सेल से लदी Hydrogel में उत्तेजक सेलुलर व्यवहार के लिए ग्रेडिएंट तनाव चिप
Summary
यह आलेख गैर-निरंतर ऊतक इंजीनियरिंग के लिए कक्ष संरेखण को विनियमित करने के लिए एक गाढ़ा सेल से लदी hydrogel पर ग्रैडिएंट स्थिर उपभेदों प्रदान करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण का परिचय देता है।
Abstract
सेलुलर संरेखण के लिए कृत्रिम मार्गदर्शन ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में एक गर्म विषय है। पिछले अनुसंधान के सबसे है जांच की एकल तनाव प्रेरित सेलुलर संरेखण पर एक सेल से लदी hydrogel जटिल प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं और बड़े पैमाने पर सिस्टम को नियंत्रित करने, जो आमतौर पर प्रदूषण के मुद्दों के साथ जुड़े रहे हैं का उपयोग करके। इस प्रकार, इस आलेख में, हम एक 3D hydrogel में सेलुलर व्यवहार की उत्तेजना के लिए एक प्लास्टिक PDMS कवर और एक यूवी पारदर्शी कांच सब्सट्रेट के साथ एक फ्लुडिक चिप का उपयोग एक ग्रैडिएंट स्थिर तनाव निर्माण करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण का प्रस्ताव। फोटो-patternable सेल prepolymer अधिक लदान फ्लुडिक चैंबर में कवर पर एक उत्तल घुमावदार PDMS झिल्ली उत्पन्न कर सकते हैं। यूवी के बाद crosslinking, घुमावदार PDMS झिल्ली, और बफ़र धोने, जांच कक्ष के लिए एक microenvironment के तहत एक गाढ़ा परिपत्र micropattern के माध्यम से ढाल उपभेदों की एक किस्म के तहत व्यवहार है स्वयं में एक एकल चिप फ्लुडिक बाह्य उपकरणों के बिना स्थापित। NIH3T3 कोशिकाओं ज्यामिति मार्गदर्शन, तनाव उत्तेजना, जो hydrogels पर 15-65% से अलग के साथ सहयोग में सेलुलर संरेखण प्रवृत्ति में परिवर्तन देख के बाद का प्रदर्शन किया गया। एक 3-दिन ऊष्मायन के बाद, hydrogel ज्यामिति कक्ष संरेखण के कम compressive दबाव, जहाँ कोशिकाओं hydrogel बढ़ाव दिशा के उच्च compressive दबाव के साथ गठबंधन का प्रभुत्व है। ये बीच, कट्टरपंथी मार्गदर्शन के अपव्यय के कारण यादृच्छिक संरेखण hydrogel बढ़ाव और नमूनों hydrogel की ज्यामिति के मार्गदर्शन के कक्षों से पता चला।
Introduction
एक देशी microenvironment mimics एक ब्लॉक सामग्री के रूप में सेवारत, एक hydrogel extracellular मैट्रिक्स (ECM) से युक्त biomimetic ऊतक scaffolds सेल के विकास का समर्थन करने के लिए फिर से निर्माण कर सकते हैं। एक ऊतक के कार्यों के अधिकारी के लिए, संगठित कक्ष संरेखण एक अनिवार्य आवश्यकता है। विभिन्न (यानी, एक सतह पर सुसंस्कृत कोशिकाओं) 2D और 3 डी (यानी, कोशिकाओं में एक hydrogel समझाया) कक्ष संरेखण संवर्धन या कोशिकाओं या सूक्ष्म के साथ लचीला substrates पर encapsulating द्वारा हासिल किया गया है- या नैनो-पैटर्न1। 3D कक्ष संरेखण microarchitecture में अधिक आकर्षक, के रूप में microenvironment मूल ऊतक का निर्माण2,3,4करने के लिए करीब है। 3D कक्ष संरेखण के लिए एक सामान्य दृष्टिकोण hydrogel आकृति2,3के ज्यामितीय क्यू है। लघु-अक्ष दिशा में सेल प्रसार के लिए सीमित स्थान के कारण, एक माइक्रो-नमूनों hydrogel में लंबे अक्ष दिशा के साथ संरेखित करने के लिए कक्षों का लक्ष्य। तन्यता खिंचाव कक्ष संरेखण खिंचाव दिशा4,5करने के लिए समानांतर को प्राप्त करने के लिए hydrogels करने के लिए लागू करने के लिए एक और दृष्टिकोण है।
ECM hydrogels, compressive तनाव जैसे पर biophysical उत्तेजना या एक विद्युत क्षेत्र, कक्ष कार्यों के लिए उचित ऊतक एकीकरण, प्रसार और भेदभाव1,2,3को विनियमित कर सकते हैं। एक तनाव की स्थिति को एक ही समय में एकाधिक यांत्रिक नियंत्रण इकाइयों4,6,7,8,9का उपयोग कर लागू करने से सेलुलर व्यवहार की जांच करने के लिए अधिक से अधिक शोध किया गया है। उदाहरण के लिए, यांत्रिक चरण मोटर्स का उपयोग निचोड़ा हुआ या फैला एक 3 डी सेल-समझाया कोलेजन hydrogel पर एक आम दृष्टिकोण7,10किया गया है। हालांकि, इस तरह नियंत्रित करना उपकरण अतिरिक्त स्थान की आवश्यकता है और इनक्यूबेटर7,9,11,12में प्रदूषण की समस्या का सामना। इसके अलावा, बड़े साधन उच्च reproducibility की13प्रदान करने के लिए एक सटीक नियंत्रण पर्यावरण दे सकते हैं।
यह देखते हुए कि सेल से लदी hydrogels आम तौर पर सूक्ष्म जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए बड़े पैमाने पर नियोजित कर रहे हैं, यह MEMS तकनीकों तनाव/खिंचाव उत्तेजना एक साथ 3D biomimetic constructs इन विट्रो में2,14,15,16,17,18में सेल व्यवहार की जांच करने के लिए की एक श्रृंखला जनरेट करने के लिए गठबंधन करने के लिए लाभप्रद है। उदाहरण के लिए, PDMS झिल्ली microfluidic चिप्स में ख़राब करने के लिए गैस के दबाव का उपयोग कर वृद्धि विभिन्न उपभेदों, कोशिका अवकलन विभिन्न प्रजातियों9,16करने के लिए ड्राइविंग के लिए दे सकते हैं। हालांकि, वहाँ कई तकनीकी चुनौतियों, जैसे जटिल चिप निर्माण प्रक्रियाओं में एक साफ कमरे और सॉफ्टवेयर नियंत्रण एकीकरण मोटर्स, पंप, वाल्व, और संपीड़ित गैसों के हैं।
इस काम में, हम एक आत्मनिर्भर ढाल स्थैतिक-तनाव microfluidic चिप एक गाढ़ा परिपत्र hydrogel पैटर्न और एक लचीला PDMS झिल्ली द्वारा रोजगार प्राप्त करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण प्रदर्शित करता है। अधिकांश मौजूदा दृष्टिकोण के विपरीत, हमारे मंच एक पोर्टेबल और डिस्पोजेबल लघु डिवाइस कि एक पीला कमरे के बाहर गढ़े जा सकते हैं और जो पास गाढ़ा सेल-समझाया hydrogels, ऊष्मायन के दौरान बाह्य यांत्रिक उपकरणों के बिना पर ग्रैडिएंट उपभेदों स्व-जनरेट कर रहा है। 3T3 fibroblast सेल व्यवहार hydrogel आकृति का एक संयोजन द्वारा प्रभावित और तन्यता खिंचाव मार्गदर्शन cues के एक किस्म 3 दिनों के लिए ग्रेडिएंट तनाव चिप में 3 डी ECM mimetic वातावरण के भीतर कक्ष संरेखण के अवलोकन के दौरान प्रदर्शन किया गया।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस कागज में, हम hydrogel आकृति मार्गदर्शन और तन्यता खिंचाव के बाद कक्ष संरेखण व्यवहार की तुलना करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण पर रिपोर्ट। एक लचीला PDMS झिल्ली गाढ़ा परिपत्र hydrogels की विभिन्न ऊंचाइयों पैदा करने के ल?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना को स्नातक छात्र अध्ययन विदेशों में कार्यक्रम (NSC-101-2917-I-007-010 द्वारा) समर्थन था; बायोमेडिकल इंजीनियरिंग प्रोग्राम (NSC-101-2221-E-007-032-MY3); और नैनो राष्ट्रीय कार्यक्रम (NSC-101-2120-M-007-001-), आरओसी, ताइवान के राष्ट्रीय विज्ञान परिषद। लेखक प्रोफ़ेसर अली Khademhosseini, Gulden Camci-Unal, Arghya पॉल, और हार्वर्ड मेडिकल स्कूल में Ronglih लियाओ hydrogel और सेल encapsulation प्रौद्योगिकी साझा करने के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूँगा।
Materials
| 1.5-mL black microcentrifuge tube | Argos Technologies | 03-391-161 | This one can be replaced with a neutral color of 1.5-mL tube covered with aluminun foil |
| 10X DPBS | Sigma-Aldrich | 56064C | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| Calcein | Molecular Probe | C1430 | For labeling viable cells |
| CCD | PCO. Imaging | Pixelfly qe | |
| Cell membrane permeating solution | Sigma-Aldrich | X100 | 0.5% Triton X-100 for permeating cell membrane |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Cell nucleus staining |
| Dialysis membrane | Sigma-Aldrich | D9527 | Molecular weight cut-off = 14,000 |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| Double-side tape | 3M | 8003 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500 | gel strength 300, type A, from porcine skin |
| High frequency electronic corona generator | Electro-technic products | MODEL BD-20 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | |
| Micro syringe | Hamilton | 80501 | 50 μL |
| Microscope | Olympus | IX71 | Include two filter sets: LF405/LP-B-000 and LF488/LP-C-000 from Semrock |
| Oxygen plasma machine | Harrick plasma | PDC-001 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cell |
| PDMS | DOW CORNING | Sylgard 184 | Mixture for PDMS chip cast-molding fabrication |
| Pen-Strep | Gibco | 10378-016 | penicillin/streptomycin |
| Photoinitiator | CIBA | Irgacure 2959 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For labeling dead cells |
| Sterile Filtration cup | Millipore | SCGPT05RE | |
| TMSPMA | Sigma-Aldrich | 440159 | For hydrogel immobilization |
| Ultrasonicator | Delta | D150H | 150W, 43kHz |
| UV light | DAIHAN | WUV-L10 | |
| Freeze Dryer | FIRSTEK | 150311025 | |
| NIH3T3(fibroblast) | Food Industry Research and Development Institute(FIRDI) | 08C0011 | |
| MOXI Z Mini Automated Cell Counter | ORFLO | MXZ001 |
References
- Simmons, C.S., Petzold, B.C., Pruitt, B.L. Microsystems for biomimetic stimulation of cardiac cells. Lab Chip. 12 (18), 3235-3248 (2012).
- Aubin, H. et al.Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
- Guan, J. et al. The stimulation of the cardiac differentiation of mesenchymal stem cells in tissue constructs that mimic myocardium structure and biomechanics. Biomaterials. 32 (24)., 5568-5580 (2011).
- Wan, C.R., Chung, S., Kamm, R.D.Differentiation of embryonic stem cells into cardiomyocytes in a compliant microfluidic system. Ann Biomed Eng. 39 (6), 1840-1847 (2011).
- Huh, D. et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Li, X., Chu, J.S., Yang, L., Li, S. Anisotropic effects of mechanical strain on neural crest stem cells. Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 598-605 (2012).
- Butcher, J.T., Barrett, B.C., Nerem, R.M. Equibiaxial strain stimulates fibroblastic phenotype shift in smooth muscle cells in an engineered tissue model of the aortic wall. Biomaterials. 27 (30), 5252-5258 (2006).
- Ramon-Azcon, J. et al. Gelatin methacrylate as a promising hydrogel for 3D microscale organization and proliferation of dielectrophoretically patterned cells. Lab Chip. 12 (16), 2959-2969 (2012).
- Park, S.H., Sim, W.Y., Min, B.H., Yang, S.S., Khademhosseini, A., Kaplan, D.L. Chip-Based Comparison of the Osteogenesis of Human Bone Marrow- and Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells under Mechanical Stimulation. PLoS One. 7 (9), e46689 (2012).
- Gould, R.A. et al. Cyclic Strain Anisotropy Regulates Valvular Interstitial Cell Phenotype and Tissue Remodeling in 3D Culture. Acta Biomater. 8 (5), 1710-1719 (2012).
- Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Proc. Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stemcells. Natl Acad Sci USA. 103 (44), 16095-16100 (2006).
- Sim, W.Y., Park, S.W., Park, S.H., Min, B.H., Park, S.R., Yang, S.S.A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
- Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L.Strain-Induced Alignment in Collagen Gels. PLoS One. 4 (6), e5902 (2009).
- Aguado, B.A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K.J., Heilshorn, S.C.Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue Eng Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
- Wan, J. Microfluidic-Based Synthesis of Hydrogel Particles for Cell Microencapsulation and Cell-Based Drug Delivery. Polymers. 4 (2), 1084-1108 (2012).
- Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C.A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
- Keung, A. J., Kumar, S., Schaffer, D. V. Presentation Counts: Microenvironmental Regulation of Stem Cells by Biophysical and Material. Cues. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 533-556 (2010).
- Segers, V.F., Lee, R.T. Stem-cell therapy for cardiac disease. Nature. 451 (7181), 937-942 (2008).
- Hsieh, H.Y. et al. Gradient static-strain stimulation in a microfluidic chip for 3D cellular alignment. Lab Chip. 14 (3), 482-493 (2014).
