Summary
Dieser Artikel stellt eine einfache Methode zur Bereitstellung von nicht-kontinuierlichen gradienter statische Belastungen auf eine konzentrische Zelle beladenen Hydrogel, Ausrichtung der Zellen für das Tissue Engineering zu regulieren.
Abstract
Künstliche Anleitung für zelluläre Ausrichtung ist ein heißes Thema im Bereich des Tissue Engineering. Die meisten der bisherigen Forschung untersuchte einzelne Stamm-induzierte zellulären Ausrichtung auf eine Zelle beladenen Hydrogel mithilfe von komplexen Versuchsabläufe und Masse Controllingsystemen, die in der Regel verbunden mit Verunreinigung Probleme sind. Daher schlagen wir in diesem Artikel einen einfachen Ansatz zum Aufbau einer Gradienten statische Belastung mit einem fluidische Chip mit einer Kunststoffabdeckung PDMS und ein UV-transparentem Glas-Substrat für die Stimulation der zellulären Verhalten in einem 3D Hydrogel. Überlastung Foto-patternable Zelle Prepolymer in der fluidische Kammer erzeugen eine konvexe gekrümmte PDMS-Membran auf dem Cover. Nach UV-Vernetzung durch eine konzentrische kreisförmige Micropattern unter dem geschwungenen PDMS-Membran und Puffer waschen, eine Mikroumgebung für Ermittlungsbehörden Zelle Verhalten unter einer Vielzahl von gradient Stämme ist selbst in einem einzigen fluidische Chip, ohne externe Instrumente etabliert. NIH3T3 Zellen wurden demonstriert, nachdem er beobachtet die Veränderung der zellulären Ausrichtung Trend unter Leitung der Geometrie, in Zusammenarbeit mit Belastung Stimulation, die von 15-65 % auf Hydrogele variiert. Nach einer 3-tägigen Inkubation dominiert die Hydrogel-Geometrie die Zellausrichtung unter niedrigen Druckspannung, wo Zellen entlang Richtung Hydrogel Dehnung unter hoher Druckspannung ausgerichtet. Zwischen diesen zeigten die Zellen zufällige Ausrichtung durch die Dissipation der radikalen Leitlinien Hydrogel Dehnung und die Geometrie-Führung der gemusterten Hydrogel.
Introduction
Dienen als ein Blockmaterial, das eine native Mikroumgebung imitiert, kann ein Hydrogel, die extrazellulären Matrix (ECM) enthalten biomimetische Gewebe Gerüste um Zellwachstum zu unterstützen wieder aufzubauen. Um die Funktionen eines Gewebes besitzen, ist organisierte Zellenausrichtung eine wesentliche Voraussetzung. Verschiedene 2D (d. h. Zellen kultiviert auf einer Oberfläche) und 3D (d. h. Zellen in einem Hydrogel gekapselt) Zelle Achsen durch Kultivierung oder Zellen in oder auf flexiblen Substraten mit Micro Kapseln erreicht wurden- oder Nano-Muster1. 3D Zellausrichtung in Mikroarchitektur ist attraktiver, da die Mikroumgebung näher an der Heimat Gewebe Konstrukt2,3,4. Ein gemeinsames Konzept für 3D Zellenausrichtung ist die geometrische Cue von Hydrogel Form2,3. Aufgrund der Platzverhältnisse für die Zellproliferation in Richtung der kurzen Achse sollen Zellen entlang der langen Achse Richtung in eine Mikro-gemusterten Hydrogel ausrichten. Ein weiterer Ansatz ist die Hydrogele zu Ausrichtung der Zellen parallel zur Strecke Richtung4,5Bruchdehnung zuweisen.
Biophysikalische Stimulation auf ECM Hydrogele, z. B. Druckspannung oder ein elektrisches Feld kann regulieren Zellfunktionen für richtige Gewebeintegration, Proliferation und Differenzierung1,2,3. Viel Forschung wurde durchgeführt, um zelluläre Verhalten zu untersuchen, durch die Anwendung einer Sorte Zustand zu einem Zeitpunkt über mehrere mechanische Steuerung Einheiten4,6,7,8,9. Zum Beispiel die Verwendung von mechanischen Schrittmotoren gequetscht oder gestreckt auf eine 3D Zelle verkapselt Kollagen Hydrogel wurde einen gemeinsamen Ansatz7,10. Jedoch solche Steuerungsvorrichtung erfordert zusätzlichen Platz und sieht sich das Problem der Kontamination in den Inkubator7,9,11,12. Darüber hinaus kann nicht das große Instrument eine präzise Steuerungsumgebung ermöglichen hohe Reproduzierbarkeit13geben.
Da die Zelle beladenen Hydrogele in der Regel auf der Mikro-Skala für biomedizinische Anwendungen beschäftigt sind, ist es vorteilhaft, MEMS Techniken um eine Reihe von Belastung/dehnen Stimulation zur Zelle Verhalten in 3D biomimetische Konstrukte in-vitro-2,14,15,16,17,18gleichzeitig untersuchen zu generieren zu kombinieren. Beispielsweise kann mit Gasdruck um zu verformen die PDMS-Membran in mikrofluidischen Chips zu verschiedenen Stämmen, fahren-Zell-Differenzierung auf verschiedenen Linien9,16führen. Allerdings gibt es viele technische Herausforderungen, wie kompliziert Chip Fertigungsprozesse in ein sauberes Zimmer und die Softwareintegration Steuerung von Motoren, Pumpen, Ventile und komprimierte Gase.
In dieser Arbeit zeigen wir Ihnen eine einfache Methode um eine autarke gradient statische Belastung mikrofluidischen Chip zu erhalten durch den Einsatz einer konzentrische kreisförmige Hydrogel-Muster und einer flexiblen Membran PDMS. Anders als die meisten der vorhandenen Ansätze ist unsere Plattform ein tragbar und Einweg-Miniatur-Gerät, vor einem gelben Zimmer hergestellt werden können und, besitzt selbst generierenden gradient Stämme auf konzentrischen Zelle verkapselt Hydrogele, ohne externe mechanische Ausrüstung während der Inkubation. 3 t 3 Fibroblast Zellen Verhalten beeinflusst durch eine Kombination von Hydrogel-Form und eine Vielzahl von Zug-Stretch Anleitung Hinweise wurden während der Beobachtung der Ausrichtung der Zellen innerhalb von ECM-mimetischen 3D-Umgebungen im Farbverlauf Stamm Chip für 3 Tage gezeigt.
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Representative Results
Um die mechanischen Unterschiede zwischen jeder Runde Hydrogel im abgeschlossenen gradient Belastung Stimulation Chip zu vergleichen, haben wir die Linienstärken jede Runde Hydrogel in zwei die gleichen Chips, Einspritzmengen von 0 µL (Abb. 4a) mit 40 µL (Abbildung 4 b), bzw. gemessen. Prozent Dehnungen in jedem Kreis waren die Dehnungen in der 40 µL injiziert Chip durch dividiert die Linienbreiten der entsprechenden Hydrogele in 0 µL injiziert Chip (Abb. 4 c). Das Hydrogel ist ein inkompressiblen Material, so dass die vertikalen öffentliche Belastung entspricht der seitliche Dehnung Dehnung werden. Daher zeigen die prozentuale Dehnungen in den Chip mit den 40 µL Injektionsvolumen 15-65 % Dehnung, die die Druckspannung umgewandelt werden können (siehe ergänzende Datei 1).
Fluoreszierende Färbung der Zellkerne und F-Aktin mit DAPI und Phalloidin, bzw. wurde getan, um die zelluläre Ausrichtung zu analysieren. DAPI-Färbung Angaben über nukleare Orientierung und Phalloidin Färbung wurde angewandt, um die Ausbreitung von Zelle zu beurteilen. Abbildung 5a -c zeigt die Ausrichtung der Zellen in den Farbverlauf Stamm-Chip. In Zeile 1 3 t 3 Zellen entlang radialer Richtung ausgerichtet. In Hydrogel 7 die Zellen nach dem Zufallsprinzip und Zellen ausgerichtet entlang der kreisförmigen Richtung in Zeile 12. Im Einklang mit der fluoreszierende Färbung Bilder entdeckte eine 90° Verschiebung aus dem Blickwinkel der Ausrichtung der Zellen der 3 t 3 Zellen in Zeile 1 (maximale Hydrogel Dehnung in radialer Richtung) auf den Winkel der Ausrichtung der Zellen mit langen Achsenausrichtung in Zeile 12 (niedrigste Hydrogel Dehnung in radialer Richtung).
In der bisherigen Forschung2,9Zellen in 200 µm Linie gemustert Hydrogele sollen entlang der langen Achse Richtung Hydrogel ausrichten. Jedoch in dieser Studie beobachteten wir, dass die verlängerte Strecke auf der 200-µm-Hydrogele in Richtung der kurzen Achse ein weiterer Faktor vorgesehen zu beeinflussen und beherrschen die zelluläre Ausrichtung durch die Kontrolle des Anteil an der Belastung für das Hydrogel. Für die 65 % Belastung auf der Linie 1 bewiesen die radikale Ausrichtung, dass die Dehnung Strecke von Hydrogel die Zellausrichtung dominiert. Für die 15 % Belastung auf der Linie 12 bewiesen die kreisförmige Ausrichtung, dass die Wirkung der langen Achse die Zellausrichtung dominiert. Bei 40 % Belastung Hydrogel 7 ausgerichtet die Zellen nach dem Zufallsprinzip durch die Neutralisierung des Geometrieeffekts Anleitung und Belastung.
Abbildung 1 . PMMA-Matritze für PDMS Blatt und Stecker Herstellung. (a) die getrennten Komponenten der PMMA-Form, einschließlich einer Bodenplatte, Grenze Rahmen und Strömungskanal. Nach der Montage mit doppelseitigem Klebeband wird (b) die PMMA-Matritze für die FlowSheet gebildet. (c) ein anderes PMMA Schimmel setzt sich für die PDMS stecken. Die rote Zahl repräsentiert die Tiefe. (Einheit: mm) Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Fotomaske Kunststoffausführung für die Zelle beladenen Hydrogel-Micropattern. Es gibt zwei Öffnungen mit Dreieck Formen (2 mm unter dem Strich und 6,5 mm Höhe) Anschluss an den Strömungskanälen, Frischzellen-Nährmedium zu liefern. (a) die Kunststoff Fotomaske wird mit der Dimension gekennzeichnet. Die konzentrischen Kreis beträgt 400 nm und das Tastverhältnis beträgt 50 %. Der Durchmesser der Kreis in der Mitte beträgt 2 mm. (b) der Fotomaske Layout ohne Etiketten für Laserdruck auf eine transparente Folie aus Kunststoff. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Fertigungsverfahren des Farbverlaufs Stamm Zelle beladenen Hydrogel entlang radialer Richtung in einem PDMS fluidische Chip. (a) eine Kunststoff Fotomaske ausgerichtet und unter dem Chip mit einer TMSPMA beschichtet fluidische Kanal stecken. Eine Mikro-Spritze mit prepolymer Zelle Lösung in den Einlass des Chips eingesetzt und benutzt, um etwa 50 µL um den Strömungskanal füllen zu injizieren. (b) die Steckdose des Strömungskanals wird geschlossen mit dem PDMS stecken und eine zusätzliche 40 µL prepolymer Zelle Lösung injiziert. Der Glasboden ist UV-Muster für 30 s, die konzentrische kreisförmige Hydrogel in der Fluss-Chip zu fabrizieren. (c) der Flüssigkeitsdruck im Strömungskanal durch ziehen den Ausgang freigegeben und die un-Vernetzung-Mischung mit DPBS ausgewaschen. (d) ein Chip mit statischen Gradienten Belastung gilt konzentrischen Zelle beladenen Hydrogele, die bereit sind für die Kultivierung von Zellen. Während die UV-Vernetzungsprozess wird (e) nicht-kontinuierlichen Steigung Höhe Hydrogel entlang dem Umkreis gebildet. (f) nach der Steckdose ausstecken, PDMS-Membran wird flach und gradient Stress auf die Zelle-gekapselte Hydrogele gilt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. Der reine Hydrogel Dehnung Farbverlauf. Die Dehnung Linienbreite und Prozentsatz der reine Hydrogel ohne Zelle Kapselung im Verlauf belasten Chip am 3. Tag mit der (a) 0-µL (Kontrollgruppe) und (b) 40 µL Einspritzmengen. (c) die Dehnung Prozentsatz errechnet sich durch Division der Wert der Linie breite Differenz zwischen 40 µL und 0 µL durch die Linienstärke von 40 µL. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 . Fluoreszierende Aktin-Kern Fleck Bilder von 3 t 3 Zellen eingekapselt in den Farbverlauf Chips am 3. Tag. Die Zelle Achsrichtung in (c) Linie 1, Linie 7 (d-f) und (g-i) Linie 12 offenbaren radiale Ausrichtung, zufällige Ausrichtung und kreisförmige Ausrichtung bzw.. Die grünen und blauen Farben zeigen jeweils die Actin und Zellkern Flecken. Die gestrichelte weiße Linie stellt die Begrenzung des Hydrogel. Maßstabsleiste: 200 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Zusätzliche Abbildung 1. Berechnung der kuppelförmigen PDMS Krümmung. H(x): die konvexe PDMS-Kurve; H0: die maximale Höhendifferenz zwischen der PDMS-Kuppel vor und nach der Verformung; r: Radius der Kuppel; V: die übermäßige Injektionsvolumen der blauen Region, wodurch die PDMS Verformung wie eine Kuppel. Details siehe ergänzende Datei 1 . Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.
Ergänzende Datei 1. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
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Discussion
In diesem Beitrag berichten wir über einen einfachen Ansatz, Zelle Ausrichtung Verhalten nach Hydrogel Form Führung und Bruchdehnung zu vergleichen. Eine flexible Membran PDMS schafft eine kuppelförmige Wölbung zur Generierung von unterschiedlichen Höhen der konzentrische kreisförmige Hydrogele. Nach der Veröffentlichung des Drucks, gilt die PDMS-Membran automatisch Kraft für die Mikro-gemusterten Hydrogele gradient Belastung/Dehnung, mit einem Maximum in der Mitte und einem Minimum an der äußeren Grenze bilden. Da die Bildung der gradient Belastung durch die flexible PDMS-Membran und die Handhabung des fluidischen Chips ausgelegt ist, gibt es mehrere wichtige Parameter, die besucht werden sollten: (i) präzise Kontrolle über die Dicke der PDMS-Membran ist entscheidend für den Farbverlauf Stamm-Wert anpassen. Wenn die Membran zu dick ist, wird auch das maximale Injektionsvolumen der Zelle Prepolymer keine richtige konvexe Kurve in der PDMS-Membran für Vernetzung ein Farbverlauf Höhe der Zelle-beladenen Hydrogele generieren können. Im Gegensatz dazu kann keine zu dünne PDMS Membran ausreichenden Kraft für die Hydrogele gelten. Bitte überprüfen Sie, dass das Gewicht des ausgehärteten PDMS in der PDMS-Abdeckung-Form ca. 1,6-2,0 g pro Chip. (Ii) die Kontamination Prävention ist sehr wichtig beim Umgang mit Crosslink Zelle beladenen Hydrogel im fluidische Chip. Vor der Zelle Kultivierung im Inkubator, gründlich waschen mit sterilisierten PBS im fluidische Kanal und mit 75 % kann Ethanol zu wischen die Oberfläche des Chips helfen, um das Problem der Kontamination zu vermeiden. (Iii) die Konzentration der Photoinitiator und die Dosierung von UV-Exposition sollte vorsichtig sein, kontrolliert und im Bereich der ~0.1% - 2 % (0,5 % wird empfohlen). Über Vernetzung führt zu niedrigen Zellviabilität Hydrogel und Überdosierung von UV-Bestrahlung. (iv) die Linienbreite des gemusterten Hydrogel sollte nicht zu groß sein. Andernfalls werden die Nährstoff Ersatzquote in den dicken Hydrogele Zellproliferation unterstützen nicht. In der Regel empfiehlt sich weniger als 300 µm. Der Abstand zwischen zwei Kreise von Hydrogel kann variiert werden, und eine 50 % Einschaltdauer wird empfohlen. (V) beim Waschen oder Nachfüllen der Strömungskanal mit Lösung, sollte die Bildung von Luftblasen vermieden werden. Pipettieren sanft die Lösung im Chip kann helfen, um Luftblasen zu entfernen.
Das Konzept der gradient Belastung von PDMS verformt Krümmung erzeugt kann zur Anwendung dynamische Gradienten Stämme weiter verbessert werden und kann mit biochemischen Stimulation, die viele Studien über funktionale Geweberegeneration profitieren kann integriert werden. Die einfache fluidische Einspritzmodul mit einem PDMS-Stecker kann von keinem fortgeschrittenen fluidische System für erweiterte experimentelle Steuerung ersetzt werden. Die PMMA-Form kann auch durch ein Microfabricated SU-8-Form oder eine Bulk-etched Silikon Form ersetzt werden.
Dieser gradient Stamm-Chip mit einem kreisförmigen Zelle beladenen Hydrogel kann statische Druckkraft auf die 3D Hydrogel ohne externe mechanische oder elektrische Maschinen erzeugen. Daher bietet es eine schnelle Screening-Plattform für die Untersuchung von Zelle Verhalten in einer Reihe von Dehnungszustände, ohne das Risiko einer Kontamination durch den Betrieb der externen Maschinen verursachten Probleme. Zeitgesteuerte Belastung Stimulation ist jedoch nicht erreichbar, da die PDMS-Membran Stämme bis zu den Abbau von Hydrogel erzeugt.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Dieses Projekt wurde durch die Graduate Student Studium im Ausland Programm (NSC-101-2917-I-007-010) unterstützt; die biomedizinische Technik-Programm (NSC-101-2221-E-007-032-MY3); und die Nanotechnologie National Program (NSC-101-2120-M-007-001-), National Science Council der r.o.c., Taiwan. Die Autoren möchten Prof. Ali Khademhosseini, Gulden Camci-Ünal, Arghya Paul und Ronglih Liao an der Harvard Medical School danken für die gemeinsame Nutzung der Hydrogel und Zelle Kapselung-Technologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL black microcentrifuge tube | Argos Technologies | 03-391-161 | This one can be replaced with a neutral color of 1.5 mL tube covered with aluminun foil |
| 10x DPBS | Sigma-Aldrich | 56064C | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| Calcein | Molecular Probe | C1430 | For labeling viable cells |
| CCD | PCO. Imaging | Pixelfly qe | |
| Cell membrane permeating solution | Sigma-Aldrich | X100 | 0.5% Triton X-100 for permeating cell membrane |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Cell nucleus staining |
| Dialysis membrane | Sigma-Aldrich | D9527 | Molecular weight cut-off = 14,000 |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| Double-side tape | 3M | 8003 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500 | gel strength 300, type A, from porcine skin |
| High frequency electronic corona generator | Electro-technic products | MODEL BD-20 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | |
| Micro syringe | Hamilton | 80501 | 50 μL |
| Microscope | Olympus | IX71 | Include two filter sets: LF405/LP-B-000 and LF488/LP-C-000 from Semrock |
| Oxygen plasma machine | Harrick plasma | PDC-001 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cell |
| PDMS | DOW CORNING | Sylgard 184 | Mixture for PDMS chip cast-molding fabrication |
| Pen-Strep | Gibco | 10378-016 | penicillin/streptomycin |
| Photoinitiator | CIBA | Irgacure 2959 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For labeling dead cells |
| Sterile Filtration cup | Millipore | SCGPT05RE | |
| TMSPMA | Sigma-Aldrich | 440159 | For hydrogel immobilization |
| Ultrasonicator | Delta | D150H | 150W, 43kHz |
| UV light | DAIHAN | WUV-L10 | |
| Freeze Dryer | FIRSTEK | 150311025 | |
| NIH3T3(fibroblast) | Food Industry Research and Development Institute(FIRDI) | 08C0011 | |
| MOXI Z Mini Automated Cell Counter | ORFLO | MXZ001 |
References
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