bij kamertemperatuur gedurende 1 uur door het houden van de platen gedeeltelijk open. Indien de platen niet direct worden gebruikt, verzegelen met plastic folie en bewaar bij 4 ° C in een koelkast.
2. Oppervlakte-steriliseren van de zaden met 1,1% natriumhypochloriet en de puntjes op de zaden op 1x MS agarplaten die werden opgesteld in paragraaf 1.1.
   Opmerking: Hier, Arabidopsis thaliana {Col-0 seeds, dsGSL8 (Col-0)} ¹⁵ worden gebruikt voor tropische respons, callose kleuring en HPTS laden Arabidopsis thaliana {Col-0 en dsGSL8 (Col-0) EMS mutant} zaden (. ongepubliceerd) worden gebruikt voor tropische respons in figuur 2.
   1. Autoclaaf 300 ml van DDH ₂ O in een fles.
   2. Voeg ongeveer honderd zaden per achtergrond, dwzmutant / overexpressie lijn en wild type (Col-0) zaden, om een 1,5 ml microcentrifugebuis.
   3. Neem 1x MS agarplaten van een 4 ° C koelkast en droog ze op een laminaire stroming bankje in een gedeeltelijk open positie.
   4. Oppervlakte-steriliseren van de zaden door toevoeging van 1 ml van een 0,2 x bleekwater oplossing (1,1% natriumhypochloriet) en houd de microcentrifugebuizen op schudinrichting bij 250 rpm gedurende 5 minuten.
   5. Laat de zaden naar de bodem door de zwaartekracht en verwijder het bleekmiddel oplossing van micropipet.
   6. Voeg 1 ml vers DDH ₂ O (geautoclaveerd) om de zaden en goed meng door de microcentrifugebuis meerdere malen. Laat de zaden weer af te wikkelen en verwijder het water.
   7. Herhaal stap 1.2.6 5-6 keer.
   8. Voeg dubbele hoeveelheid water om het volume van de zaden die bleven na de laatste wasbehandeling.
   9. Dot de gesteriliseerde zaden op een semi-gedroogde 1x MS agar plaat met behulp van een 1 ml micropipet tip die 200 ul van zaden (inclusief water).
      1. Houd ongeveer 0,1 cm afstand tussen twee zaden en minimaal 1,8 cm tussen twee rijen zaden. Puntjes op de zaden in vijf horizontale rijen per vierkante plaat (125 x 125 x 20 mm ^3). Laat het water iets te drogen voordat u het deksel op de plaat.
   10. Dicht de platen met chirurgische tape, stapelen alle van de platen verticaal, en wikkel met aluminiumfolie.
   11. Breng de verpakte platen naar een donkere doos (die geen toegang hebben tot licht). Blijf dan de donkere doos in een 4 ° C kamer / koelkast voor 3 dagen.
   12. Vanaf deze stap gaat richting platen ongewijzigd. Na 3 dagen koudebehandeling, houden de donkere box aan een installatie kweekkamer bij 22 ° C gedurende de volgende 3 dagen. Na 3 dagen, controleer dan de kieming status van de zaden onder groen licht in een donkere kamer.
       LET OP: Meestal 3 dagen oude Col-0 geëtioleerde zaailingen kunnen groeien tot 1,6 cm in lengte.
3. Analyseer de veranderde phototropic eennd gravitropic respons in mutanten of overexpressie lijnen van een specifiek gen. Selecteer alleen vergelijkbare grootte en verticaal gegroeid recht zaailingen onder groen licht in een donkere kamer. Transfer geselecteerd zaailingen vers 1x MS agarplaat met de punt van een steriele tandenstoker.
   1. de zaailingen van het laagste deel van de hypocotyl selecteren zacht zonder andere onderdelen aanraakt. Zorg ervoor dat alle van de zaailingen hebben dezelfde zaadlob / hook oriëntatie, en na het overbrengen, dat de oriëntatie van de zaailing haken blijven hetzelfde. Gebruik ten minste 20 zaailingen per achtergrond in elke rij en ten minste twee platen voor elk tijdstip voor verdere analyse.
      Opmerking: Vier verschillende achtergronden kunnen worden vergeleken in elke plaat (4 rijen).
      Optioneel: Tijdens het gebruik van dexamethason (Dex) induceerbare RNAi / overexpressie lijnen, de overdracht van de hierboven zaailingen een 1x MS plaat samen met de + dex MS plaat (plaat met 1x MS, 0,8% agar medium, aangevuld met 20 uM dex) for 3 uur en houden de platen verticaal in donkere doos.
   2. Om phototropic reactie te controleren, de overdracht van de bovenstaande borden verticaal om een ​​zwarte doos met slechts één kant geopend. Breng de zwarte doos met platen om een ​​plantengroei kamer met een unilaterale wit licht. Eenzijdige licht te garanderen, plaatst u de rand van de plaat in de richting van de lichtbron (niet de voorkant). Raadpleeg de opstelling in figuur 1.
   3. Ook de gravitropic reactie te controleren, houden de platen met overgedragen zaailingen verticale, en dek af met aluminiumfolie. Vervolgens verandert de plaat oriëntatie verticaal tot 90 ° en hou het binnen de zwarte doos bedekt van alle kanten. Raadpleeg de opstelling in figuur 1.
   4. Na de gegeven tijd punten (meestal 1,5 uur, 3 uur, 6 uur en 12 uur) het scannen van de platen met een scanner, en sla de foto's in JPEG-formaat.
   5. Meet de buighoek van de zaailingen met behulp van ImageJ software (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (Figure 2).
      1. Start het ImageJ programma door dubbel te klikken (Figuur 2A).
         Opmerking: De belangrijkste instrumenten die gebruikt werden in de hoekmeting worden getoond in figuur 2B.
      2. Klik op de optie "file", gevolgd door sub-optie "open" in de werkbalk ImageJ, open foto's zijn opgeslagen in JPEG-bestandsformaat naar de tropen buighoek (figuur 2C) te meten.
      3. Klik op het vergrootglas instrument in of uit te zoomen op de foto door te klikken op de linker of rechter muisknop, respectievelijk zoals weergegeven in figuur 2B.
      4. Klik op het scrollen gereedschap te slepen en de positie van de foto (figuur 2D) .Next, klikt u op de hoek instrument om de hoek van het buigen (figuur 2E) te meten.
         1. Maak een dubbele klik links op de originele hypocotyl groeirichting punt 'a', sleep de muis naar de buigende initiatie punt 'b' (figuur 2F), en klik op de linker kontop de eerste lijn (figuur 2G) te trekken.
         2. Sleep de muis vanaf punt b om het buigen eindpunt 'c', en klik op de linker knop om de tweede lijn (figuur 2H) tekenen en vormen een vast A. Opmerking: De ware buigen hoek B, die gelijk is aan 180 ° is - A. (figuur 2F).
         3. Meet en opnemen Een door op 'M' op het toetsenbord. Het resultaat bestand zal afzonderlijk te openen zoals weergegeven in figuur 2I. Meet en alle zaailingen, geregistreerd voor één. Bijvoorbeeld eerst meten van de buighoek van alle hypocotylen van Col-0 en vervolgens voor mutant lijnen.
   6. Breng de dataset van ImageJ naar spreadsheet-bestand naar de av makendelde van buighoeken van elke achtergrond.
   7. Voor kwantitatieve analyse maakt een staafdiagram diagram statistische testresultaten, waaronder standaard foutbalken en waarschijnlijkheidswaarden (zie figuur 2).
      1. Bereken de ware buigen B, en het ontwerpen van een formule met behulp van spreadsheet, dat wil zeggen, B = 180 ° - Een briefje: A is de waarde die was afgeleid van ImageJ analyse.
      2. Meet de gemiddelde Buigingshoek B voor elke achtergrond met behulp van spreadsheet gereedschappen (figuur 2J).
      3. Analyseer de standaardafwijking tussen herhalingen voor elke meting met behulp van de spreadsheet "formules" tool (figuur 2J).
      4. Test de sigkenis van de resultaten door een t-test om de gemiddelde buighoek en standaarddeviatiewaarden berekend zoals hierboven vermeld.
      5. Teken een staafdiagram met behulp van de bovenstaande waarden grafisch vertegenwoordigen de kwantitatieve verschil in de buigende hoek tussen twee verschillende achtergronden met behulp van de spreadsheet "insert" tool (figuur 2K).
         Opmerking: Mutant / overexpressie lijnen van de sterke kandidaat-genen zouden duidelijke verschillen ten opzichte van wild type, zoals geen buigen tonen, snel buigen of langzaam buigen.

2. Screen Plant Lijnen met Defecte Tropic Responses gevolg van veranderingen in PD SEL met een veranderde PD callose Level

1. Voer een hypocotyl Laden Assay met 8-hydroxypyreen-1,3,6-trisulfonzuur (HPTS) Dye laden op de top van Zaailingen met HPTS Agarose Blocks en vergelijk de Beweging van Dye Tussen Mutant / Over-expressie Lines en Col-0.
   1. Bereid HPTS Agarose blokken voor het laden hypocotyl assay.
      1. Neem 10 ml DDH ₂ O in een 50 ml conische kolf en voeg 0,1 g agarose met een 1% agarose gel te bereiden. Kook de agarose in een magnetronoven gedurende 1-2 minuten met onderbroken schudden en laat het afkoelen 5 minuten.
      2. Voeg 50 mg HPTS tot 10 ml van 1% agarose-oplossing en meng goed totdat de oplossing groen wordt.
      3. Giet het bovengenoemde mengsel van een 10 mm petrischaal, en laat het stollen gedurende 15 minuten.
      4. Snij de gestolde HPTS agarose met een scherp mes dissectie kleine agarose blokken (0,5 x 2 cm ²⁾ te maken.
   2. Bereid plantaardige monsters voor de HPTS dye-loading assay.
      1. Stel een platform voor de HPTS dye laden assay; Plaats een microscoop dekglaasje (24 x 50 mm ²⁾ op een nieuwe MS-medium plaat zoals getoond in figuur 3A.
      2. Accijnzen 3 dagen oude geëtioleerde zaailingen van de basis van de haak met een scherp chirurgische schaar.
      3. Per directBreng de hierboven zaailingen (minimaal 5 zaailingen van elke achtergrond) aan het oppervlak van een microscopisch dekglas zodanig dat slechts 0,5 cm van hypocotyl van de excisie positie dekglaasje moet blijven, en de rest van de hypocotyl zou aanraken het medium zoals getoond in figuur 3B.
      4. Plaats de HPTS agarose blok boven de hypocotyl (met een uitgesneden haak) gedurende 5 min op een zodanige wijze dat het uitgesneden gebied aanraakt HPTS agarose blok.
      5. Na 5 minuten van het laden, verwijder de agarose blok van de hypocotyl oppervlak, de overdracht van de hypocotylen aan de 10 mm petrischaal met DDH ₂ O en was hypocotylen in DDH ₂ O gedurende 15 minuten onder voortdurend schudden.
   3. Bereid Monsters voor confocale microscopie.
      1. Selecteer minimaal 5 zaailingen van elke achtergrond voor observatie onder de confocale laser scanning microscoop.
      2. In de laser-kanaal, stel de golflengte van 488 nm voor specifieke excitation en 500-550 nm voor band-pass-emissie.
      3. Overdracht zaailingen in 2 sets (een Col-0 + één mutant) in nieuw microscopisch preparaat na wassen met DDH ₂ O. Voeg 100-150 ul van dubbel gedestilleerd water aan de dia, en dek af met een deksel glijbaan. Schuif de schuif naar de fase van de confocale microscoop.
      4. Focus de hypocotyl regio (met een 20x of 40x objectief) met behulp van bright-veld (wit licht) verlichting. Vervolgens scant de dia's voor fluorescentie.
      5. Maak opnamen gedurende minimaal 10 sets, en de twee achtergronden vergelijken door eerst de mate van kleurstof vanop het laadpunt.
         Opmerking: Mutant / overexpressie lijnen met gewijzigde symplasmic beweging verschillende patronen kleurstof laden in vergelijking met wildtype Col-0 tonen.
2. Analyseer de callose Level in Mutant / Over-expressie lijnen die Altered fototropische en gravitropic Response en Resultaat Distinct HPTS Dye Movement Compared Col-0.
   1. Bereid aniline blauw callose kleuring kleurstof.
      1. Voeg 1 M glycine, pH 9,5 en 0,1% (W / V) aniline blauw geautoclaveerd DDH ₂ O.
      2. Maak de vlekken buffer door het mengen van 0,1% aniline blauw en 1 M glycine in 2: 3 volume ratio's. Bijvoorbeeld, voor 50 ml vlekken buffer, neem 20 ml 0,1% aniline blauw en 30 ml 1 M glycine. Let op: Maak de vlekken buffer minimaal 48 uur voorafgaand aan het gebruik en op te slaan in het donker.
   2. Stain gebogen of niet-gebogen zaailingen met callose-specifieke aniline blauwe kleurstof.
      1. De de novo synthese callose blokkering tijdens het kleurproces, voeg het eindvolume van 1,5 mM 2-deoxy-D-glucose (DDG) tot 50 ml vlekken buffer.
      2. Neem 3 dagen oude geëtioleerde zaailingen voor callose kleuring (met of zonder tropische respons).
      3. Snijd de zaailingen uit de haak regio met behulp van dunne chirurgische schaar.
      4. Overdracht van de zaailingen in een kleine petrischaal bevattening 2 ml vlekken buffer met de punt van een tandenstoker.
      5. Incubeer de zaailingen met kleurbuffer in het donker gedurende 2 uur onder voortdurend schudden bij 30 rpm.
      6. Na het kleuren, was de zaailingen met DDH ₂ O 2 min om het overtollige vlekken buffer te verwijderen.
      7. Selecteer minste 5 zaailingen elke plant achtergrond voor observatie onder de confocale laser scanning microscoop.
   3. Bereiden monsters voor confocale microscopie:
      1. Breng de zaailingen in set (één Col-0 + een mutant) aan de microscoop schoon dia's na het wassen met DDH ₂ O.
      2. Voeg 100-150 ul van DDH ₂ O en dek af met een deksel glijbaan. Schuif de schuif naar de fase van de confocale microscoop.
      3. In een laser kanaal ingesteld als golflengte 405 nm specifieke excitatie en 500-550 nm emissie voor de beeldvorming van aniline blauwe fluorescentie.
      4. Breng de hypocotyl regio in beeld, eerst met 10X en later met 20X of 40X objectief lenzen met behulp van bright-veld (wit licht) verlichting.
      5. Schakel dan over gefilterd licht, scan de dia's voor fluorescentie, en sla de afbeeldingen.
      6. Meet de callose signaalintensiteit met ImageJ software (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (zie figuur 4).
         1. Verander het formaat van confocale microscopie foto's van Olympus Image Binary-formaat (* .oib) naar JPEG-bestandsformaat. Opmerking: Alleen JPEG-formaat wordt ondersteund door ImageJ software.
         2. Start het ImageJ programma door dubbel te klikken (Figuur 4A). Opmerking: Pijlen geven de rechthoek gereedschap voor gebruik in de callose intensiteitsmeting (figuur 4B).
         3. Klik op de optie "file", gevolgd door de sub-optie "open" in de werkbalk ImageJ, open microscopie foto's die in JPEG-formaat zijn opgeslagen op de callose intensiteit (Figuur 4C) te meten.
         4. Klik op het rechthoekige symbool op de ImaGej werkbalk (figuur 4D).
         5. Om de intensiteit van het signaal te analyseren, sleep de cursor over het beeld en selecteer het gebied te onderzoeken (Figuur 4E)
         6. Meet en de numerieke waarden voor de intensiteit van het signaal opnemen door op 'M' op het toetsenbord (Figuur 4E). Opmerking: Het resultaat bestand wordt afzonderlijk (Figuur 4F) te openen.
         7. Meet en noteer de intensiteit waarden één voor één voor elk van de zaailingen van elke plant achtergrond.
            Opmerking: In ImageJ, het resultaat bestand "Mean" geeft het signaal intensiteit van de geselecteerde "Area".
      7. Kopieer de gemiddelde waarden van de ImageJ resultaat bestand, en plakken in spreadsheet-bestand voor de kwantitatieve analyse.
      8. Voor kwantitatieve analyse maakt een staafdiagram diagram met statistische tests, waaronder standaard foutbalken en waarschijnlijkheidswaarden (figuur 4).
         1. Meet de gemiddelde signaalintensiteit(gemiddelde van ImageJ) voor elke achtergrond met behulp van de spreadsheet "formules" tool (figuur 4G).
         2. Analyseer de standaardafwijking tussen herhalingen voor elke meting met behulp van de spreadsheet "formules" tool (figuur 4G).
         3. Bereken de standaardfout (SE) met behulp van thespreadsheet "formules" tool.
            Opmerking: SE = s / √ n, waarbij (s) is de standaarddeviatie van de populatie, en (n) is de grootte (aantal waarnemingen) van het monster.
         4. Test de significantie van de resultaten door een t-test om de gemiddelde signaalintensiteit en standaardfouten berekend zoals hierboven vermeld.
         5. Teken een staafdiagram diagram met behulp van de bovenstaande waarden grafisch vertegenwoordigen de kwantitatieve verschil in callose niveau tussen twee verschillende achtergronden met behulp van de spreadsheet "insert" tool (figuur 4H).
            Opmerking: Mutant / overexpressie lijnen van sterke kandidaten shoe verschillende niveaus van callose in vergelijking met wild-type, zoals geen callose, weinig callose of hyper PD callose accumulatie.

Representative Results

In de huidige setup, dexamethason (Dex) induceerbare RNAi lijnen van AtGSL8 [hierna dsGSL8 (+ dex / -dex)] werden gebruikt, zoals homozygote gsl8 T-DNA insertie mutanten worden zaailing dodelijk ^18. Drie dagen oude geëtioleerde zaailingen van dsGSL8 en wild type zaailingen met ± dex werden blootgesteld aan phototropic en gravitropic stimuli. We vonden dat dsGSL8 (+ dex) zaailingen waren defectief in phototropism en gravitropisme ^15. Figuur 5 toont duidelijk dat dsGSL8 (+ dex) vertoont geen buigen onder invloed van zowel phototropism en gravitropisme. Bovendien, verandering in symplasmic beweging in dsGSL8 (+ dex) en dsGSL8 (-dex) of Col-0 werd geanalyseerd door een HPTS lading test. In overeenstemming met onze eerdere bevindingen, het HPTS kleurstof beweging in dsGSL8 (+ dex) was aanzienlijk uitgebreider dan in dsGSL8 (-dex) of Col-0, figuur 6. callose is een van de belangrijkste regulatoren van PD SEL en AtGSL8 is bekend als een PD ¹⁶ callose synthase. Voorts werd callose aniline blauw kleuring uitgevoerd en dsGSL8 (+ dex) hebben steeds gering gebleken PD callose niveau vóór en na tropische reacties, zie figuur 7.

Figuur 1. Stroomdiagram van de stappen die betrokken zijn bij het ​​stimuleren van phototropic en gravitropic reacties. (A) Transfer verticaal gegroeid zaailingen van verschillende planten achtergronden op een bord, maar in aparte regels. (B) Voor phototropism, houden de platen gericht naar eenzijdige wit licht in een donkere doos die wordt geopend aan de ene kant. Voor gravitropisme eerst wikkel de platen met aluminiumfolie, 90 °, en over te dragen aan een donker vakje (covered van alle kanten). (C) Een scanner, scant de platen na verschillende tijdsintervallen, zoals 1,5 uur, 3 uur, 6 uur en 12 uur. (D en E) Deze panelen tonen data genereren van ImageJ en data-analyse met behulp van spreadsheet-bestanden, respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Meting van de buighoek door ImageJ. (A) Bekijk de Image J-programma door te dubbelklikken. (B) De belangrijkste instrumenten die gebruikt werden in de hoekmeting. (C) Open het "File" optie, gevolgd door de sub-optie "open" in de Image J werkbalk om microscopie foto's die in JPEG-formaat zijn opgeslagen te openen. (D (F) Overzicht van de hoek van meting: abc definieert een vaste A, en de werkelijke buighoek wordt berekend als B, die gelijk is aan 180 ° is - A. (G) Lijn die de afstand van punt a naar punt b. (H) De continuïteit van de lijn ab naar c maken wijzen A. (I) Resultaat dossier van Image J tonen Een waarde. (J) Vertegenwoordiger spreadsheet bestand weergeven van de gemiddelde buigen hoekmetingen, standaard afwijkingen, standaard fouten en t-test berekeningen. (K) Bar grafiek diagram weergeven van de buighoek metingen tussen twee verschillende planten achtergronden Col-0 en dsGSL8 EMS mutant. Error bars zijn SEM (standaard fout van het gemiddelde +) en *** staat voor de betekenis van T-toets (p-waarde> 0,001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Overzicht van de stappen die betrokken zijn bij de HPTS laden assay. (A) Panel toont de bereiding van HPTS agarose blokken. (B) Panel die de besnijdenis en de overdracht van zaailingen en het laden van HPTS agarose blokken. (C) Panel weergeven van de stappen die betrokken zijn bij voorbeeldvoorbereiding voor de confocale beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Meting van de callose intensiteit door ImageJ. (A) Bekijk de ImageJ programma door te dubbelklikken. (B) De belangrijkste instrumenten die gebruikt werden in de callose intensiteitsmeting. (C) Open het "File" optie, gevolgd door de sub-optie "open" in de werkbalk ImageJ om microscopie foto's die in JPEG-formaat zijn opgeslagen te openen. (D) De rechthoekige pictogram op ImageJ werkbalk. (E) Het geselecteerde gebied van de afbeelding voor het analyseren van de callose intensiteit. (F) ImageJ resultaat bestand weergave van de callose intensiteit waarde "Mean". (G)Vertegenwoordiger spreadsheet-bestand weergeven van de gemiddelde callose intensiteit metingen, standaarddeviaties, standaard fouten en t-test berekeningen. (H) Staafdiagram diagram dat callose intensiteitsverschil tussen de twee centrale achtergronden. Error bars zijn SEM (standaard fout van het gemiddelde +) en *** staat voor de betekenis van T-toets (p-waarde> 0,001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5. Vermindering van AtGSL8 expressie leidt tot tropische reacties defect. (A) fototropische respons vertoonden op dsGSL8 (± dex) samen met de Col-0. (B) gravitropic respons getoond door dsGSL8 (± dex) al ong met Col-0. dsGSL8 (+ dex) vertoont geen phototropic of gravitropic reacties. dsGSL8 (+ dex) en dsGSL8 (-dex) symboliseren dexamethason behandelde en onbehandelde dsGSL8 induceerbare RNAi lijnen, respectievelijk. Schaal bar vertegenwoordigt 0,2 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6. De symplasmic beweging toegenomen na de onderdrukking van AtGSL8. Fluorescentie beelden werden genomen na HPTS lading tot dsGSL8 ± dex hypocotyl snijvlakken samen met wild type Col-0. DsGSL8 (+ dex) toonde verdergaande beweging van HPTS kleurstof, waaruit blijkt toegenomen symplasmic beweging. Schaal bar vertegenwoordigt 0,2 mm.com / files / ftp_upload / 53513 / 53513fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7. AtGSL8 onderdrukt lijnen toonde symmetrische PD callose verdeling tussen verlichte en schaduwrijke kanten van de hypocotyl. (A) Fluorescentie beeld toont aniline blauw callose kleuring voor dsGSL8 (-dex) bij 0 uur. Afbeelding (B) Fluorescentie tonen aniline blauw callose kleuring voor dsGSL8 (-dex) na 6 uur van phototropism. (C) Fluorescentie beeld dat aniline blauw callose kleuring voor dsGSL8 (+ dex) na 6 uur van phototropism. Gele pijlen geven de callose accumulatie op het schaduwrijke regio hypocotyl. Schaal bar vertegenwoordigt 50 micrometer. (D) Staafdiagram diagram dat de amount van PD callose die opgestapeld in dsGSL8 (± dex) hypocotylen voor en na 3 uur en 6 uur van phototropism. Fluorescentie intensiteiten werden gemeten foci van tien onafhankelijke hypocotylen (data zijn gemiddelden ± SD; t-toets, * p <0,01). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van (Han et al., 2014) ^15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

In dit manuscript, een strategie voor mutant / overexpressie lijnen die defect in phototropic en gravitropic reacties zijn vanwege veranderde PD callose en derhalve PD SEL wordt beschreven screenen. PD callose synthese en afbraak wordt vooral bereikt door callose synthases en β-1,3-glucanasen, maar regulering van deze enzymen wordt door vele factoren upstream. Om te zoeken naar een dergelijke upstream factoren of kandidaten die rechtstreeks betrokken zijn bij PD regelgeving, hebben we het opzetten van deze methode voor de screening. Deze opzet heeft een aantal beperkingen als mutanten van een aantal belangrijke enzymen reguleren PD callose biosynthese (gsl8) zijn dodelijk ¹⁵ en dergelijke mutanten zouden worden beperkt door dit in te stellen regelen. Ook als de kandidaat-gen sneller of langzamer trope respons met open of gesloten PD toont, maar het callose ongewijzigd blijft, dan gedetailleerde analyse nodig om dergelijke kandidaten te karakteriseren. De kritische factoren en proce het oplossen van problemensses in elke stap, worden uiteengezet. Eerst, in mediumbereiding, een kritische factor die invloed heeft op de plantengroei is de pH van de media, die uitwijst 5,7-5,8. Tweede passende oppervlaktedroging van agarplaten belang; zou het moeilijk zijn om de 3 dagen oude zaailingen tillen zonder enige schade door agarplaten met een hoog watergehalte. Echter kan te veel drogen van agarplaten aantal barsten in de media veroorzaken tijdens incubatie en resulteren in asymmetrische groei van zaailingen. Tijdens het oppervlak sterilisatie van zaden via natriumhypochlorietoplossing, moet erop worden gelet dat natriumhypochloriet volledig verwijderen van veelvuldige wassen met geautoclaveerd DDH ₂ O, aangezien het een sterk bleekmiddel. Geautoclaveerd DDH ₂ O moet vers worden bereid en aseptisch behandeld als oude voorraden schimmelbesmetting in MS platen kan leiden. Na sterilisatie worden zaden gestratificeerd naar koudebehandeling kieming synchroniseren. Deze werkwijze kan zowel worden uitgevoerd door transferrineg gesteriliseerd natte zaden rechtstreeks op een koude kamer in donkere omstandigheden of de zaden eerst puntjes op MS-platen en vervolgens het overbrengen van de platen om een ​​koude kamer in donkere omstandigheden. Echter, geven we de voorkeur aan de laatste omdat het een meer uniforme groei van zaailingen geeft. Terwijl puntjes zaden, moet de afstand tussen twee naburige zaden ten minste 0,1 cm, omdat de voet gestippeld zaden zou leiden tot de groei van overlappende zaailing, die zeer moeilijk te dragen in volgende experimenten.

Voor een goede phototropic en gravitropic reacties, moet zaailingen niet worden blootgesteld aan licht en moet onbeschadigd blijven. Om de achtergrond effecten van wit licht te vermijden, de zaailingen onder een groen licht bron in de donkere kamer te selecteren zorgvuldig planten reageren niet op groen licht. Groen licht bron kan worden gegenereerd door het bedekken van het witte licht bron met transparante groene vinyl platen. Voor het selecteren van de zaailingen, een gesteriliseerde tandenstoker is de beste optie. Raak the zeer onderste deel van de hypocotyl de tandenstoker de zaailingen tillen zodat ze gemakkelijk kunnen worden overgebracht naar een nieuwe plaat. Alle van de zaailingen moeten vergelijkbaar in grootte en haak oriëntatie. Tijdens onze experimenten, zagen we dat als de haak richting aan de andere kant van de lichtbron, planten zullen een snellere respons dan tropische planten met dezelfde richting als de haak lichtbron tonen. Normaal bij phototropism, kan men een duidelijk verschil in de buighoek tussen echte kandidaten en Col-0 zie binnen 3 uur, terwijl bij gravitropisme, duurt meestal 6-12 uur. Tenslotte statistisch relevante gegevens, ten minste drie biologische herhalingen en 20 zaailingen nodig elke tijd.

Voorzover van symplasmic uitwisseling tussen installatie achtergronden testen, HPTS loading dye is een geschikte techniek, aangezien het geen geavanceerde middelen en instrumenten nodig. Voor het laden HPTS assay, het percentage Gel in HPTS agarose blokken van groot belang als zeer bros of harde gel niet optimale resultaten geeft. Het is beter om een ​​50 ml erlenmeyer gebruiken met losse rubber en niet een groot volume kolf gebruikt voor koken agarose met 10 ml water. HPTS agarose blokken kan worden gebruikt voor een week na de bereiding aangelijnd omwikkeld met aluminiumfolie bij 4 ° C. Een andere belangrijke factor in de HPTS laden test is het uitsnijden van de hypocotyl haak regio. Excision moet worden uitgevoerd met scherpe dissectie schaar en op een vergelijkbare positie voor al de zaailingen. Excision met botte schaar kan ongewenste schade aan zaailingen veroorzaken en kan HPTS laden belemmeren. Daarnaast kan de zaailing groeiomstandigheden en ontwikkelingsstadia een cruciale rol spelen kleurstof beweging, zoals callose accumulatie gevoeliger te reageren op dergelijke veranderingen, die uiteindelijk verantwoordelijk voor belemmering van beweging kleurstof. Aldus kweken van de zaailingen onder optimale omstandigheden noodzakelijk. Callose bij PD speelt een belangrijke rol in detropic reacties van geëtioleerde zaailingen door het reguleren PD SEL, wat belangrijk is voor auxine gradient formatie ^15. Callose niveaus kunnen worden gedetecteerd door kleuring met aniline blauw of immunogoud labeling. Kleuring met aniline blauw is een eenvoudige en snelle werkwijze voor het detecteren van callose niveau. Omdat hypocotyl cellen hebben hoge turgor en een epi-opperhuidlaag, is het niet eenvoudig om de kleurstof aan de cellen penetreren. Daarom ontwikkelden we de cut-kleuring methode om aniline blauwe kleurstof om gemakkelijk te dringen. Er bestaat echter een gevaar voor de synthese van nieuwe callose de kleuringen, hetgeen een beperking van de normale callose kleuringsmethode kunnen beïnvloeden. Om dergelijke effecten te vermijden, wordt de kleuringsprotocol aangepast door toevoeging van het callose synthase remmer 2-deoxy D-glucose (DDG) van kleuring buffer. Dus dit protocol omvat het meten van reeds bestaande callose alleen in het onderste gebied van het hypocotyl die precies onder de snede plaats. Vermijd het gebruik van vers prepared aniline blauw, en houd de aniline blauwe oplossing bij kamertemperatuur gedurende ten minste 48 uur vóór gebruik. We hebben gemerkt dat kleuring met verse aniline blauwe oplossing niet optimaal callose kleuring resultaten.

Samengevat hebben wij voorgesteld een aantal strategieën die kunnen worden gebruikt voor het snel screenen van mutanten / overexpressie lijnen met een defecte of versterkt trope respons door verandering PD SEL door direct of indirect moduleren PD callose. Een eerdere feit over trope respons was vreselijk beperkt tot de werking van auxine vervoerders en signalering spelers, zoals PINIOD ^2-14. Daarnaast hebben we eveneens een cruciale rol symplasmic verkeer van auxine op teneinde een auxine gradiënt in het hypocotyl systeem ^15. De eenvoud en veelzijdigheid van deze methode ongetwijfeld versterken zijn bruikbaarheid bij het onderzoek kandidaatgenen voor de regulering van PD SEL, waardoor een essentiële rol in de ontwikkeling van planten, waaronder tropische reacties spelen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt)	Sigma	H1529-1G	Fluorescent dye as symplasmic tracer
LE Agarose	Dongin-Genomic	GEL001-500G	Used for HPTS agarose block
Microwave oven	LG-Goldstar		Machine for boiling agarose gel
100 ml glass conical flask	Dong Kwang	A0205	Used to boil HPTS agarose gel
Petri dish (35 mm x 10 mm)	SPL life sciences	SPL10035	Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples
Microscope cover slides and glass slides (24 mm x 50 mm)	Marienfeld Laboratory Glassware	101222	Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation
MS medium plates 125 mm x 125 mm x 20 mm	SPL life sciences	SPL11125	Plates to make MS agar medium
Scissors	Germany Stainless	HSB 942-11	Used to excise hook region of plant samples
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture	Duchefa	P10453.01	MS medium including vitamins.
(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate	Bioshop	3G30212	To make MS media.
Plant agar	Duchefa	P1001.1000	To solidify MS media.
Autoclave	ALP	CL-40L
Shaker	Wise Mix	SHO-1D	To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way.
1 ml Blue tips	Sorenson	10040
1 ml pipette	BioPette	L-1101-2
Surgical tape	MIcropore	1530-0	To seal the MS plate
Aniline blue (Methyl blue)	Sigma	M5528-25G	Used to prepare aniline blue staining buffer.
Glycine	Bioshop	GLN001	Used to prepare aniline blue staining buffer.
DDG	Sigma	D8375-1G	Used for the inhibition of callose synthases.
Confocal microscope	Olympus	FV1000MPE SIM	To check aniline blue staining and HPTS dye loading result.
Stirrer	I lab	K400	To mix media solution.
Aluminium foil	SW cooking foil		To wrap plates in a dark condition.
Sodium hypochlorite	Samjin Industry		To surface-sterilized seeds