Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Стратегия для обоснования роли каллозы опосредованной Plasmodesmal воротного в Tropic Response

Published: April 17, 2016 doi: 10.3791/53513
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 1
1Division of Applied Life Science (BK21 plus program), Plant Molecular Biology and Biotechnology Research Center, Gyeongsang National University, 2Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences
* These authors contributed equally

Summary

В данной статье описаны способы скрининга генов, контролирующих plasmodesmal проницаемость и, следовательно, градиент ауксина во время реакции тропика. Это включает в себя измерение степени троповых ответа в гипокотиля из Резуховидка Таля и проверки plasmodesmal проницаемости по 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic кислоты (HPTs) загрузки и оценки , наконец , каллозы уровня.

Abstract

Ауксина растений гормон играет важную роль во многих роста и развития процессов, в том числе трофических реакции на свет и силу тяжести. Создание градиента ауксина является ключевым событием приводит к фототропизма и геотропизм. Ранее было показано, полярный транспорт ауксина (PAT), чтобы создать градиент ауксина в различных клеточных доменах растений. Тем не менее, Хан и др. Недавно продемонстрировали , что для правильного формирования ауксина градиента, plasmodesmal мозолистый-опосредованной symplasmic связность между соседними ячейками также является критическим фактором. В этой рукописи, стратегия для выяснения роли конкретных генов, которые могут повлиять на фототропизм и геотропизм путем изменения symplasmic соединений посредством модулирования plasmodesmal синтеза каллозы, обсуждается. Первым шагом является скрининг аберрантных ответов Тропик от 3-дневных этиолированных проростков мутантов или сверхэкспрессии линий гена наряду с диким типом. Этот предварительный скринингможет привести к идентификации целого ряда генов, функционирующих в PAT или контролирующих symplasmic подключения. Второй скрининг включает в себя сортировку кандидатов, которые показывают измененные Тропик реакции, воздействуя symplasmic подключения. Для решения таких кандидатов, движение в symplasmic трассирующими и осаждение plasmodesmal каллозы были исследованы. Эта стратегия будет полезна для изучения новых генов-кандидатов, которые могут регулировать symplasmic соединения прямо или косвенно в процессе трофических реакций и других процессов развития.

Introduction

Растения, как и сидячих живых организмов, разработали очень сложную сеть от клетки к клетке сигнализации для решения различных экологических стимулов. Tropic ответы являются одним из явлений, с помощью которых растения реагируют на стимулы окружающей среды. Растения показывают два основных тропическое отклики, фототропизм и геотропизм. Фотосинтетические растения согнуться в сторону источника света путем фототропизма собрать максимальное количество энергии. Точно так же, геотропизм делает растения растут в сторону центра тяжести. Фундаментальный механизм , приводящий к таким трофических реакций предполагает асимметричное образование градиентной фитогормонов ауксина 1. Акт формирования локального градиента ауксина хорошо характеризуется; гены, которые участвуют в этом механизме представляют собой дорожную карту для действия гормонов 2-8. Конкретное положение ауксина эффлюксных носителей, таких как PIN - сформированным (PIN) и Р-гликопротеины, выполняет движение ауксина из цитоплазмы в клеточной стенке клетки донора 9,10. Furthermore, активным Н + / IAA symport активности ауксина притока носителей, таких как AUX1 / LAX белков семейства, ауксина, наконец , доставлены в соседние ячейки 2,11,12 приемника. Это направленное движение ауксина известен как полярный ауксина транспорта (PAT). РАТ приводит к распределению дифференциальной ауксина на различных стадиях развития , и в ответ на различные стимулы , окружающую 13,14. Кроме того, нарушение в локализации или экспрессии любого из этих ауксина притока или оттока носителей приводит к сильному изменению в PAT, что приводит к нарушению градиента ауксина, что приводит к дефектам развития. В последнее время , Хан и др. сообщили , что регулирование plasmodesmal также необходимо для поддержания ауксина градиента 15. На сегодняшний день, более 30 plasmodesmal белки были идентифицированы 16. Среди этих белков, AtGSL8 было сообщено в качестве ключевого фермента синтеза каллозы в плазмодесмами (PD) и, следовательно, играет жизненно важную роль в MAINTAining предел PD размер исключения (SEL). Репрессированные выражение AtGSL8 привело к искажению рисунка ауксина градиента , приводящей к троповых без ответа , в отличие от дикого типа рассады 15.

В этой рукописи, методы, чтобы исследовать новые гены-кандидаты, которые участвуют в регуляции ПД предусмотрены. AtGSL8 был использован в качестве модели белка, чтобы проверить эти методы, поскольку это является ключевым ферментом способствует PD каллозы биосинтез. Благодаря питомничество летальности gsl8 нокаутных мутантов 17, дексаметазон (Dex) -inducible линии RNAi использовались в соответствии с ранее опубликованного доклада 15. Стратегия, представленная здесь, может быть адаптирована для скрининга генов, ответственных в ответ гипокотиля троповых контролируемой PD SEL.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Скрининг Мутанты с измененными фототропным и ГРАВИТРОПИЧЕСКУЮ Ответы

  1. Приготовьте 1х Мурашига и Скуга (MS) среды, рН 5,7, 0,8% агаром за один день до эксперимента.
    1. Добавить 800 мл дважды дистиллированной воды в 2-литровую коническую колбу и перемешивают магнитной мешалкой.
    2. Добавить 4,4 г MS соли в коническую колбу.
    3. Добавить 0,5 г 2- (N-морфолино) этан сульфоновой кислоты (MES) и перемешивают, пока все соли полностью не растворится.
    4. Доводят рН среды до 5,7 с помощью 1 М КОН.
    5. Перенести среду к массовому цилиндру и довести конечный объем до 1 л с DDH 2 O.
    6. Вылейте обратно в среду в 2 л коническую колбу и добавляют 8 г растительного агар.
    7. Оберните рот коническую колбу плотно с алюминиевой фольгой.
    8. Автоклава среде МС и DDH 2 O в течение 15 мин при температуре 121 ° С, 15 фунтов на квадратный дюйм, и после того, как автоклавирование, держать среды в 60 ° С инкубатор и DDH 2 O при комнатной температуре,
    9. После охлаждения до 60 ° С, влить среду в 125 х 125 х 20 мм 3 квадратных пластин на скамейке ламинарного потока (50 мл в каждой пластине).
    10. Дайте агар затвердевать при комнатной температуре в течение приблизительно 1 ч, поддерживая пластины частично открытыми. Если пластины не используют сразу, запечатать их с помощью полиэтиленовой пленкой и хранят при температуре 4 ° С в холодильнике.
  2. Поверхностно-простерилизовать семена с 1,1% раствором гипохлорита натрия и точка семена на чашках 1x МС, которые были получены в разделе 1.1.
    Примечание: Здесь Резуховидка Таля {Col-0 семена, dsGSL8 (Col-0)} 15 используются для ответа тропика, каллозы окрашивания и HPTs загрузки Резуховидка Таля {Col-0 и dsGSL8 (Col-0) EMS мутанта} семян (. неопубликованные) используются для ответа троповых на рисунке 2.
    1. Автоклав 300 мл DDH 2 O в бутылке.
    2. Добавьте около ста семян для каждого фона, т.е.Мутант / сверхэкспрессии линии и (Col-0) Семена, дикого типа в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
    3. Вынуть 1x MS агар Тарелки из C холодильника 4 ° и высушить их на скамейке ламинарного потока в частично открытом положении.
    4. Поверхностно-простерилизовать семена путем добавления 1 мл раствора 0.2x отбеливателя (1,1% гипохлорита натрия) и держать микроцентрифужных трубки на качалке при 250 оборотах в минуту в течение 5 мин.
    5. Пусть семена оседают на дно под действием силы тяжести, а затем удалить раствор отбеливателя по микропипетки.
    6. Добавьте 1 мл свежего DDH 2 O (автоклавируют) на семена и хорошо перемешать, переворачивая микроцентрифужных трубки несколько раз. Пусть семена оседать, а затем снова удалить воду.
    7. Повторите шаг 1.2.6 5-6 раз.
    8. Добавить в два раза больше количества воды в объеме семян, оставшихся после окончательной промывки.
    9. Дот стерилизованные семена на Полусушенные 1x MS агаром, используя наконечник 1 мл микропипетки, содержащую 200 мкл семян (ввода числе).
      1. Хранить примерно на расстоянии 0,1 см между двумя семенами и минимум 1,8 см между двумя рядами семян. Dot семена в пять горизонтальных рядов на квадратный пластины (125 х 125 х 20 мм 3). Дайте воде немного высохнуть, прежде чем поместить крышку на тарелку.
    10. Уплотнение пластин с хирургической лентой, укладывают все из пластин вертикально, и обертывают алюминиевой фольгой.
    11. Передача обернутые пластины в темный ящик (без доступа к свету). Затем держать темную коробку в 4 ° C комнатной / холодильнике в течение 3-х дней.
    12. Начиная с этого этапа, держать направление пластин в неизмененном виде. После 3-х дней лечения простуды, держать темную коробку в комнатной культуре растений при 22 ° С в течение следующих 3-х дней. После 3-х дней, проверьте состояние всхожести семян под зеленым светом в темной комнате.
      Примечание: Обычно 3 дневных Col-0 этиолированные проростки может вырасти до 1,6 см в длину.
  3. Анализировать измененную фототропным Aй ГРАВИТРОПИЧЕСКУЮ ответ на мутантов или сверхэкспрессии линий конкретного гена. Выберите только одинакового размера, так и вертикально выращены прямые рассаду под зеленым светом в темной комнате. Передача выбранных рассаду на свежий агар пластины 1x MS, используя наконечник стерилизованную зубочисткой.
    1. Осторожно выбрать рассаду из самой нижней части их гипокотиля, не касаясь каких-либо других частей. Убедитесь, что все сеянцы имеют одинаковую ориентацию семядолей / крючок, и после передачи, что ориентация рассады крючки остаются прежними. Используйте как минимум 20 саженцев каждого фона в каждой строке и как минимум двух пластин для каждой временной точки для дальнейшего анализа.
      Примечание: Четыре различных фона можно сравнить в каждой пластине (4 строки).
      Дополнительно: При использовании дексаметазона (DEX) -inducible RNAi / сверхэкспрессии линии, передавать вышеуказанные рассаду на 1x MS пластины вместе с + DEX пластины MS (плита, содержащая 1x MS, 0,8% среднего агар с добавлением 20 мкМ DEX) FOг 3 ч и держать пластины в вертикальном положении в темном поле.
    2. Для проверки фототропным ответа, передать вышеуказанные пластины вертикально к черному ящику только с одной стороны открыт. Перенести черный ящик, содержащий пластины в камеру для выращивания растений с односторонним белым светом. Для того, чтобы обеспечить одностороннее освещение, поместите край пластины по направлению к источнику света (не на передней стороне). Обратитесь к установке на рисунке 1.
    3. Точно так же, чтобы проверить ГРАВИТРОПИЧЕСКУЮ ответ, держать пластины с вертикальными перенесенных сеянцев, и накрыть алюминиевой фольгой. Затем измените ориентацию пластины по вертикали до 90 ° и держать его внутри черного ящика покрыта со всех сторон. Обратитесь к установке на рисунке 1.
    4. После заданных моментов времени (как правило, 1,5 ч, 3 ч, 6 ч и 12 ч) сканировать пластины с помощью сканера, а также сохранять изображения в формате JPEG.
    5. Измерьте угол изгиба рассады с использованием ImageJ программного обеспечения (http://imagej.nih.gov/ij/index.html~~HEAD=dobj) (рисЮр 2).
      1. Запустите программу ImageJ двойным щелчком (рис 2А).
        Примечание: Основные инструменты , которые были использованы при измерении угла показаны на рисунке 2B.
      2. Нажмите кнопку "файл" , а затем Подвариант "открытой" на панели инструментов ImageJ и открытых снимков , сохраненных в формате файла JPEG для измерения Тропик угол изгиба (рис 2C).
      3. Выберите инструмент увеличительного для увеличения или уменьшения масштаба на картинке, нажав левую или правую кнопку мыши, соответственно , как показано на рисунке 2B.
      4. Выберите инструмент прокрутки , чтобы перетащить и поместить изображение (рисунок 2D) .next выберите инструмент угла для измерения угла изгиба (рис 2E).
        1. Сделайте двойной левый клик на оригинальный гипокотиля точки роста направления 'а', перетащить мышью изгиба точки инициации 'B' (рис 2F), и нажмите левую прикладна нарисовать первую линию (рис 2G).
        2. Перетащите мышь от точки Ь до изгибающий конечной точке 'C', и нажмите левую кнопку мыши , чтобы нарисовать вторую линию (рис 2H) и образуют фиксированный угол A. Примечание: истинный угол изгиба угол В, которая равна 180 ° - угол А. (рис 2F).
        3. Измерение и запись угол Побочным нажав 'M' на клавиатуре. Файл результат будет открыть отдельно , как показано на рисунке 2I. Измерьте и запишите все сеянцы один за другим. Например, сначала измерить угол изгиба для всех гипокотилях от Col-0 , а затем в течение мутантных линий.
    6. Передача набора данных из ImageJ в файл электронной таблицы, чтобы сделать аудиовидеоприемникеняя гибки углов каждого фона.
    7. Для количественного анализа, сделать диаграмму гистограммы со статистическими результатами испытаний, в том числе стандартные панели ошибок и значений вероятности (смотри рисунок 2).
      1. Вычислить истинную сгибание угол Б, а также разработать формулу , используя таблицу, то есть, угол В = 180 ° - угол Заметка: угол А представляет собой значение, которое было получено из анализа ImageJ.
      2. Измерьте средний угол изгиба угол B для каждого фона с помощью электронных таблиц инструментов (Рисунок 2j).
      3. Анализировать стандартное отклонение между повторами для каждого измерения с использованием электронных таблиц "формул" инструмент (рис 2J).
      4. Проверьте сиговыхnificance результатов путем применения Т-тест для среднего угла изгиба и стандартного отклонения, вычисленных, как указано выше.
      5. Нарисуйте диаграмму бар , используя вышеуказанные значения для графического представления количественной разницы в угол изгиба между двумя различными уровнями подготовки с использованием электронных таблиц "вставки" инструмент (рисунок 2K).
        Примечание: Мутант / сверхэкспрессии линии сильных генов-кандидатов покажет четкие различия в отношении дикого типа, например, не изгибая, быстрый или медленный изгиб изгиб.

2. Завод Экран Линии с неисправными Tropic Ответы в связи с изменением PD SEL с видоизмененной PD каллозы Level

  1. Выполните гипокотиля Загрузка Пробирной на 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic кислоты (HPTs) Dye Загрузка на вершине сеянцев с HPTs агарозном блоков и сравнить движение красителя между Mutant / Over-мимические и Col-0.
    1. Приготовьте HPTs AgaroSE блоки для анализа гипокотиля загрузки.
      1. Взять 10 мл DDH 2 O в 50 мл коническую колбу и добавляют 0,1 г агарозы , чтобы приготовить гель 1% -ном агарозном. Кипение агарозы в микроволновой печи в течение 1-2 мин с прерывистой встряхивании, и дайте ему остыть в течение 5 мин.
      2. Добавить 50 мг HPTs до 10 мл 1% раствора агарозы, и хорошо перемешать, пока раствор не станет зеленым.
      3. Налейте вышеуказанную смесь до 10 мм чашки Петри, и позволяют ему затвердеть в течение 15 мин.
      4. Обрежьте затвердевшей HPTs агарозы с острым рассечение лезвием , чтобы сделать небольшие агарозном блоки (0,5 х 2 см 2).
    2. Подготовить образцы растений для красителя загрузки анализа HPTs.
      1. Установите платформу для анализа HPTs загрузки красителя; поместите микроскоп крышку слайд (24 х 50 мм 2) на новой средней пластине MS , как показано на рисунке 3А.
      2. Акцизные 3 дневных этиолированных сеянцы из основания крючка при помощи острого хирургического ножничные.
      3. Немедленнопередача вышеуказанных рассады (минимум 5 саженцев от каждого фона) к поверхности микроскопический покровного стекла таким образом, что только 0,5 см гипокотиля из положения вырезании должно оставаться на скольз щей крышке, а остальная часть гипокотиля должна касаться среда , как показано на фигуре 3В.
      4. Поместите агарозный блок HPTs поверх гипокотиля (с вырезанным крюком) в течение 5 мин таким образом, что площадь Иссеченную прикасается агарозы блок HPTs.
      5. Через 5 мин нагрузки, снимите блок агарозы с поверхности гипокотиля, передавать гипокотили на 10 мм чашки Петри , содержащие DDH 2 O и моют гипокотили в DDH 2 O в течение 15 мин при непрерывном встряхивании.
    3. Подготовка образцов для конфокальной микроскопией.
      1. Выберите как минимум 5 саженцев от каждого фона для наблюдения под конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
      2. В лазерном канале, установите длину волны 488 нм для конкретного возбтации и от 500 до 550 нм для излучения полосовой.
      3. Передача рассады в 2 -х комплектов (один Col-0 + один мутант) к новому предметное стекло после мытья с DDH 2 O. Добавить 100-150 мкл дважды дистиллированной воды к слайду, и накрыть крышкой слайд. Сдвиг слайд на сцене конфокальной микроскопии.
      4. Фокус область гипокотиля (с 20х или 40х объективом) с использованием светлого поля (белый свет) освещение. Затем сканировать слайды для флуоресценции.
      5. Возьмите изображения в течение как минимум 10 комплектов, и сравнить два фона, проверяя степень движения красителя с точки погрузки.
        Примечание: Мутант / сверхэкспрессии линии с измененной symplasmic движения будут показаны разные модели загрузки красителя по сравнению с диким типом Col-0.
  2. Анализ уровня каллозы в Mutant / сверхэкспрессии линиями, показывающими Altered фототропным и ГРАВИТРОПИЧЕСКУЮ ответ и показывать Distinct HPTs Dye Движение COMPARред к Col-0.
    1. Подготовить анилина синий краситель мозолистый окрашивания.
      1. Сделать 1 М глицина, рН 9,5 и 0,1% (вес / объем) анилин синий в автоклавного DDH 2 O.
      2. Сделайте буфер окрашивания путем смешивания 0,1% анилина синий и 1 М глицин в 2: 3 объемных соотношениях. Например, в течение 50 мл окрашивающего буфера, принимать 20 мл 0,1% анилина синего и 30 мл 1 М глицина. Примечание: Убедитесь, окрашивание буфера минимум 48 часов до использования и хранить его в темноте.
    2. Пятно согнута или не согнута рассаду с каллозы конкретным анилина синего красителя.
      1. Ингибировать De Novo мозолистый синтеза в процессе окрашивания, добавить конечный объем 1,5 мМ 2-дезокси-D-глюкозы (DDG) до 50 мл окрашивающего буфера.
      2. Возьмите 3-дневных этиолированных сеянцы для каллозы окрашивания (с или без ответа троповых).
      3. Нарезать рассаду из их крючками области с помощью тонких хирургических ножниц.
      4. Перенесите саженцы в небольшую чашку Петри, содержатИНГ 2 мл буфера для окрашивания, используя кончик зубочистки.
      5. Инкубируйте рассаду с красильной буфером в темноте в течение 2 ч при непрерывном встр хивании при 30 оборотах в минуту.
      6. После окрашивания, промойте рассаду с DDH 2 O в течение 2 мин для удаления избытка буфера окрашивания.
      7. Выберите как минимум 5 саженцев для каждого фона растений для наблюдения под конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
    3. Подготовка образцов для конфокальной микроскопии:
      1. Перенесите саженцы в комплекте (один Col-0 + один мутант) для очистки микроскопа скользит после мытья с DDH 2 O.
      2. Добавить 100-150 мкл DDH 2 O и накрыть крышкой слайд. Сдвиг слайд на сцене конфокальной микроскопии.
      3. В лазерном канале, установите длину волны 405 нм для конкретного возбуждения и от 500 до 550 нм излучения для визуализации анилина синей флуоресценции.
      4. Принесите регион гипокотиля в центр внимания, сначала с 10х и поздног с 20х или 40х объективов с использованием светлого поля (белый свет) освещения.
      5. Затем включите фильтрованный свет, сканирование слайдов для флуоресценции, а также сохранять изображения.
      6. Измерьте интенсивность сигнала каллозы с программным обеспечением ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/index.html~~HEAD=pobj) (рисунок 4).
        1. Изменение формата конфокальной микроскопии изображений от Olympus Image двоичном формате (* .oib) в формат JPEG. Примечание: только формат JPEG поддерживается программным обеспечением ImageJ.
        2. Запустите программу ImageJ двойным щелчком (рис 4а). Примечание: Стрелки указывают инструмент прямоугольника для использования при измерении интенсивности мозолистый (фиг.4В).
        3. Нажмите кнопку "файл" , за которой следует Подвариант "открытой" в панели инструментов ImageJ и открытых изображений микроскопии , которые были сохранены в формате файла JPEG для измерения интенсивности каллозы (рис 4в).
        4. Нажмите прямоугольный значок на ИмаПанель geJ (Рисунок 4D).
        5. Для анализа интенсивности сигнала, переместите курсор мыши на изображение и выберите область для сканирования (рисунок 4E)
        6. Измерьте и запишите численные значения интенсивности сигнала, нажав 'M' на клавиатуре (Рисунок 4E). Примечание: Файл результат будет открыть отдельно (рис 4F).
        7. Измерьте и запишите значения интенсивности по одному для всех сеянцев от каждого фона растений.
          Примечание: В ImageJ, файл результата "Среднее" указывает на интенсивность сигнала выбранной "Area".
      7. Скопируйте средние значения из файла результатов ImageJ и вставить в файл электронной таблицы для количественного анализа.
      8. Для количественного анализа, сделать столбчатого диаграмму с статистических тестов, включая стандартные погрешностями и значений вероятности (рисунок 4).
        1. Измеряется средняя интенсивность сигнала(среднее значение от ImageJ) для каждого фона , используя таблицу "формул" инструмент (рис 4G).
        2. Анализировать стандартное отклонение между повторами для каждого измерения с использованием электронных таблиц "формул" инструмент (рис 4G).
        3. Вычислить стандартную ошибку (SE) с помощью thespreadsheet "формул" инструмент.
          Примечание: SE = s / √ п, где (s) является стандартное отклонение населения, и (п) размер (число наблюдений) образца.
        4. Проверка значимости результатов путем применения критерия Стьюдента к средней интенсивности сигнала и стандартных значений ошибки, вычисленных, как указано выше.
        5. Нарисуйте диаграмму гистограммы , используя приведенные выше значения для графического представления количественное различие в уровне каллозы между двумя различными уровнями подготовки с использованием электронных таблиц "вставки" инструмент (рис 4H).
          Примечание: Мутант / сверхэкспрессии линии сильных кандидатов будет sкак различные уровни каллозы по сравнению с диким типом, например, не каллозы, мало каллозы или гипер накопления PD каллозы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В текущей настройке, дексаметазона (DEX) -inducible RNAi линии AtGSL8 [далее dsGSL8 (+ Dex / -dex)] были использованы, так как гомозиготный gsl8 вставки Т-ДНК мутантов рассада летальный 18. Три-дневных этиолированных сеянцы dsGSL8 и диких саженцев типа с ± DEX подвергались фототропным и ГРАВИТРОПИЧЕСКУЮ раздражители. Мы обнаружили , что dsGSL8 (+ Ловкость) саженцы были дефектными в фототропизма и геотропизм 15. Рисунок 5 ясно показывает , что dsGSL8 (+ Dex) не обнаруживает сгибаясь под воздействием как фототропизма и геотропизм. Кроме того, изменения в symplasmic движения в dsGSL8 (+ Ловкость) и dsGSL8 (-dex) или Col-0 анализировали с помощью нагрузочного теста HPTs. В соответствии с нашим предыдущим выводом, движение HPTs красителя в dsGSL8 (+ Dex) была значительно более обширной , чем в dsGSL8 (-dex) или Col-0, рисунке 6. каллозы является одним из ключевых регуляторов PD SEL, и AtGSL8 известен как PD каллозы синтазы 16. Кроме того, мозолистый анилин синий окрашивание проводили, и dsGSL8 (+ Dex) упорно показали низкий уровень PD каллозы до и после того, как трофических реакций, как показано на рисунке 7.

Рисунок 1
Рисунок 1. Блок - схема шагов, которые участвуют в стимуляции фототропным и ГРАВИТРОПИЧЕСКУЮ ответов. (A) Передача вертикально выращены саженцы из разных слоев растений на одной пластине , а в отдельных строках. (B) Для фототропизма, держать пластины , обращенной к одностороннему белого света в темном поле, которое открывается с одной стороны. Для геотропизм, сначала обернуть пластины с алюминиевой фольгой, поворот на 90 °, а также передать в темный ящик (covered со всех сторон). (C) , с помощью сканера, сканирование пластины через равные промежутки времени, например, 1,5 ч, 3 ч, 6 ч и 12 ч. (D и E) Эти панели показывают генерацию данных из ImageJ и анализа данных , используя файлы электронных таблиц, соответственно. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Измерение угла изгиба с помощью ImageJ. (A) Просмотр изображения J программы двойным щелчком. (B) Основные инструменты , которые были использованы при измерении угла. (C) Откройте "Файл" вариант , за которой следует Подвариант "открытой" в Image J панели инструментов , чтобы открыть фотографии микроскопии , которые были сохранены в формате файла JPEG. (D (F) Схема измерения угла: угол аЬс определяет фиксированный угол А, и истинный угол сгибание рассчитывается как угол В, которая равна 180 ° - угол A. (G) линия , представляющая расстояние от точки А до точки Ь. (H) Непрерывность линии АВ к точке С , что делает угол A. (I) Результат файл изображения J показа угол Ценность. (J) представитель файл электронной таблицы отображения средние измерения угла изгиба, СтанDard отклонения, стандартные ошибки и расчеты Т-тест. (K) Bar диаграмма график отображения изгибающие измерения угла между двумя различными растительными фон Col-0 и dsGSL8 EMS мутантных. Усы являются SEM (стандартная ошибка среднего +) и *** представляет значение Т-критерия (значение р> 0,001). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Схема из шагов, которые участвуют в анализе загрузки HPTs. (A) Группа , показывающая получение агарозных блоков HPTs. (B) Группа , представляющая иссечение и передачу сеянцев и загрузку агарозных блоков HPTs. (C) Панель отображения шагов, которые участвуют в выборкеподготовка к конфокальной микроскопии. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Измерение интенсивности каллозы по ImageJ. (A) Посмотреть программу ImageJ двойным щелчком. (B) Основные инструменты , которые были использованы при измерении интенсивности каллозы. (C) Откройте "Файл" вариант , за которой следует Подвариант "открытой" на панели инструментов , чтобы открыть ImageJ изображений микроскопии , которые были сохранены в формате файла JPEG. (D) Прямоугольная иконка на панели инструментов ImageJ. (E) Выбранная область изображения для анализа интенсивности каллозы. (F) ImageJ файл результатов отображения значения интенсивности каллозы как "среднее". (G)Представитель файл электронной таблицы отображения средние измерения интенсивности каллозы, стандартные отклонения, стандартные ошибки и расчеты Т-тест. (H) Гистограмма схема , представляющая разность каллозы интенсивности между двумя растительных фонов. Усы являются SEM (стандартная ошибка среднего +) и *** представляет значение Т-критерия (значение р> 0,001). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Снижение экспрессии AtGSL8 приводит к неполноценным Тропик ответов. (А) фототропным ответ показал на dsGSL8 (± DEX) наряду с Col-0. (B) ГРАВИТРОПИЧЕСКУЮ ответ показал dsGSL8 (± DEX) ал Онг с Col-0. dsGSL8 (+ Ловкость) не показывает фототропным или ГРАВИТРОПИЧЕСКУЮ ответов. dsGSL8 (+ Ловкость) и dsGSL8 (-dex) символизируют дексаметазона обработанных и необработанных dsGSL8 -inducible линии RNAi, соответственно. Шкала бар представляет собой 0,2 см. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6. symplasmic движение увеличилось после подавления AtGSL8. Изображений флуоресценции были приняты после того, как HPTs загрузки до dsGSL8 ± Dex гипокотиля срезанных поверхностей наряду с дикого типа Col-0. DsGSL8 (+ Dex) показал более широкое движение HPTs красителя, продемонстрированная более symplasmic движение. Шкала бар представляет 0,2 мм.COM / файлы / ftp_upload / 53513 / 53513fig6large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7
Рисунок 7. AtGSL8 подавленные линии показали симметричное распределение PD каллозы между засвеченных и затемненных сторон гипокотиля. (A) флуоресценция изображение , показывающее анилина синий каллозы окрашивание для dsGSL8 (-dex) при 0 ч. Показывая анилина синий каллозы окрашивание для dsGSL8 (-dex) после того, как 6 часов фототропизма (B) флуоресценция изображение. (C) флуоресценция изображение , показывающее анилина синий каллозы окрашивание на dsGSL8 (+ Ловкость) после того, как 6 часов фототропизма. Желтые стрелки указывают на накопление каллозы на затененной области гипокотиля. Шкала бар составляет 50 мкм. (D) Гистограмма диаграмма , представляющая утрар а ф ПД каллозы, накопившихся в dsGSL8 (± DEX) гипокотилях до и после 3 ч и 6 ч фототропизма. Интенсивность флуоресценции фокусов были измерены от десяти независимых гипокотилях (данные представляют собой среднее ± SD; т-критерий Стьюдента, * р <0,01). Эта цифра была изменена из (Хан и др., 2014) 15. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой рукописи, стратегия скрининга мутант / сверхэкспрессии линии, которые неполноценный в фототропным и ГРАВИТРОПИЧЕСКУЮ ответов в связи с изменившейся PD каллозы и, следовательно, PD SEL подробно описан. PD синтез мозолистый и деградация в основном осуществляется путем каллозы синтазы и бета-1,3-глюканазы, но регулирование этих ферментов контролируется многими факторами, вверх по течению. Для поиска таких факторов вверх по течению или кандидатов, которые непосредственно участвуют в регуляции ПД, мы создали этот метод для скрининга. Этот комплекс мер имеет некоторые ограничения , как мутанты некоторых ключевых ферментов , регулирующих PD каллозы биосинтез (gsl8) смертельны 15 и разобраться в таких мутантов будет ограничена этим создана. Кроме того, если ген-кандидат показывает быстрее или медленнее реакция тропные вместе с открытым или закрытым PD, но уровень мозолистый остается неизменным, то детальный анализ необходим для дальнейшей характеристики таких кандидатов. Критические факторы и устранение неисправностей процеГСЭС в каждом шаге также разработаны. Во-первых, в среде подготовки, решающим фактором, который может повлиять на рост растений является рН СМИ, которые должна составлять от 5,7-5,8. Во-вторых, целесообразно поверхность сушки пластин агара имеет важное значение; было бы трудно поднять 3 дневных проростков без какого-либо ущерба от агара пластин с высоким содержанием воды. Тем не менее, слишком много сушки пластин агара может вызвать некоторые трещины в средствах массовой информации во время инкубации и привести к асимметричному роста всходов. Во время стерилизации поверхности семян с помощью раствора гипохлорита натрия, необходимо позаботиться , чтобы полностью удалить гипохлорит натрия повторным промыванием автоклавного DDH 2 O, так как она является сильным отбеливающим средством. Автоклавного DDH 2 O должен быть подготовлен свежезаваренным и с соблюдением условий асептики, поскольку старые запасы , которые могут привести к грибковой загрязнение в MS пластин. После стерилизации семена расслаиваются холодной обработки для синхронизации всхожесть. Этот процесс может быть осуществлен либо с помощью трансферринаг стерилизуют влажные семена непосредственно в холодном помещении в условиях низкой освещенности или первый усеивание семена на MS пластин, а затем передать пластины в холодном помещении в условиях низкой освещенности. Тем не менее, мы предпочитаем последнее, потому что это дает более равномерный рост рассады. В то время как усеивание семена, расстояние между двумя соседними семенами должно быть не менее 0,1 см, потому что очень близко пунктирные семена приведет к росту перекрытием рассаду, которые очень трудно передать в последующих экспериментах.

Для получения правильных фототропным и ГРАВИТРОПИЧЕСКУЮ ответов, саженцы не должны подвергаться воздействию света и должны оставаться неповрежденными. Чтобы избежать фоновых эффектов белого света, тщательно выбирать рассаду под зеленым источником света в темной комнате, как растения не реагируют на зеленый свет. Зеленый источник света может быть сформирован путем покрытия источника белого света с использованием прозрачных зеленых виниловых листов. Для выбора рассаду, стерилизованный зубочистка является лучшим вариантом. Сенсорный йе очень нижняя часть гипокотиля с зубочисткой, чтобы поднять рассаду так, что они могут быть легко перенесены на новую пластину. Все саженцы должны быть одинаковыми по размеру и ориентации крюка. В ходе наших экспериментов мы увидели, что если направление крюк находится на противоположной стороне от источника света, растения покажет быстрее тропическую отклик, чем растения с одинаковым направлением крюка в качестве источника света. Как правило, в случае фототропизма, можно увидеть четкую разницу в угол изгиба между истинными кандидатами и Col-0 в течение 3 ч, в то время как в случае геотропизм, как правило , занимает 6-12 ч. И, наконец, чтобы иметь статистически соответствующие данные, как минимум трех биологических повторностях и 20 саженцев необходимы каждый раз.

Для того, чтобы проверить степень symplasmic движения между разных слоев растений, красителем HPTs представляет собой удобный метод, поскольку он не требует сложных инструментов и измерительных приборов. Для загрузки анализа HPTs, процент гэль в HPTs агарозных блоков имеет большое значение, так как очень хрупкими или твердый гель не даст оптимальные результаты. Лучше использовать 50 мл коническую колбу с рыхлой резины, а не использовать большого объема колбы для кипячения агарозы с 10 мл воды. HPTs агарозном блоки могут использоваться в течение одной недели после приготовления, если хранить обматывают алюминиевой фольгой при температуре 4 ° С. Еще одним ключевым фактором в анализе загрузки HPTs является иссечение области гипокотиля крюка. Иссечение следует проводить с острыми рассечение ножницами и в таком же положении для всех сеянцев. Иссечение с тупыми ножницами может вызвать нежелательное повреждение сеянцев и может затруднить HPTs погрузку. Кроме того, условия выращивания рассады и стадии развития может сыграть решающую роль в движении красителя, так как накопление мозолистый более склонны реагировать на такие изменения, которые в конечном итоге приходится на препятствие в движении красителя. Таким образом, выращивание рассады в оптимальных условиях необходимо. Каллозы при БП играет ключевую роль втропные реакции этиолированных проростков путем регулирования PD SEL, который имеет важное значение для формирования 15 градиента ауксина. Уровни каллозы могут быть обнаружены с помощью окрашивания анилиновыми синим или метки антител. Окрашивание с анилина синий представляет собой простой и быстрый способ для определения уровня каллозы. Поскольку гипокотиля клетки имеют высокое давление тургора и эпи-слой кутикулы, это не так просто для красителя проникать в клетки. Поэтому мы разработали метод отключения окрашивания, чтобы позволить анилин синий краситель легко проникать. Тем не менее, существует риск синтеза новых каллозы, которые могут повлиять на результаты окрашивания, что является ограничением нормального метода мозолистый окрашивания. Для того, чтобы избежать таких эффектов, протокол окрашивания модифицирован путем добавления ингибитора синтазы мозолистый 2-D-дезокси глюкозу (DDG) в буфер окрашивания. Таким образом, этот протокол включает измерение ранее существовавшего каллозы только в нижней области гипокотиля, который точно ниже места разреза. Избегайте использования свежемолотый ДГОEd анилин синий, и держать Анилин синий раствор при комнатной температуре в течение минимум 48 часов перед использованием. Мы заметили, что окрашивание со свежим анилина синий раствор не дает оптимальных результатов мозолистый окрашивания.

В целом, мы представили ряд стратегий, которые могут быть использованы для быстрого скрининга мутантов / избыточная экспрессия линий с неисправным или усиленного ответа троповых путем изменения PD SEL прямо или косвенно модулирующих PD каллозы. Ранее факт о трофических ответов был главно ограничивается действием ауксина носителей и сигнальными игроков, таких как PINIOD 2-14. Кроме того, мы также создали критическую роль symplasmic движения ауксина в поддержании градиента ауксина в системе гипокотиля 15. Простота и универсальность этого метода, несомненно, усиливают его полезность при исследовании генов-кандидатов для их регулирования PD SEL, таким образом, играет жизненно важную роль в развитии растений, в том числе трофических ответов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют никаких пояснений.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Национальным исследовательским фондом Кореи (NRF-2015R1A2A1A10053576), а также за счет гранта от Biogreen 21 программы Next-Generation (ГКПС, грант PJ01137901), Управление по развитию сельских районов, Республика Корея. РК, WS, ABB и DK были поддержаны Brain Korea 21 программы Plus (BK21 +).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt) Sigma H1529-1G Fluorescent dye as symplasmic tracer
LE Agarose Dongin-Genomic GEL001-500G Used for HPTS agarose block
Microwave oven LG-Goldstar Machine for boiling agarose gel
100 ml glass conical flask Dong Kwang A0205 Used to boil HPTS agarose gel
Petri dish (35 mm x 10 mm) SPL life sciences SPL10035 Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples 
Microscope cover slides and glass slides (24 mm x 50 mm) Marienfeld Laboratory Glassware 101222 Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation
MS medium plates 125 mm x 125 mm x 20 mm SPL life sciences SPL11125 Plates to make MS agar medium
Scissors Germany Stainless HSB 942-11 Used to excise hook region of plant samples
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture Duchefa P10453.01 MS medium including vitamins.
(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate Bioshop 3G30212 To make MS media.
Plant agar Duchefa P1001.1000 To solidify MS media.
Autoclave ALP CL-40L
Shaker Wise Mix SHO-1D To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way.
1 ml Blue tips Sorenson 10040
1 ml pipette BioPette L-1101-2
Surgical tape MIcropore 1530-0 To seal the MS plate
Aniline blue (Methyl blue) Sigma M5528-25G Used to prepare aniline blue staining buffer.
Glycine Bioshop GLN001 Used to prepare aniline blue staining buffer.
DDG Sigma D8375-1G Used for the inhibition of callose synthases.
Confocal microscope Olympus FV1000MPE SIM To check aniline blue staining and HPTS dye loading result.
Stirrer  I lab  K400 To mix media solution.
Aluminium foil SW cooking foil To wrap plates in a dark condition.
Sodium hypochlorite Samjin Industry To surface-sterilized seeds

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Went, F. W., Thimann, K. V., et al. Phytohormones. Experimental biology monographs. Bard, P., et al. , The Macmillan Company. New York. 204 (1937).
  2. Bennett, M. J., et al. Arabidopsis AUX1 gene: a permease-like regulator of root gravitropism. Science. 273 (5277), 948-950 (1996).
  3. Christensen, S. K., Dagenais, N., Chory, J., Weigel, D. Regulation of auxin response by the protein kinase PINOID. Cell. 100 (4), 469-478 (2000).
  4. Jurgens, G., Geldner, N. The high road and the low road: trafficking choices in plants. Cell. 130 (6), 977-979 (2007).
  5. Michniewicz, M., et al. Antagonistic regulation of PIN phosphorylation by PP2A and PINOID directs auxin flux. Cell. 130 (6), 1044-1056 (2007).
  6. Noh, B., Bandyopadhyay, A., Peer, W. A., Spalding, E. P., Murphy, A. S. Enhanced gravi- and phototropism in plant mdr mutants mislocalizing the auxin efflux protein PIN1. Nature. 423 (6943), 999-1002 (2003).
  7. Weijers, D., Friml, J. Snap Shot: auxin signaling and transport. Cell. 136 (6), 1172-1172 (2009).
  8. Wisniewska, J., et al. Polar PIN localization directs auxin flow in plants. Science. 312 (5775), 883 (2006).
  9. Murphy, A. S., Hoogner, K. R., Peer, W. A., Taiz, L. Identification, purification, and molecular cloning of N-1-naphthylphthalmic acid-binding plasma membrane-associated aminopeptidases from Arabidopsis. Plant Physiol. 128 (3), 935-950 (2002).
  10. Kleine-Vehn, J., Friml, J. Polar targeting and endocytic recycling in auxin-dependent plant development. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 24, 447-473 (2008).
  11. Yang, Y., Hammes, U. Z., Taylor, C. G., Schachtman, D. P., Nielsen, E. High-affinity auxin transport by the AUX1 influx carrier protein. Curr. Biol. 16 (11), 1123-1127 (2006).
  12. Geisler, M., Murphy, A. S. The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development. FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).
  13. Band, L. R., et al. Root gravitropism is regulated by a transient lateral auxin gradient controlled by a tipping point mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 109 (12), 4668-4673 (2012).
  14. Vanneste, S., Friml, J. Auxin: a trigger for change in plant development. Cell. 136 (6), 1005-1016 (2009).
  15. Han, X., et al. Auxin-callose-mediated plasmodesmal gating is essential for tropic auxin gradient formation and signaling. Dev. Cell. 28 (2), 132-146 (2014).
  16. Kumar, R., Kumar, D., Hyun, T. K., Kim, J. Y. Players at plasmodesmal nano-channels. J. Plant Biol. 58, 75-86 (2015).
  17. Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiol. 150, 105-113 (2009).

Tags

Клеточная биология выпуск 110, Плазмодесмы (PD) мозолистый ауксина тропизм гипокотиля symplasmic движение анилин синий 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic кислоты (HPTs) мутант
Стратегия для обоснования роли каллозы опосредованной Plasmodesmal воротного в Tropic Response
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kumar, R., Wu, S. W., Iswanto, A. B. … More

Kumar, R., Wu, S. W., Iswanto, A. B. B., Kumar, D., Han, X., Kim, J. Y. A Strategy to Validate the Role of Callose-mediated Plasmodesmal Gating in the Tropic Response. J. Vis. Exp. (110), e53513, doi:10.3791/53513 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter