Summary
Este artigo apresenta uma abordagem simples para fornecer não-contínuo gradientes cepas estáticas em um hidrogel de célula-carregado concêntrico para regular o alinhamento da célula para a engenharia de tecidos.
Abstract
Orientação artificial para alinhamento celular é um tema quente no campo da engenharia de tecidos. A maioria da pesquisa anterior investigou único alinhamento celular induzida por tensão em um hidrogel célula carregada por meio de complexos processos experimentais e massa em sistemas de controlo, que são normalmente associados com problemas de contaminação. Assim, neste artigo, propomos uma abordagem simples para a construção de uma estirpe de estática gradiente usando um chip fluídico com uma tampa plástica de PDMS e um substrato de vidro transparente de UV para a estimulação do comportamento celular em um hidrogel 3D. Pré-polímero de célula foto-patternable sobrecarga na câmara fluídico pode gerar uma membrana PDMS curva convexa na capa. Após a reticulação de UV, através de um micropattern circular concêntrico sob a membrana PDMS curvada e tampão de lavagem, um microambiente para investigar célula comportamentos sob uma variedade de cepas de gradientes é self estabelecida em um único chip fluídico, sem instrumentos externos. NIH3T3 células foram demonstradas após observar a mudança da tendência de alinhamento celular sob orientação de geometria, em cooperação com a estimulação de estirpe, que variou entre 15-65% no hidrogel. Após uma incubação de 3 dias, a geometria de hidrogel dominou o alinhamento da célula sob baixa tensão compressiva, onde células alinhadas ao longo da direção de alongamento de hidrogel sob alta tensão compressiva. Entre estas, as células mostraram alinhamento aleatório devido a dissipação da orientação radical de alongamento de hidrogel e a orientação de geometria do hidrogel estampado.
Introduction
Servindo como um material do bloco que imita um microambiente nativo, um hidrogel contendo a matriz extracelular (ECM) pode re-construir andaimes de tecido biomimético para apoiar o crescimento de células. Para possuir as funções de um tecido, o alinhamento da célula organizada é um requisito essencial. Vários 2D (isto é, células cultivadas sobre uma superfície) e 3D (i.e., células encapsuladas em um hidrogel) alinhamentos de células que foram alcançados pelo cultivo ou encapsular células em ou em substratos flexíveis com micro- ou nano-padrões1. Alinhamento da célula 3D na microarquitetura é mais atraente, como o microambiente aproxima-se do tecido nativo construção2,3,4. Uma abordagem comum para alinhamento de célula 3D é o cue geométrico de hidrogel forma2,3. Por causa do espaço restrito para proliferação celular na direção do eixo curto, células visam alinhar ao longo da direção do eixo longo em um hidrogel micromodelados. Outra abordagem é aplicar o estiramento elástico para o hidrogel para atingir o alinhamento da célula paralelo à direção de estiramento4,5.
Estimulação biofísica em hidrogel de ECM, tais como tensão compressiva ou um campo elétrico, pode regular funções de células de tecido adequada integração, proliferação e diferenciação1,2,3. Muita pesquisa tem sido feita para investigar o comportamento celular através da aplicação de uma condição de tensão de cada vez usando múltiplo controle mecânico unidades4,6,7,8,9. Por exemplo, o uso de motores de passo mecânico espremido ou esticada sobre um hidrogel de colágeno de célula encapsulada 3D tem sido comum uma abordagem7,10. No entanto, tal equipamento controlador requer espaço extra e enfrenta a questão da contaminação na incubadora7,9,11,12. Além disso, o grande instrumento não pode dar um ambiente de controle preciso para fornecer grande reprodutibilidade13.
Considerando que o hidrogel célula-carregado é normalmente utilizadas na microescala para aplicações biomédicas, é vantajoso combinar técnicas de MEMS para gerar uma gama de tensão/estiramento estimulação para investigar simultaneamente comportamentos de célula em 3D biomimetic construções em vitro2,14,15,16,17,18. Por exemplo, usando a pressão do gás a deformar-se a membrana PDMS em chips microfluídicos pode dar origem a várias cepas, dirigindo a diferenciação celular de linhagens diferentes9,16. No entanto, existem muitos desafios técnicos, tais como processos de fabricação de chip complicado em um quarto limpo e a integração de software controle de motores, bombas, válvulas e gases comprimidos.
Neste trabalho, vamos demonstrar uma abordagem simples para obter um chip de gradiente estático-estirpe microfluidic auto-sustentável, empregando-se um padrão de hidrogel circulares concêntricos e uma membrana flexível de PDMS. Ao contrário da maioria das abordagens existentes, a nossa plataforma é um dispositivo portátil e descartável em miniatura que podem ser fabricados fora um quarto amarelo e que possui a auto-geração de cepas gradientes em hidrogel concêntricos de célula encapsulada, sem equipamentos mecânicos externos durante a incubação. Comportamentos de células de fibroblastos 3T3 influenciaram por uma combinação de hidrogel forma e uma variedade de pistas de orientação estiramento elástico foram demonstradas durante a observação de alinhamento de célula dentro de ambientes 3D de ECM-mimética no chip gradiente de tensão para 3 dias.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para comparar as variações mecânicas entre cada hidrogel circular no chip estimulação concluído gradiente de tensão, medimos as larguras de linha de cada hidrogel circular em dois dos chips mesmos, com volumes de injeção de 0 µ l (figura 4a) e 40 µ l (figura 4b), respectivamente. Os alongamentos por cento em cada círculo foram calculados dividindo os alongamentos no chip 40 µ l-injetado pelas larguras de linha do hidrogel correspondente na 0 µ l-injetado do chip (Figura 4C). O hidrogel é um material incompressível, então a tensão vertical contratante será equivalente da estirpe de alongamento lateral. Portanto, os alongamentos por cento no chip com o volume de injeção de 40 µ l mostram 15-65% de alongamento, que pode ser convertido para a tensão compressiva (ver arquivo complementar 1).
Coloração fluorescente do núcleo de células e F-Actina com DAPI e a faloidina, respectivamente, foi feito para analisar o alinhamento celular. A coloração de DAPI fornecido dados sobre orientação nuclear, e a faloidina coloração foi aplicada para avaliar a célula se espalhando. Figura 5a -c mostra o alinhamento da célula no chip gradiente de tensão. Na linha 1, as células 3T3 alinhadas ao longo da direção radial. Em 7 de hidrogel, as células alinhados aleatoriamente e células alinhadas ao longo da direção circular na linha 12. Em conformidade com a fluorescente coloração imagens, descobriu-se uma mudança de 90 ° de ângulo de alinhamento da célula das células 3T3 na linha 1 (hidrogel máximo alongamento na direção radial) para o ângulo de alinhamento das células com o alinhamento do eixo longo em linha 12 (mais baixo alongamento de hidrogel na direção radial).
No anterior pesquisa92,, células em hidrogel de linha-padrão de 200 µm visam alinhar na direção do longo eixo do hidrogel. No entanto, neste estudo, observou-se que o trecho alongado sobre a 200 µm hidrogel na direção do eixo curto desde outro fator para afetar e dominar o alinhamento celular, controlando a porcentagem da tensão sobre o hidrogel. Para a tensão de 65% na linha 1, o alinhamento radical revelou que o trecho de alongamento do hidrogel domina o alinhamento da célula. Para a tensão de 15% na linha 12, o alinhamento circular revelou que o efeito de longo-eixo dominou o alinhamento da célula. Para a tensão de 40% em hidrogel 7, as células alinhadas aleatoriamente devido a neutralização do efeito de orientação e da estirpe de geometria.
Figura 1 . Molde de mãe PMMA para folha PDMS e Plug fabricação. (a) os componentes separados do molde de PMMA, incluindo uma placa inferior, quadro de limite e canal de fluxo. Após a montagem com fita dupla-face, (b) o molde de mãe PMMA para a folha de fluxo é formado. (c) molde de outro PMMA é montado para os PDMS plug. O vermelho representa a profundidade. (unidade: mm) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Projeto Fotomáscara plástico para a célula-carregado Hydrogel Micropattern. Existem duas aberturas com formas de triângulo (2 mm na linha de fundo e 6,5 mm de altura) conectando-se aos canais de fluxo para fornecer o meio de cultura celular fresco. (a) a Fotomáscara plástica é rotulada com a dimensão. O período do círculo concêntrico é 400 nm e o ciclo de trabalho é de 50%. O diâmetro do círculo central é 2 mm. (b) o layout Fotomáscara, sem etiquetas para impressão a laser em um filme plástico transparente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Processos de fabricação do gradiente Coe hidrogel célula carregada ao longo da direção Radial em um Chip PDMS fluídico. (a) uma plástica Fotomáscara é alinhada e preso sob o chip com um canal fluídico TMSPMA-revestido. Uma microseringa com solução de célula prepolymer é inserida dentro da entrada do chip e usada para injetar cerca de 50 µ l para preencher a canaleta de fluxo. (b) a saída do canal de fluxo está fechada com os PDMS ligue e um adicional 40 μL de solução de célula prepolymer é injetado. O fundo de vidro é UV-modelados por 30 s para fabricar o hidrogel circular concêntrico no chip fluxo. (c) a pressão do líquido é lançada no canal de fluxo desconectando a tomada e a mistura das Nações Unidas-reticulação é lavada com DPBS. (d) um chip com tensão gradiente estático aplica concêntricos hidrogel de célula-carregado que estão prontas para o cultivo de células. Durante o processo de reticulação de UV, (e) uma altura do gradiente não-contínuo de hidrogel ao longo do raio é formado. (f) após desconectar da tomada, a membrana PDMS torna-se plana e aplica gradiente stress sobre o hidrogel de célula encapsulada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. O gradiente de alongamento de hidrogel puro. A largura de linha de alongamento e a percentagem de hidrogel puro sem encapsulamento de célula no gradiente estirpe chip no dia 3 com o (a) 0 µ l (grupo controle) e (b) volumes de injeção de 40 µ l. (c) a porcentagem de alongamento é calculada dividindo o valor da diferença de largura a linha entre 40 µ l e 0 µ l pela largura da linha de 40 µ l. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Imagens de actina-núcleo mancha fluorescentes das células 3T3 encapsulado nos Chips gradiente no dia 3. a direção do alinhamento de célula em linha (a-c) 1 (d-f) linha 7 e linha (g-i) 12 revelar radiais, alinhamento aleatório e alinhamento circular, respectivamente. As cores verdes e azuis mostram as manchas de actina e núcleo, respectivamente. A linha pontilhada representa o limite do hidrogel. Barra de escala: 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar a Figura 1. Cálculo da curvatura em forma de cúpula PDMS. H (x): a curva PDMS convexa; H0: a diferença de altura máxima entre a cúpula PDMS antes e após a deformação; r: o raio da cúpula; V: o volume de injeção excessiva da região azul, que faz com que a deformação de PDMS como uma cúpula. Consulte arquivo complementar 1 para obter detalhes. Clique aqui para baixar esta figura.
Arquivo suplementar 1. Clique aqui para baixar este arquivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neste trabalho, relatamos sobre uma abordagem simples para comparar o comportamento de alinhamento de célula depois de hidrogel forma de orientação e de estiramento elástico. Uma membrana flexível de PDMS cria uma curvatura em forma de cúpula para a geração de diferentes alturas de hidrogel circulares concêntricos. Após liberar a pressão, a membrana PDMS aplica automaticamente a força para a micromodelados de hidrogel para formar o gradiente de tensão/alongamento, com um máximo no centro e um mínimo no limite do exterior. Como a formação da estirpe gradiente é projetada por membrana flexível de PDMS e a manipulação do chip fluídico, existem vários parâmetros importantes que devem ser atendidos: (i) controle preciso da espessura do PDMS a membrana é crucial para ajustar o valor do gradiente de tensão. Se a membrana for muito grossa, até o volume máximo de injeção de pré-polímero de célula não será capaz de gerar uma curva convexa adequada na membrana PDMS para reticulação uma altura gradiente de hidrogel célula-carregado. Em contraste, uma membrana muito fina de PDMS não pode aplicar uma força suficiente para o hidrogel. Por favor, verifique que o peso de PDMS não curado no molde tampa PDMS é cerca de 1,6-2,0 g pela microplaqueta. (ii) a contaminação prevenção é muito importante durante a manipulação de crosslink do hidrogel célula-carregado no chip fluídico. Antes célula cultivo na incubadora, completamente lavagem com PBS esterilizado no canal fluídico e utilizando 75% etanol para limpar a superfície do chip pode ajudar a evitar o problema de contaminação. (iii) a concentração do fotoiniciador e a dose de exposição aos raios UV devem ser cuidadosos controlado e no intervalo de ~0.1% - 2% (0,5% é recomendado). Acabou-reticulação do hidrogel e overdose a irradiação UV resultará na viabilidade celular baixo. (iv) espessura do traço-o modelado hidrogel não deve ser muito grande. Caso contrário, a taxa de reposição de nutrientes no hidrogel grossa não será capaz de suportar a proliferação celular. Geralmente, recomenda-se menos de 300 µm. O espaçamento entre dois círculos de hidrogel pode ser variado, e recomenda-se um ciclo de trabalho de 50%. (v) durante a lavagem ou voltar a encher o canal de fluxo com solução, deve ser evitada a formação de bolhas. Pipetagem suavemente a solução no chip pode ajudar a remover as bolhas.
O conceito de tensão gradiente gerado pela curvatura PDMS-deformado pode ser ainda mais atualizado para aplicação de cepas de gradientes dinâmicas e pode ser integrado com estimulação bioquímica, que pode beneficiar muitos estudos sobre a regeneração do tecido funcional. O módulo de injeção fluídico simples com um plug PDMS pode ser substituído por qualquer sistema fluídico avançado para controle experimental estendido. O molde PMMA também pode ser substituído por um molde de microfabricated SU-8 ou um molde de silicone gravadas a granel.
Este chip de gradiente de pressão com um hidrogel circular carregados de célula pode gerar força de compressão estática sobre o hidrogel 3D sem máquinas eléctricas ou mecânicas externas. Portanto, fornece uma plataforma de rastreio rápido para investigar os comportamentos de célula em uma série de condições de tensão, sem o risco de problemas de contaminação causada pela operação de máquinas externas. No entanto, estimulação de tensão controlada por tempo não é viável porque a membrana PDMS gera tensões até a degradação do hidrogel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este projecto foi apoiado pela graduação aluno estudo no exterior programa (NSC-101-2917-I-007-010); o programa de Engenharia Biomédica (NSC-101-2221-E-007-032-MY3); e o programa nacional de nanotecnologia (NSC-101-2120-M-007-001-), Conselho Nacional de ciência, do R.O.C, Taiwan. Os autores gostaria de agradecer a Prof Ali Khademhosseini, Gulden Camci-Unal, Arghya Paul e Ronglih Liao na Harvard Medical School para compartilhar a tecnologia de encapsulamento de hidrogel e célula.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL black microcentrifuge tube | Argos Technologies | 03-391-161 | This one can be replaced with a neutral color of 1.5 mL tube covered with aluminun foil |
| 10x DPBS | Sigma-Aldrich | 56064C | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| Calcein | Molecular Probe | C1430 | For labeling viable cells |
| CCD | PCO. Imaging | Pixelfly qe | |
| Cell membrane permeating solution | Sigma-Aldrich | X100 | 0.5% Triton X-100 for permeating cell membrane |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Cell nucleus staining |
| Dialysis membrane | Sigma-Aldrich | D9527 | Molecular weight cut-off = 14,000 |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| Double-side tape | 3M | 8003 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500 | gel strength 300, type A, from porcine skin |
| High frequency electronic corona generator | Electro-technic products | MODEL BD-20 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | |
| Micro syringe | Hamilton | 80501 | 50 μL |
| Microscope | Olympus | IX71 | Include two filter sets: LF405/LP-B-000 and LF488/LP-C-000 from Semrock |
| Oxygen plasma machine | Harrick plasma | PDC-001 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cell |
| PDMS | DOW CORNING | Sylgard 184 | Mixture for PDMS chip cast-molding fabrication |
| Pen-Strep | Gibco | 10378-016 | penicillin/streptomycin |
| Photoinitiator | CIBA | Irgacure 2959 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For labeling dead cells |
| Sterile Filtration cup | Millipore | SCGPT05RE | |
| TMSPMA | Sigma-Aldrich | 440159 | For hydrogel immobilization |
| Ultrasonicator | Delta | D150H | 150W, 43kHz |
| UV light | DAIHAN | WUV-L10 | |
| Freeze Dryer | FIRSTEK | 150311025 | |
| NIH3T3(fibroblast) | Food Industry Research and Development Institute(FIRDI) | 08C0011 | |
| MOXI Z Mini Automated Cell Counter | ORFLO | MXZ001 |
References
- Simmons, C. S., Petzold, B. C., Pruitt, B. L. Microsystems for biomimetic stimulation of cardiac cells. Lab Chip. 12 (18), 3235-3248 (2012).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
- Guan, J., et al. The stimulation of the cardiac differentiation of mesenchymal stem cells in tissue constructs that mimic myocardium structure and biomechanics. Biomaterials. 32 (24), 5568-5580 (2011).
- Wan, C. R., Chung, S., Kamm, R. D. Differentiation of embryonic stem cells into cardiomyocytes in a compliant microfluidic system. Ann Biomed Eng. 39 (6), 1840-1847 (2011).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Li, X., Chu, J. S., Yang, L., Li, S. Anisotropic effects of mechanical strain on neural crest stem cells. Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 598-605 (2012).
- Butcher, J. T., Barrett, B. C., Nerem, R. M. Equibiaxial strain stimulates fibroblastic phenotype shift in smooth muscle cells in an engineered tissue model of the aortic wall. Biomaterials. 27 (30), 5252-5258 (2006).
- Ramon-Azcon, J., et al. Gelatin methacrylate as a promising hydrogel for 3D microscale organization and proliferation of dielectrophoretically patterned cells. Lab Chip. 12 (16), 2959-2969 (2012).
- Park, S. H., Sim, W. Y., Min, B. H., Yang, S. S., Khademhosseini, A., Kaplan, D. L. Chip-Based Comparison of the Osteogenesis of Human Bone Marrow- and Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells under Mechanical Stimulation. PLoS One. 7 (9), e46689 (2012).
- Gould, R. A., et al. Cyclic Strain Anisotropy Regulates Valvular Interstitial Cell Phenotype and Tissue Remodeling in 3D Culture. Acta Biomater. 8 (5), 1710-1719 (2012).
- Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Proc Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stemcells. Natl Acad Sci USA. 103 (44), 16095-16100 (2006).
- Sim, W. Y., Park, S. W., Park, S. H., Min, B. H., Park, S. R., Yang, S. S. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
- Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L.
- Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue Eng Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
- Wan, J. Microfluidic-Based Synthesis of Hydrogel Particles for Cell Microencapsulation and Cell-Based Drug Delivery. Polymers. 4 (2), 1084-1108 (2012).
- Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
- Keung, A. J., Kumar, S., Schaffer, D. V. Presentation Counts: Microenvironmental Regulation of Stem Cells by Biophysical and Material. Cues. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 533-556 (2010).
- Segers, V. F., Lee, R. T. Stem-cell therapy for cardiac disease. Nature. 451 (7181), 937-942 (2008).
- Hsieh, H. Y., et al. Gradient static-strain stimulation in a microfluidic chip for 3D cellular alignment. Lab Chip. 14 (3), 482-493 (2014).
