En strategi för att validera roll Callose-medierad Plasmodesmal Gating i Tropic Response

Summary

Den här artikeln beskriver metoder för screening av gener som kontrollerar plasmodesmal permeabilitet och därmed auxin gradient under tropiska svar. Detta inkluderar mätningen av graden av tropic respons i hypokotyl av Arabidopsis thaliana och kontroll plasmodesmal permeabilitet med 8-hydroxipyren-1,3,6-trisulfonsyra (HPTS) lastning och bedömning slutligen callose nivå.

Abstract

Växthormonet auxin spelar en viktig roll i många tillväxt- och utvecklingsprocesser, inklusive tropic reaktioner på ljus och gravitation. Inrättandet av ett auxin gradient är en viktig händelse som leder till FOTOTROPISM och gravitropism. Tidigare var polar auxin transport (PAT), som visas för att upprätta ett auxin gradient i olika cellulära domäner av växter. Emellertid Han et al. Nyligen visat att för korrekt auxin gradient bildning, är plasmodesmal callose medierad symplasmic anslutning mellan de intilliggande cellerna också en kritisk faktor. I detta manuskript, den strategi belysa rollen av vissa gener, som kan påverka FOTOTROPISM och gravitropism genom att ändra symplasmic uppkoppling via modulera plasmodesmal callose syntes diskuteras. Det första steget är att screena avvikande tropiska svar från 3 dagar gamla etiolerad plantor av mutanter eller överuttryck rader av en gen tillsammans med vildtypen. Denna preliminära screeningkan leda till att identifiera ett antal gener som fungerar i PAT eller kontrollerar symplasmic anslutning. Den andra screening innebär sortering av kandidater som visar förändrade tropiska svar genom att påverka symplasmic anslutning. Att ta itu med sådana kandidater, var rörelsen hos en symplasmic spår och avsättning av plasmodesmal callose undersöktes. Denna strategi skulle vara bra att utforska nya gener som kan reglera symplasmic anslutning direkt eller indirekt under tropiska svar och andra utvecklingsprocesser.

Introduction

Växter, som fastsittande levande organismer, har utvecklat en mycket sofistikerad nätverk av cell-till-cellsignalering för att hantera olika stimuli från omgivningen. Tropic svar är ett av de fenomen genom vilket växterna svarar på stimuli från omgivningen. Växter visar två huvudsakliga tropic responser, FOTOTROPISM och gravitropism. Fotosyntetiska växter böjas mot ljuskällan genom FOTOTROPISM att skörda maximal energi. På liknande sätt gör gravitropism växterna att växa i riktning mot gravitationscentrum. Den grundläggande mekanismen som leder till sådana tropiska svar innebär asymmetrisk lutning bildandet av fytohormonerna auxin ^en. Handlingen att lokala auxin gradient bildning är väl karakteriserad, de gener som är involverade i denna mekanism ger en färdplan för hormonverkan ^2-8. Den särskilda ställning för auxin utflödes bärare, såsom PIN-formed (PIN) och P-glykoproteiner, utför rörelsen av auxin från cytoplasman till cellväggen hos givarceller ^9,10. Furthermore, av den aktiva H ⁺ / IAA symport aktiviteten av auxin tillströmning bärare, såsom AUX1 / LAX familjeproteiner, auxin är slutligen levereras till de intilliggande mottagare cellerna ^2,11,12. Denna riktad rörelse av auxin kallas polär auxin transport (PAT). PAT leder till en differential auxin fördelning under olika utvecklingsstadier och som svar på olika stimuli från omgivningen ^13,14. Dessutom störningar i lokalisering eller uttryck av någon av dessa auxin tillströmning eller utflödesbärare leder till allvarliga förändringar i PAT, som orsakar en störning av auxin-gradient, vilket leder till utvecklingsdefekter. Nyligen Han et al. rapporterade att plasmodesmal förordning är också nödvändig för att upprätthålla auxin lutning ^15. Hittills har mer än 30 plasmodesmal proteiner identifierats ^16. Bland dessa proteiner, har AtGSL8 rapporterats som ett nyckelenzym för callose syntes vid plasmodesmata (PD) och därmed spelar en viktig roll i maintaining PD storleksuteslutningsgräns (SEL). Undertryckta AtGSL8 uttryck resulterade i en förvrängd auxin gradient mönster som leder till ingen tropiska svar i motsats till vild typ plantor ^15.

I detta manuskript, metoder utforska nya kandidatgener som är inblandade i PD reglering tillhandahålls. AtGSL8 användes som ett modellprotein för att testa dessa metoder, eftersom det är ett nyckelenzym som bidrar till PD callose biosyntes. På grund av den plant-letalitet av gsl8 knock-out-mutanter ^17, var dexametason (dex) -inducerbara RNAi linjer används i enlighet med en tidigare publicerad rapport ^15. Strategin ges här kan anpassas för att screena gener som är inblandade i hypokotyl vändkrets svar kontrolleras av PD SEL.

Protocol

1. Screening av mutanter med förändrad Phototropic och Gravitropic Responses

1. Förbered 1x Murashige och Skoog (MS) medium, pH 5,7, med 0,8% agar En dag före försöket.
   1. Tillsätt 800 ml dubbeldestillerat vatten till en 2 L E-kolv och rör om med en magnetisk stång.
   2. Lägg 4,4 g MS salt till den koniska kolven.
   3. Tillsätt 0,5 g 2- (N-morfolino) etansulfonsyra (MES) och rör om tills alla salter är fullständigt upplösta.
   4. Justera pH hos mediet till 5,7 med 1 M KOH.
   5. Överför mediet till en massa cylinder och föra slutliga volymen till 1 L med DDH ₂ O.
   6. Häll tillbaka mediet till en 2 L E-kolv och tillsätt 8 g växt agar.
   7. Linda mun i kolven tätt med aluminiumfolie.
   8. Autoklavera MS-medium och DDH ₂ O under 15 minuter vid 121 ° C, 15 psi, och efter autoklavering, hålla mediet i en 60 ° C inkubator och DDH ₂ O vid RT.
   9. Efter kylning till 60 ° C, häll mediet i 125 x 125 x 20 mm ³ fyrkantiga plattor på ett laminärt flöde bänk (50 ml i varje platta).
   10. Tillåta agar stelna vid RT under ca 1 h genom att hålla plattorna delvis öppen. Om plattorna inte används omedelbart, täta dem med hjälp plastfolie och förvara vid 4 ° C i ett kylskåp.
2. Utanpå sterilisera fröna med 1,1% natriumhypoklorit och dot fröna på 1x MS agarplattor som framställdes i avsnitt 1.1.
   Obs: Här Arabidopsis thaliana {Col-0 frön, dsGSL8 (Col-0)} ¹⁵ används för tropiska svar callose färgning och HPTS loading Arabidopsis thaliana {Col-0 och dsGSL8 (Col-0) EMS-mutant} frön (. opublicerad) används för tropiska svar i Figur 2.
   1. Autoklav 300 ml DDH ₂ O i en flaska.
   2. Tillsätt ca hundra frön för varje bakgrund, det vill säga,mutant / överuttryck linje och vildtyp (Col-0) frön, till en 1,5 ml mikrocentrifugrör.
   3. Ta ut 1x MS agarplattor från en 4 ° C kylskåp och torka dem på ett laminärt flöde bänk i ett delvis öppet läge.
   4. Utanpå sterilisera fröna genom att tillsätta 1 ml av en 0,2 x blekningslösning (1,1% natriumhypoklorit) och hålla mikrocentrifugrör på skak vid 250 rpm under 5 minuter.
   5. Låt fröna sjunka till botten av gravitationen och sedan ta bort blekmedel lösning av mikropipett.
   6. Tillsätt 1 ml av färskt DDH ₂ O (autoklaverad) till fröna och blanda väl genom att vända mikrocentrifugrör flera gånger. Låt fröna lösa igen och sedan avlägsna vattnet.
   7. Upprepa steg 1.2.6 5-6 gånger.
   8. Lägg dubbla mängden vatten till volymen av frön som fanns kvar efter den sista tvättningen.
   9. Dot de steriliserade fröna på en halvtorr 1x MS agarplatta med hjälp av en 1 ml mikropipett spets innehållande 200 pl frön (iklusive vatten).
      1. Håll ungefär 0,1 cm avstånd mellan två frön och minst 1,8 cm mellan två utsädesraderna. Dot frön i fem horisontella rader per kvadrat platta (125 x 125 x 20 mm ^3). Låt vattnet torka något innan du lägger locket på plattan.
   10. Täta plattor med kirurgtejp, stapla alla plattorna vertikalt, och linda med aluminiumfolie.
   11. Överför inslagna plattor till en mörk låda (utan tillgång till ljus). Sedan hålla mörk låda i en 4 ° C rum / kylskåp i 3 dagar.
   12. Med utgångspunkt från detta steg, hålla riktningen av plattor oförändrade. Efter 3 dagars kylbehandling, hålla den fyllda rutan i ett växtodlingsrummet vid 22 ° C under de närmaste 3 dagarna. Efter 3 dagar, ta groningen status av fröna under grönt ljus i ett mörkt rum.
       OBS: Vanligtvis tre dagar gamla Col-0 etiolerad plantor kan växa upp till 1,6 cm i längd.
3. Analysera förändrade phototropic ennd gravitropic svar i mutanter eller överuttryck rader av en specifik gen. Välj bara samma storlek och vertikalt odlade raka plantor under grönt ljus i ett mörkt rum. Överföra valda plantor till en ny 1x MS agarplatta hjälp av spetsen på en steriliserad tandpetare.
   1. välj försiktigt plantorna från den lägsta delen av sin hypokotyl utan att röra några andra delar. Se till att alla plantor har samma hjärtbladsnod / krok orientering, och efter överföring, att orienteringen av plant krokar förblir desamma. Använda minst 20 plantor av varje bakgrund i varje rad och ett minimum av två plattor för varje tidpunkt för ytterligare analys.
      Obs: Fyra olika bakgrunder kan jämföras i varje platta (4 rader).
      Valfritt: När du använder dexametason (dex) -inducerbara RNAi / överuttryck linjer, överföra de ovannämnda plantorna till en 1x MS plattan tillsammans med + dex MS platta (skylt som innehåller 1x MS, 0,8% agar-medium kompletterat med 20 iM dex) for 3 timmar och hålla plattorna vertikalt i mörk låda.
   2. För att kontrollera phototropic svar överföra ovanstående plattorna vertikalt till en svart låda med bara en sida öppnas. Överför den svarta lådan som innehåller plattorna planttillväxtkammare med ensidig vitt ljus. Att säkerställa unilateral ljus, placera kanten av plattan mot ljuskällan (inte framsidan). Se till inställnings i figur 1.
   3. På samma sätt, för att kontrollera gravitropic svar hålla plattorna med överförda plantor vertikala, och täck med aluminiumfolie. Därefter ändrar plattan orientering vertikalt till 90 ° och hålla den i den svarta lådan täcks från alla sidor. Se till inställnings i figur 1.
   4. Efter de givna tidpunkter (vanligen 1,5 h, 3 h, 6 h och 12 h) skanna plattorna med en skanner, och spara bilderna i JPEG-format.
   5. Mäter böjningsvinkel av plantor med hjälp av ImageJ programvara (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (Figure 2).
      1. Starta ImageJ programmet genom att dubbelklicka (Figur 2A).
         Notera: De stora verktyg som användes i vinkelmätningen är visade i figur 2B.
      2. Klicka på "fil" följt av underalternativ "öppna" i ImageJ verktygsfältet och öppna bilder som sparats i JPEG-format för att mäta tropiska böjningsvinkel (figur 2C).
      3. Klicka på förstoringsverktyget för att zooma in eller ut på bilden genom att klicka på vänster eller höger musknapp, respektive som visas i figur 2B.
      4. Klicka på rullande verktyg för att dra och placera bilden (figur 2D) .Nästa klickar vinkeln verktyg för att mäta vinkeln böjning (Figur 2E).
         1. Gör en dubbel vänsterklicka på den ursprungliga hypokotyl växande riktningspunkt "a", dra musen till den böjnings inledande punkten "b" (figur 2F), och klicka på vänster buttpå för att rita den första raden (fig 2G).
         2. Dra musen från punkt B till bockningsslutpunkten "c", och klicka på den vänstra knappen för att dra den andra linjen (Figur 2H) och bildar en fast A. Obs: Den verkliga böjningsvinkel är B, som är lika med 180 ° - A. (Figur 2F).
         3. Mät och spela A genom att trycka på "M" på tangentbordet. Resultatet filen öppnas separat som visas i figur 2I. Mäta och registrera alla av plantor en efter en. Till exempel, först mäter böjningsvinkeln för alla de hypokotyler från Col-0 och sedan för mutanta linjer.
   6. Överför dataset från ImageJ till kalkylark för att göra AVnomsnittliga böjningsvinklarna för varje bakgrund.
   7. För kvantitativ analys, gör ett stapeldiagram schema med statistiska testresultat, inklusive barer standard fel och sannolikhetsvärden (se figur 2).
      1. Beräkna den sanna böjning B, och utforma en formel med hjälp av kalkylprogram, dvs. B = 180 ° - En lapp: A är det värde som erhölls från ImageJ analys.
      2. Mäta den genomsnittliga böjningsvinkel B för varje bakgrund med hjälp av kalkylverktyg (Figur 2j).
      3. Analysera standardavvikelsen mellan replikat för varje mätning med hjälp av kalkyl "formler" verktyg (Figur 2J).
      4. Testa sigdelse av resultaten genom att applicera ett t-test med den genomsnittliga böjningsvinkel och standardavvikelsevärden som beräknats såsom nämnts ovan.
      5. Rita ett stapeldiagram med hjälp av ovanstående värden för att grafiskt representera den kvantitativa skillnaden i böjningsvinkeln mellan två olika bakgrunder med hjälp av kalkylprogram "insert" verktyg (figur 2K).
         Obs: Mutant / överuttryck rader av starka gener skulle visa tydliga skillnader med avseende på vildtyp, såsom ingen böjning, snabb böjning eller långsam böjning.

2. Skärmväxtlinjer med defekta Tropic svar på grund av förändringar i PD SEL med en förändrad PD Callose Nivå

1. Utför en hypokotyl Loading analys av 8-hydroxipyren-1,3,6-trisulfonsyra (HPTS) Dye Loading på toppen av plantor med HPTS agarosblock jämför rörelsen av Dye Mellan Mutant / överuttryck Linjer och Col-0.
   1. Förbereda HPTS AgaroSE block för hypokotyl lastning analys.
      1. Ta 10 ml DDH ₂ O i en 50 ml konisk kolv och tillsätt 0,1 g agaros att förbereda en 1% agarosgel. Koka agaros i en mikrovågsugn i 1-2 minuter med intermittent skakning, och låt den svalna i 5 minuter.
      2. Tillsätt 50 mg HPTS till 10 ml 1% -ig lösning, och blanda väl tills lösningen blir grön.
      3. Häll blandningen ovan till en 10 mm petriskål, och låt det stelna under 15 minuter.
      4. Skära de stelnade HPTS agaros med en skarp dissektion blad för att göra små agarosblock (0,5 x 2 cm ^2).
   2. Förbered växtprover för HPTS färglastanalys.
      1. Ställ en plattform för HPTS färgämnet lastning analys; placera ett mikroskop locket (24 x 50 mm ²⁾ på en ny MS-medium platta som visas i figur 3A.
      2. Punkt 3 dagar gamla etiolerad plantor från basen på kroken med hjälp av en vass kirurgisk sax.
      3. Omedelbartöverföra ovannämnda plantor (minst 5 plantor från varje bakgrund) på ytan av en mikroskopisk skyddsglas på ett sådant sätt att endast 0,5 cm av hypokotyl från excision skall förbli på locket, och resten av hypokotyl ska röra mediet såsom visas i figur 3B.
      4. Placera HPTS agaros blocket på toppen av hypokotyl (med en utskuren nålen) under 5 minuter på ett sådant sätt att den exciderade området vidrör HPTS agaros blocket.
      5. Efter fem minuter av lastning, ta bort agarosen kvarter från hypokotyl yta, överföra hypokotyler till 10 mm petriskål med DDH ₂ O och tvätta hypokotyler i DDH ₂ O i 15 minuter med kontinuerlig skakning.
   3. Förbered Prover för konfokalmikroskopi.
      1. Välj minst 5 plantor från varje bakgrund för observation under konfokala laserskanning mikroskop.
      2. I laser kanal, ställ in våglängden på 488 nm för specifik exklitation och 500-550 nm för bandpassemissions.
      3. Överför plantor i 2 set (ett Col-0 + en mutant) till en ny objektglas efter tvättning med DDH ₂ O. Lägg 100-150 il dubbeldestillerat vatten till objektglaset, och täck med en locket. Flytta fingret till skede av konfokalmikroskop.
      4. Fokusera hypokotyl regionen (med en 20X eller 40X objektiv) med hjälp av ljus-fält (vitt ljus) belysning. Sedan skanna bilder för fluorescens.
      5. Ta bilder i minst 10 uppsättningar, och jämföra de två bakgrunder genom att kontrollera omfattningen av färgämne rörelse ur lastning.
         Obs: Mutant / överuttryck linjer med förändrad symplasmic rörelse kommer att visa olika mönster av färg belastning jämfört med vildtyp Col-0.
2. Analysera Callose Nivå i Mutant / överuttryck Lines Visar Förändrad Phototropic och Gravitropic Response och Visar Distinkt HPTS Dye Rörelse Compared Col-0.
   1. Förbereda anilinblått callose färgning färgämne.
      1. Göra en M glycin, pH 9,5 och 0,1% (W / V) anilin blå i autoklaveras DDH ₂ O.
      2. Gör färgning buffert genom att blanda 0,1% anilin blå och 1 M glycin i 2: 3 volymförhållanden. Till exempel, för 50 ml färgningsbuffert, ta 20 ml av 0,1% anilin blått och 30 ml 1 M glycin. Obs! Färgning buffert minst 48 timmar före användning och förvara den i mörkret.
   2. Fläck böjda eller icke-böjda plantor med callose specifika anilin blå färg.
      1. Att inhibera de novo callose syntes under färgningsprocessen, tillsätt den slutliga volymen av 1,5 mM 2-deoxi-D-glukos (DDG) till 50 ml färgningsbuffert.
      2. Ta tre dagar gamla etiolerad plantor för callose färgning (med eller utan vändkrets svar).
      3. Skär plantor från sin krok regionen med hjälp av tunna kirurgiska saxar.
      4. Överför plantorna i en liten petriskål innehållering 2 ml färgningsbuffert med hjälp av spetsen på en tandpetare.
      5. Inkubera plantorna med färgning buffert i mörker under 2 h med kontinuerlig skakning vid 30 rpm.
      6. Efter färgning, tvätta plantorna med DDH ₂ O under 2 min för att avlägsna överskott färgning buffert.
      7. Välj minst 5 plantor för varje växt bakgrund för observation under konfokala laserskanning mikroskop.
   3. Förbered prover för konfokalmikroskopi:
      1. Överför plantor i set (ett Col-0 + en mutant) för att rengöra objektglas efter tvättning med DDH ₂ O.
      2. Lägg 100-150 mikroliter av DDH ₂ O och täck med en locket. Flytta fingret till skede av konfokalmikroskop.
      3. I en laser kanal, ställ in våglängden på 405 nm för specifika excitation och 500 till 550 nm emission för avbildning av anilin blå fluorescens.
      4. Ta hypokotyl regionen i fokus, först med 10X och senr med 20X eller 40X objektiv med hjälp av ljusfält (vitt ljus) belysning.
      5. Sedan, slå på filtrerat ljus, skanna bilderna för fluorescens, och spara bilderna.
      6. Mät callose signalintensiteten med ImageJ programvara (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (Se figur 4).
         1. Ändra formatet av konfokalmikroskopi bilder från Olympus Image binärt format (* .oib) till JPEG-format. Obs: Endast JPEG-format stöds av ImageJ programvara.
         2. Starta ImageJ programmet genom att dubbelklicka (Figur 4A). Notera: Pilar indikerar rektangeln verktyget som skall användas i den callose intensitetsmätning (figur 4B).
         3. Klicka på "fil" följt av sub-alternativet "öppna" i ImageJ verktygsfältet och öppna mikroskopi bilder som sparats i JPEG-format för att mäta callose intensitet (figur 4C).
         4. Klicka på rektangulära ikonen på Imagej verktygsfältet (Figur 4D).
         5. För att analysera signalstyrkan, dra markören över bilden och välj det område som ska undersökas (Figur 4E)
         6. Mäta och registrera de numeriska värdena för signalstyrkan genom att trycka på "M" på tangentbordet (Figur 4E). Obs: Resultatet filen öppnas separat (Figur 4F).
         7. Mäta och registrera intensitetsvärdena ett efter ett för alla de plantor från varje växt bakgrund.
            Notera: I ImageJ, resultatfilen "Mean" anger signalintensiteten hos den valda "Area".
      7. Kopiera medelvärden från ImageJ resultatfilen och klistra in kalkylarket för kvantitativ analys.
      8. För kvantitativ analys, göra ett stapeldiagram schema med statistiska test, inklusive barer standard fel och sannolikhetsvärden (Figur 4).
         1. Mäta den genomsnittliga signalintensiteten(medelvärde från ImageJ) för varje bakgrunden med hjälp av kalkylprogram "formler" verktyg (Figur 4G).
         2. Analysera standardavvikelsen mellan replikat för varje mätning med hjälp av kalkyl "formler" verktyg (Figur 4G).
         3. Beräkna medelfelet (SE) med hjälp thespreadsheet "formler" verktyg.
            Notera: SE = s / √ n, där (n) är standardavvikelsen av befolkningen, och (n) är storleken (antalet observationer) av provet.
         4. Testa betydelsen av resultaten genom att applicera en t-test med den genomsnittliga signalintensiteten och standard felvärden som beräknats såsom nämnts ovan.
         5. Rita ett stapeldiagram schema med hjälp av de ovan nämnda värdena grafiskt representerar den kvantitativa skillnaden i callose nivå mellan två olika bakgrunder med hjälp av kalkylprogram "insert" verktyg (figur 4H).
            Obs: Mutant / överuttryck rader av starka kandidater shur olika nivåer av callose jämfört med vildtypen, såsom ingen callose, lite callose eller hyper PD callose ackumulering.

Representative Results

I den aktuella konfigurationen, dexametason (dex) -inducerbara RNAi rader AtGSL8 [nedan dsGSL8 (+ dex / -dex)] användes som homozygota gsl8 T-DNA-inser mutanter plantor dödlig ^18. Tre dagar gamla etiolerad plantor av dsGSL8 och vildtyp plantor med ± dex utsattes för phototropic och gravitropic stimuli. Vi fann att dsGSL8 (+ dex) plantor var defekt i FOTOTROPISM och gravitropism ^15. Figur 5 visar tydligt att dsGSL8 (+ dex) uppvisar ingen böjning under påverkan av både FOTOTROPISM och gravitropism. Vidare förändring i symplasmic rörelse i dsGSL8 (+ dex) och dsGSL8 (-dex) eller Col-0 analyserades med en HPTS lastanalys. I överensstämmelse med våra tidigare fynd, den HPTS färgämnet rörelsen i dsGSL8 (+ dex) var betydligt mer omfattande än i dsGSL8 (-dex) eller Col-0, figur 6. Callose är en av de viktiga regulatorer för PD SEL, och AtGSL8 är känd som en PD callose syntas ^16. Dessutom var callose anilin blå färgning utföras och dsGSL8 (+ dex) har ihärdigt visat en låg PD callose nivå före och efter tropiska svar, såsom visas i figur 7.

Figur 1. Flödesschema av stegen som är involverade i stimuleringen av phototropic och gravitropic svar. (A) Överföring vertikalt odlade plantor från olika växt bakgrunder till en platta, men i separata rader. (B) För FOTOTROPISM hålla plattorna vända mot ensidig vitt ljus i en mörk låda som öppnas på en sida. För gravitropism, först linda plattorna med aluminiumfolie, rotera 90 °, och överför till en mörk låda (covered från alla sidor). (C) med hjälp av en scanner, scanna plattorna efter olika tidsintervaller, såsom 1,5 h, 3 h, 6 h och 12 h. (D och E) Dessa paneler visar dataframställning från ImageJ och dataanalys med hjälp av kalkylark, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Mätning av böjningsvinkeln av ImageJ. (A) Se bild J-programmet genom att dubbelklicka. (B) De stora verktyg som användes i vinkelmätningen. (C) Öppna "File" alternativet följt av sub-alternativet "öppna" i bild J verktygsfältet för att öppna mikroskopi bilder som sparats i JPEG-format. (D (F) Sammanfattning av vinkelmätning: abc definierar en fast A, och den sanna böjningsvinkel beräknas som B, som är lika med 180 ° - A. (G) linje som representerar avståndet från punkt a till punkt b. (H) Kontinuitet i linje ab peka c göra A. (I) Resultat fil av Image J visar Ett värde. (J) Representant kalkylbladsfil visar den genomsnittliga böjning vinkelmätningar, standard avvikelser, standardavvikelser och t-test beräkningar. (K) Stapeldiagram diagram som visar böjningsvinkelmätningar mellan två olika växt bakgrunder Col-0 och dsGSL8 EMS muterade. Felstaplar är SEM (standardfel av medelvärdet +) och *** representerar betydelsen av T-test (p-värde> 0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Översikt över de steg som är involverade i HPTS laddnings analysen. (A) Panel visar framställningen av HPTS agaros block. (B) Panelen representerar excision och överföring av plantor och lastning av HPTS agaros block. (C) Panelen visar de steg som är involverade i provförberedelse för konfokal avbildning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Mätning av callose intensiteten med ImageJ. (A) Se ImageJ programmet genom att dubbelklicka. (B) De viktiga verktyg som användes i callose intensitetsmätning. (C) Öppna "File" alternativet följt av sub-alternativet "öppna" i ImageJ verktygsfältet för att öppna mikroskopi bilder som sparats i JPEG-format. (D) Den rektangulära ikonen på ImageJ verktygsfältet. (E) Den valda området i bilden för att analysera callose intensitet. (F) ImageJ resultatfilen visar callose intensitetsvärdet som "Mean". (G)Representativ kalkylblad visar den genomsnittliga callose intensitetsmätningar, standardavvikelser, standardavvikelser och t-test beräkningar. (H) Stapeldiagram schema som representerar den callose intensitetsskillnad mellan de två växt bakgrunder. Felstaplar är SEM (standardfel av medelvärdet +) och *** representerar betydelsen av T-test (p-värde> 0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5. Minskning av AtGSL8 uttryck leder till defekt tropiska svar. (A) Phototropic svar visade genom dsGSL8 (± dex) tillsammans med Col-0. (B) Gravitropic svar framgår av dsGSL8 (± dex) al ong med Col-0. dsGSL8 (+ dex) visar inga phototropic eller gravitropic responser. dsGSL8 (+ dex) och dsGSL8 (-dex) symboliserar dexametasonbehandlade och obehandlat dsGSL8 -inducerbara RNAi linjer, respektive. Skala stapel representerar 0,2 cm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6. symplasmic rörelsen ökade efter undertryckandet av AtGSL8. Fluorescensbilder togs efter HPTS belastning dsGSL8 ± dex hypokotyl skurna ytor tillsammans med vildtyp Col-0. DsGSL8 (+ dex) visade mer omfattande rörelse HPTS färgämne, att visa på ökade symplasmic rörelse. Skala stapel representerar 0,2 mm.com / filer / ftp_upload / 53.513 / 53513fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7. AtGSL8 tryckta linjer visade symmetrisk PD callose fördelning mellan belysta och skuggade sidor av hypokotyl. (A) Fluorescens bild som visar anilin blå callose färgning för dsGSL8 (-dex) vid 0 timmar. (B) Fluorescens bild visar anilin blå callose färgning för dsGSL8 (-dex) efter sex timmar av FOTOTROPISM. (C) Fluorescens bild som visar anilin blå callose färgning för dsGSL8 (+ dex) efter sex timmar av FOTOTROPISM. Gula pilar indikerar callose samlas på skuggade området av hypokotyl. Skala stapel representerar 50 pm. (D) Stapeldiagram schema representerande amount av PD callose som samlats i dsGSL8 (± dex) hypokotyler före och efter tre timmar och 6 timmar av FOTOTROPISM. Fluorescens foci intensiteter mättes från tio oberoende hypokotyler (data är medelvärde ± SD; t-test, * p <0,01). Denna siffra har modifierats (Han et al., 2014) ^15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

I detta manuskript, en strategi skärm mutant / överuttryck linjer som är defekta i phototropic och gravitropic svar på grund av förändrad PD callose och därmed är PD SEL beskrivs i detalj. PD callose syntes och nedbrytning i huvudsak åstadkommas genom callose syntaser och β-1,3-glukanaser, men reglering av dessa enzymer styrs av många uppströms faktorer. För att söka efter sådana uppströms faktorer eller kandidater som är direkt involverade i PD reglering, har vi satt upp denna metod för screening. Denna inställning har vissa begränsningar som mutanter av vissa nyckelenzymer som reglerar PD callose biosyntes (gsl8) är dödliga ¹⁵ och att reda ut sådana mutanter skulle begränsas av detta inrättas. Dessutom, om kandidatgenen visar snabbare eller långsammare tropism respons tillsammans med öppen eller sluten PD, men callose nivån förblir oförändrad, då behövs detaljerad analys för att ytterligare karakterisera sådana kandidater. De kritiska faktorerna och felsökning proceSSES i varje steg är också utarbetas. Först, i medium beredning, en kritisk faktor som kan påverka de planttillväxt är pH i de medier, som bör sträcka sig från 5,7 till 5,8. För det andra är det viktigt lämplig yta torkning av agarplattor; det skulle vara svårt att lyfta 3 dagar gamla plantor utan skador från agarplattor med hög vattenhalt. Däremot kan alltför mycket torkning av agarplattor orsaka vissa sprickor i medierna under inkubation och resultera i osymmetrisk planttillväxt. Under ytsterilisering av frön med användning av natriumhypokloritlösning, måste försiktighet vidtas för att avlägsna natriumhypoklorit helt genom upprepad tvättning med autoklaverat DDH ₂ O, eftersom det är en stark blekmedel. Autoklaveras DDH ₂ O bör beredas och hanteras aseptiskt, som gamla lager kan orsaka svampkontaminering i MS-plattor. Efter sterilisering, är frön stratifierat efter kylbehandling för att synkronisera groning. Denna process kan utföras antingen genom transferring steriliserad våta frön direkt till ett kallt rum i mörker eller först utspridda fröna på MS-plattor och sedan överföra plattorna till ett kallt rum i mörker. Vi föredrar emellertid den senare eftersom det ger en mer likformig tillväxt av plantor. Medan utspridda frön, bör avståndet mellan två intilliggande frön vara minst 0,1 cm eftersom mycket nära prickade frön skulle resultera i utvecklingen av överlappande plantor, som är mycket svårt att överföra i efterföljande experiment.

För att få rätt phototropic och gravitropic svar bör plantor inte utsättas för ljus och bör förbli oskadade. För att undvika bakgrundseffekter av vitt ljus, noggrant välja plantorna enligt en grön ljuskälla i det mörka rummet som växter inte svarar på grönt ljus. Grön ljuskälla kan genereras genom att täcka den vita ljuskällan med hjälp av transparenta gröna vinyl ark. För att välja plantor, är en steriliserad tandpetare det bästa alternativet. röra the mycket nedre delen av hypokotyl med tandpetare för att lyfta plantorna så att de lätt kan överföras till en ny platta. Alla plantor bör vara likartade i storlek och krokorientering. Under våra experiment, såg vi att om kroken riktningen är på den motsatta sidan av ljuskällan, kommer växter visar en snabbare tropism respons än plantor med samma krok riktning som ljuskälla. Normalt när det gäller FOTOTROPISM, kan man se en tydlig skillnad i böjningsvinkeln mellan sanna kandidater och Col-0 inom tre timmar, medan i fallet med gravitropism, tar det oftast 6-12 timmar. Slutligen, för att ha statistiskt relevanta uppgifter, minst tre biologiska replikat och 20 plantor behövs varje gång.

För att testa graden av symplasmic rörelse mellan olika växt bakgrunder, är HPTS färgämne lastning en lämplig teknik, eftersom det inte behöver sofistikerade verktyg och instrument. För HPTS lastanalys, andelen gel i HPTS agarosblock är av stor betydelse, eftersom en mycket skör eller hård gel kommer inte att ge optimala resultat. Det är bättre att använda en 50 ml konisk kolv med lös gummi och att inte använda en stor volym kolv för kokande agaros med 10 ml vatten. HPTS agarosblock kan användas för en vecka efter beredning om hålls inslagna med aluminiumfolie vid 4 ° C. En annan viktig faktor i HPTS last analys är excision av hypokotyl kroken regionen. Excision bör utföras med vassa dissektion sax och en liknande position för alla plantor. Excision med trubbiga saxen kan orsaka oönskade skador på plantor och kan hindra HPTS belastning. Dessutom kan de planttillväxtbetingelser och utvecklingsstadier spelar en avgörande roll i färg rörelse, som callose ackumulering är mer benägna att svara på sådana förändringar, som slutligen står för hinder i färg rörelse. Således är det nödvändigt att odla plantorna under optimala förhållanden. Callose på PD spelar en nyckelroll itropiska svar etiolerad plantor genom att reglera PD SEL, vilket är viktigt för auxin lutning bildning ^15. Callose nivåer kan detekteras genom färgning med anilin blå eller immunogold märkning. Färgning med anilin blå är en enkel och snabb metod för att detektera callose nivå. Eftersom hypokotyla celler har hög saftspänningen och en epi-ytterhudsskiktet, är det inte lätt för färgämnet att penetrera cellerna. Därför utvecklade vi cut-färgningsmetoden för att möjliggöra anilin blått färgämne att tränga lätt. Det finns dock en risk för syntes av nya callose som kan påverka färgningsresultaten, vilket är en begränsning av den normala callose färgningsmetoden. För att undvika sådana effekter är färgningsprotokollet modifieras genom att tillsätta callose syntashämmare 2-D-deoxi glukos (DDG) till färgning buffert. Således innebär detta protokoll mätning av preexisterande callose endast i det nedre området av hypokotyl som är exakt under cut site. Undvik att använda nyligen prepared anilin blå, och hålla anilinen blåa lösningen vid RT under ett minimum av 48 h före användning. Vi märkte att färgning med färsk anilin blå lösning inte ger optimala callose färgningsresultat.

Sammantaget har vi presenterat ett antal strategier som kan användas för snabb screening av mutanter / överuttryck linjer med en defekt eller förbättrad vänd svar genom att ändra PD SEL genom att direkt eller indirekt modulera PD callose. En tidigare faktum om tropiska svar var majorly begränsad till verkan av auxin bärare och signalering aktörer, som PINIOD ^2-14. Dessutom har vi också etablerat en kritisk roll symplasmic rörelse auxin upprätthålla en auxin gradient i hypokotyl systemet ^15. Enkelheten och mångsidigheten hos denna metod förstärker otvivelaktigt dess användbarhet i att undersöka kandidatgener för deras reglering av PD SEL och därmed spelar en viktig roll i växtutveckling, inklusive tropiska svar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt)	Sigma	H1529-1G	Fluorescent dye as symplasmic tracer
LE Agarose	Dongin-Genomic	GEL001-500G	Used for HPTS agarose block
Microwave oven	LG-Goldstar		Machine for boiling agarose gel
100 ml glass conical flask	Dong Kwang	A0205	Used to boil HPTS agarose gel
Petri dish (35 mm x 10 mm)	SPL life sciences	SPL10035	Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples
Microscope cover slides and glass slides (24 mm x 50 mm)	Marienfeld Laboratory Glassware	101222	Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation
MS medium plates 125 mm x 125 mm x 20 mm	SPL life sciences	SPL11125	Plates to make MS agar medium
Scissors	Germany Stainless	HSB 942-11	Used to excise hook region of plant samples
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture	Duchefa	P10453.01	MS medium including vitamins.
(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate	Bioshop	3G30212	To make MS media.
Plant agar	Duchefa	P1001.1000	To solidify MS media.
Autoclave	ALP	CL-40L
Shaker	Wise Mix	SHO-1D	To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way.
1 ml Blue tips	Sorenson	10040
1 ml pipette	BioPette	L-1101-2
Surgical tape	MIcropore	1530-0	To seal the MS plate
Aniline blue (Methyl blue)	Sigma	M5528-25G	Used to prepare aniline blue staining buffer.
Glycine	Bioshop	GLN001	Used to prepare aniline blue staining buffer.
DDG	Sigma	D8375-1G	Used for the inhibition of callose synthases.
Confocal microscope	Olympus	FV1000MPE SIM	To check aniline blue staining and HPTS dye loading result.
Stirrer	I lab	K400	To mix media solution.
Aluminium foil	SW cooking foil		To wrap plates in a dark condition.
Sodium hypochlorite	Samjin Industry		To surface-sterilized seeds