Summary
組織工学用セルの配置を調整する同心円状細胞を含んだハイドロゲルの非連続的なグラデーション静的系統を提供する単純なアプローチを紹介します。
Abstract
人工細胞の配置については、組織工学の分野でのホットな話題です。過去の研究のほとんどは、複雑な実験的プロセスおよび汚染の問題に通常関連付けられている質量システム制御、使用して細胞を含んだハイドロゲルのひずみ誘起細胞の単一の位置合わせを調査しました。したがって、この記事では PDMS のプラスチック カバー、UV 透明なガラス基板 3 D ゲルの細胞挙動の刺激のため流体チップを用いた勾配静的ひずみを構築するシンプルなアプローチを提案する.流体の商工会議所でのオーバー ロードの写真パターン形成可能なセル プレポリマーは、カバーの凸曲面 PDMS 膜を生成できます。UV 架橋後湾曲した PDMS 膜とバッファー洗浄、調査細胞の微小環境下で同心円形パターンをさまざまなグラデーションの株の下で動作は外部機器なしの単一の流体チップで自己確立です。NIH3T3 細胞をゲル上 15-65% から様々 なひずみの刺激との連携で、ジオメトリの指導の下で細胞の配置の傾向の変化を観察した後示した。3 日間培養後ハイドロゲル ジオメトリは、細胞が高圧縮ひずみハイドロゲル伸長方向に沿って整列低圧縮ひずみ, セルの配置を支配しました。これらの間は、細胞は、ハイドロゲルの伸長とパターン化ハイドロゲルの幾何学指導の根本的な指導の逸散によるランダムな配置を示した。
Introduction
ネイティブの微小環境を模したブロック素材として、ゲルの細胞外マトリックス (ECM) を含む再細胞の成長をサポートする生体模倣組織足場を構築できます。組織の機能を所有するには、組織のセルの配置は必須要件です。さまざまな 2 D (すなわち表面上で培養した細胞) と 3 D (すなわちハイドロゲルにカプセル化細胞) セルの配置は、培養または細胞またはマイクロ フレキシブル基板上にカプセル化することによって達成されている- またはナノ パターン1。マイクロ アーキテクチャの 3 D セルの配置はより魅力的な微小環境は、ネイティブの組織構築2,3,4に近いです。3 D のセルの配置のための一般的なアプローチは、ハイドロゲル形2,3の幾何学的なキューです。短軸方向に細胞増殖の制限された空間のため細胞はマイクロ パターン化ハイドロゲルの長軸方向に沿って配置を目指しています。別のアプローチは、ストレッチ方向4,5並列セルの配置を達成するためにゲルに引張のストレッチを適用することです。
圧縮ひずみなどの ECM ゲル上生物物理刺激または電気のフィールドは、適切な組織統合、増殖および分化1,2,3の細胞機能を調整できます。多くの研究は、複数機械制御ユニット4,6,7,8,9を使用して、一度に 1 つのひずみ条件を適用することによって細胞の挙動を調査するために行われています。たとえば、機械式ステップ モーターの使用は圧迫や共通のアプローチ7,10されている 3 D セルでカプセル化されたコラーゲンのゲルの上に伸ばし。しかし、そのような制御装置は余分なスペースを必要とする、インキュベーター7,9,11,12の汚染の問題に直面しています。さらに、大型の楽器は、再現性の高い13を提供する正確に制御環境を与えることはできません。
細胞を含んだヒドロゲルは、医用マイクロ スケールで通常用いられることを考えると、同時に 3 D 模倣構造体外2,14,15,16,17,18細胞の挙動を調査するためのひずみ/ストレッチ刺激の範囲を生成する MEMS 技術を組み合わせることが有利です。たとえば、マイクロ流体チップの PDMS 膜を変形するガス圧を使用して、異なる系統9,16に細胞の分化を運転系統に上昇を与えることができます。ただし、クリーン ルームやモーター、ポンプ、バルブ、圧縮ガスのソフトウェア管理の統合で複雑なチップ製造プロセスなど、多くの技術的課題があります。
この作品は、同心の円形ハイドロゲル パターンと柔軟な PDMS 膜を用いた自律的勾配の静的ひずみマイクロ流体チップを取得する単純なアプローチを紹介します。異なり、既存のアプローチのほとんどは、当社のプラットフォームは黄色い部屋の外を作製できるし、孵化の間に外部機器なしの携帯カプセルのヒドロゲルを同心円のグラデーションの系統を自己生成所有しているポータブルと使い捨ての小型デバイスです。ハイドロゲル形状の組み合わせによって影響を受けた 3T3 繊維芽細胞の挙動と 3 日間のグラデーションひずみチップで 3 D の ECM 模倣環境内セルの配置の観察の間に様々 な引張ストレッチ指導の手がかりを示した。
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Representative Results
完成したグラデーションひずみ刺激チップの各円形のハイドロゲルの機械的変化を比較するためは 0 μ L (図 4 a) の注入量と 40 μ L (図 4 b) では、同じチップの 2 つの各円形のハイドロゲルの線幅をそれぞれ測定しました。各サークルでパーセントの伸びを 0 μ L 注入チップ (図 4 c) に対応するハイドロゲルの線幅で 40 μ L 注入チップの伸びを割ることによって求めた。ヒドロゲルは縦収縮ひずみは横方向の伸張ひずみ量に相当するので非圧縮性材料であります。したがって、40 μ L 注入量とチップのパーセントの伸びを示す 15 65% 伸長圧縮ひずみに変換することができます (補足のファイル 1を参照してください)。
それぞれ、細胞核、DAPI とファロイジン、F アクチンの蛍光染色細胞の配置を分析するため行われました。原子力の方向のデータを提供される DAPI 染色と細胞拡散を評価するために適用されたファロイジン染色します。図 5a-cは、グラデーションひずみチップのセルの配置を示しています。行 1、3T3 細胞は、半径方向に沿って配置されます。ヒドロゲル 7 でセルと一直線になりランダムに、セル、行 12 の円形の方向に沿って。蛍光画像を染色、に従って 12 (ラジアル方向で最も低い伸びハイドロゲル) 行の長い軸配置とセルの配置角度にライン 1 (放射状の方向に伸び最大ヒドロゲル) 3T3 細胞のセルの配置の角度から 90 度シフトが発見されました。
以前研究2,9, 200 μ m ライン パターン ヒドロゲルのセルは、ヒドロゲルの長軸方向に沿って配置する目指しています。しかし、この研究では短軸方向に 200 μ m ゲル上の細長いストレッチ提供に影響を与えるし、ハイドロゲルの負担の割合を制御することにより細胞の配置を支配するもう一つの要因であることを見ました。ライン 1 に 65% 株の根本的な配置は、ヒドロゲルの伸びストレッチがセルの配置を支配することを証明しました。12 行目 15% 株の円形配置は長尺効果がセルの配置を支配したことを証明しました。ハイドロゲル 7 の 40% のひずみ、セルはジオメトリのガイダンスとひずみの効果の中和のためにランダムに配向。
図 1.PMMA 母 PDMS シート プラグ加工用金。底板、境界フレームと流路を含む PMMA 金型の(、)で区切られたコンポーネント。両面テープで組立後、 (b)流シートの PMMA 母金型が形成されます。(c)別 PMMA 金型は、PDMS のプラグインのために組み立てられます。赤の番号は、深さを表します。(単位: mm)この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.細胞を含んだハイドロゲル パターン プラスチック フォトマスク設計。三角形の図形 (一番下の行と高さ 6.5 mm に 2 mm) と 2 つの開口部がある新鮮な細胞培養液を供給する流路に接続します。(a)プラスチックのフォトマスクが付いてディメンション。同心円の期間は 400 nm とデューティ サイクルは 50%。中央の円の直径は 2 mm です。 (b)プラスチック透明フィルムにレーザー印刷のラベルなしのフォトマスク レイアウト。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。グラデーション作製プロセス歪 PDMS 流体チップ径方向の細胞を含んだハイドロゲル。(a)プラスチック製フォトマスク整列し、TMSPMA コーティングの流体チャネル チップの下で付きます。プレポリマーの細胞液とマイクロ シリンジ チップの入口に挿入され、流路に合わせて約 50 μ L を注入するために使用します。(b)と流路の出口を閉じて、PDMS プラグし、プレポリマー携帯ソリューションの追加の 40 μ L を注入します。ガラス下部は 30 の UV パターン s フロー チップの同心の円形ハイドロゲルを作製します。液体の圧力は、コンセントを抜いて流路で解放され(c) 、国連架橋混合物、DPBS で洗っています。(d)グラデーション歪みを持つチップは、細胞培養の準備ができている同心円状の細胞を含んだヒドロゲルを適用されます。UV 架橋プロセスで(e)半径に沿ってハイドロゲルの非連続的なグラデーションの高さが形成されています。(コンセントを抜いた後に f) PDMS 膜はフラットになるし、セル カプセル化ハイドロゲルのグラデーション ストレスを適用します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。純粋なハイドロゲル伸長グラデーション。伸長線幅、グラデーションの電池を封止材なしの純粋なハイドロゲルの割合チップ(a) 0 μ L と 3 日 (対照群) と(b) 40 μ L 注入量をひずみ。(c)伸び率は 40 μ L の線幅で 40 μ L と 0 μ L の線幅差の値を割ることによって計算されますこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5.3 日目のグラデーション チップでカプセル化された 3T3 細胞の蛍光アクチン核染色画像。 (C)線 1、7 行目(d-f) 、 (g i)線 12 セル配置方向放射状配置、ランダムな配置、および円形配置をそれぞれ明らかに。緑と青の色は、アクチンと核の汚れをそれぞれ示しています。点線の白い線は、ヒドロゲルの境界を表します。スケール バー: 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 1。ドーム型 PDMS 曲率の計算。H(x): 凸 PDMS 曲線;H0: PDMS ドーム前に、と加工後の最大高低差r:; ドームの半径V: 過注入ボリュームのドームとして PDMS 変形青の領域の。詳細については、補足のファイル 1を参照してください。この図をダウンロードするここをクリックしてください。
1 の補足ファイル。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
本稿でハイドロゲル図形指導及び引張ストレッチ後細胞の配向挙動を比較する単純なアプローチについて報告する.柔軟な PDMS 膜は、同心の円形ヒドロゲルの高さ別の生成のためのドームの曲率を作成します。圧力を解放した後 PDMS 膜は自動的にセンターで最大と外側の境界で最小勾配ひずみ/伸長を形成するマイクロ パターンのヒドロゲルに力を適用します。グラデーションの歪みの形成は柔軟な PDMS 膜と流体チップの処理によって設計されに出席する必要がありますいくつかの重要なパラメーターがあります: (i) 正確に制御、PDMS の厚さの膜はグラデーションのひずみ値を調整することが重要です。膜が厚すぎる場合、セル プレポリマーの最大注入量もは PDMS 膜架橋結合セルを含んだヒドロゲルのグラデーションの高さの適切な凸の曲線を生成することができません。対照的に、薄すぎる PDMS 膜は、ヒドロゲルに十分な力を適用できません。PDMS カバー金型で加硫 PDMS の重量はチップあたり約 1.6 2.0 g であることを確認してください。(ii) 汚染の防止は、流体チップで細胞を含んだゲルの架橋処理中に非常に重要です。インキュベーターで培養、徹底的に流体管内滅菌 PBS で洗浄と 75% 使用したセルの前にチップの表面を拭くためエタノールは汚染問題を避けるために助けることができます。(注意深いべきである iii) 光開始剤の濃度と露光量制御、範囲 ~0.1% - 2% (0.5% をお勧めします)。以上架橋、ハイドロゲルと紫外線照射を過剰摂取は低細胞生存率になります。(パターン化ハイドロゲルの iv) の線幅は大きすぎていけません。それ以外の場合、厚いゲルの栄養交換率は細胞増殖をサポートすることはできません。通常より小さい 300 μ m をお勧めします。2 つのハイドロゲル円間の間隔を変えることができるし、50% のデューティ サイクルをお勧めします。(v) 洗浄またはソリューションと流路を補充中は、気泡の形成の避けるべきであります。チップ ソリューションを軽くピペッティングの泡を削除に役立ちます。
PDMS 変形曲率によって生成されるグラデーションのひずみの概念はグラデーション歪を適用するさらにアップグレードすることができ、生化学的刺激、機能的組織再生に関する多くの研究に恩恵を受けることができますと統合することができます。拡張実験的制御のため、高度な流体システムによる PDMS のプラグで簡単な流体注入モジュールを交換できます。PMMA の金型は、SU 8 微細加工金型またはバルク エッチング シリコン型で置き換えることができます。
このグラデーションひずみチップ円形細胞を含んだヒドロゲルは、外部機械的または電気的機械を使わない 3 D ゲルの静的圧縮力を生成できます。したがって、一連のひずみ条件、外部マシンの操作によって引き起こされる汚染問題のリスクなしで細胞の挙動を調査するため高速スクリーニング プラットフォームを提供します。ただし、PDMS 膜ヒドロゲルの劣化まで株を生成するため、時間制御ひずみ刺激は達成可能なありません。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
このプロジェクトで、大学院学生研究留学プログラム (NSC-101-2917-I-007-010); をサポートされていた生体医用工学プログラム (NSC-101-2221-E-007-032-MY3);国立ナノテクノロジー プログラム (NSC-101-2120-M-007-001-) は、中華民国、台湾の国立科学評議会。著者は、ハイドロゲルとセル封止技術を共有するため教授アリ Khademhosseini、Unal-Gulden Camci、タントラ文献に見ポールとハーバード大学医学部で Ronglih 遼を感謝したいです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL black microcentrifuge tube | Argos Technologies | 03-391-161 | This one can be replaced with a neutral color of 1.5 mL tube covered with aluminun foil |
| 10x DPBS | Sigma-Aldrich | 56064C | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| Calcein | Molecular Probe | C1430 | For labeling viable cells |
| CCD | PCO. Imaging | Pixelfly qe | |
| Cell membrane permeating solution | Sigma-Aldrich | X100 | 0.5% Triton X-100 for permeating cell membrane |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Cell nucleus staining |
| Dialysis membrane | Sigma-Aldrich | D9527 | Molecular weight cut-off = 14,000 |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| Double-side tape | 3M | 8003 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500 | gel strength 300, type A, from porcine skin |
| High frequency electronic corona generator | Electro-technic products | MODEL BD-20 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | |
| Micro syringe | Hamilton | 80501 | 50 μL |
| Microscope | Olympus | IX71 | Include two filter sets: LF405/LP-B-000 and LF488/LP-C-000 from Semrock |
| Oxygen plasma machine | Harrick plasma | PDC-001 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cell |
| PDMS | DOW CORNING | Sylgard 184 | Mixture for PDMS chip cast-molding fabrication |
| Pen-Strep | Gibco | 10378-016 | penicillin/streptomycin |
| Photoinitiator | CIBA | Irgacure 2959 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For labeling dead cells |
| Sterile Filtration cup | Millipore | SCGPT05RE | |
| TMSPMA | Sigma-Aldrich | 440159 | For hydrogel immobilization |
| Ultrasonicator | Delta | D150H | 150W, 43kHz |
| UV light | DAIHAN | WUV-L10 | |
| Freeze Dryer | FIRSTEK | 150311025 | |
| NIH3T3(fibroblast) | Food Industry Research and Development Institute(FIRDI) | 08C0011 | |
| MOXI Z Mini Automated Cell Counter | ORFLO | MXZ001 |
References
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