Summary
מאמר זה מציג גישה פשוטה כדי מתן לא רציפה זנים סטטי מעבר צבע על הידרוג קונצנטריים עמוסי התא לווסת תא היישור עבור הנדסת רקמות.
Abstract
הדרכה מלאכותי יישור הסלולר היא נושא חם בתחום של הנדסת רקמות. רוב המחקרים הקודמים חקרה יחיד זן-induced הסלולר יישור הידרוג עמוסי התא באמצעות תהליכים מורכבים ניסיוני מסה למערכות שליטה, אשר יהיו משויכת בדרך כלל בעיות זיהום. לפיכך, במאמר זה, אנו מציעים גישה פשוטה לבניית מתח סטטי מעבר צבע באמצעות שבב fluidic עם כיסוי פלסטיק PDMS מצע זכוכית שקופה UV על הגירוי של התנהגות הסלולר הידרוג תלת-ממד. Prepolymer תא patternable-צילום להעמיס בבית הבליעה fluidic ניתן להפיק קמורה קרום PDMS מעוקל על השער. לאחר UV crosslinking, דרך micropattern מעגלית קונצנטריים תחת קרום PDMS מעוקל, מאגר הכביסה, microenvironment עבור תא חוקר התנהגויות תחת מגוון רחב של זנים הדרגתיות מעוגנת עצמית שבב fluidic יחיד, ללא מכשירים חיצוניים. NIH3T3 התאים היו הפגינו לאחר התבוננות לשינוי המגמה יישור הסלולר תחת הדרכתו גאומטריה, בשיתוף פעולה עם זן גירוי, אשר בין 15-65% על hydrogels. לאחר דגירה 3 ימים, הגיאומטריה הידרוג שלטה היישור תא בלחץ נמוך compressive, שבו תאים מיושרים לאורך כיוון התארכות הידרוג בלחץ גבוה compressive. בין אלה, התאים הראה היישור אקראי בשל פיזור של ההדרכה רדיקלית של הידרוג התארכות והדרכה הגיאומטריה של הידרוג בדוגמת.
Introduction
הגשה כחומר בלוק המחקה יליד microenvironment, הידרוג המכיל מטריצה חוץ-תאית (ECM) מחדש לבנות ביונים פיגומים רקמות כדי לתמוך צמיחת תאים. להחזיק את הפונקציות של רקמה, יישור תא מאורגנת היא מהדרישות. שונים 2D (קרי, תאים תרבותי על משטח), 3D (קרי, תאים במארז של הידרוג) יישורי הושגו על ידי culturing או לבצע התאים או על מצעים גמיש עם מיקרו- או ננו-דפוסי1. תא 3D היישור המיקרו-ארכיטקטורה הוא אטרקטיבי יותר, כמו microenvironment קרובה יותר רקמה מקורית לבנות2,3,4. גישה נפוצה אחת עבור יישור תא 3D הוא הסימן גיאומטרי של הידרוג-צורה-2,-3. בשל השטח מוגבל עבור התפשטות תאים כיוון קצר-ציר, תאים במטרה ליישר לאורך לכיוון ציר זמן ב- הידרוג בדוגמת מיקרו. גישה אחרת היא להחיל מתיחה מתיחה hydrogels כדי להשיג יישור תא במקביל כיוון מתיחה4,5.
גירוי ביופיזיקלי על hydrogels ECM, כגון זן compressive או שדה חשמלי, יכולים לווסת פונקציות תא השילוב הרקמה הנכונה, התפשטות של בידול1,2,3. מחקר רב נעשה על מנת לחקור התנהגות הסלולר על-ידי החלת תנאי זן אחד בכל פעם באמצעות מספר בקרה מכנית יחידות4,6,7,8,9. לדוגמה, השימוש מכני שלב מוטורס סחוט או שרוע על הידרוג קולגן אנקפסולציה תא תלת-ממד הייתה נפוצה לגשת7,10. עם זאת, ציוד שליטה כזה דורש שטח נוסף ופונה הנושא של מזהמים החממה7,9,11,12. בנוסף, המכשיר גדול לא יכול לתת סביבה שליטה מדויקת כדי לספק הפארמצבטית גבוהה13.
בהתחשב בכך כי עמוסי תא hydrogels בדרך כלל המועסקים על המיקרו-סולם ביו יישומים, זה יתרון לשילוב MEMS טכניקות כדי ליצור מגוון של זן/מתיחה גירוי לחקור בו זמנית תא התנהגויות ביונים 3D בונה במבחנה2,14,15,16,17,18. לדוגמה, באמצעות גז בלחץ כדי לעוות את הקרום PDMS צ ' יפס microfluidic יכולים להצמיח זנים שונים, נהיגה תאית התמיינות שושלות שונות9,16. עם זאת, ישנם אתגרים טכניים רבים, כגון תהליכי ייצור השבב מסובך חדר נקי ושילוב בקרת התוכנה של מנועים, משאבות, שסתומים, גזים דחוסים.
בעבודה זאת, נדגים בגישה פשוטה להשיג שבב microfluidic סטטי-זן הדרגתיות מתוספי על ידי העסקת דפוס הידרוג מעגלית קונצנטריים ו קרום PDMS גמיש. שלא כמו רוב הגישות הקיימות, הפלטפורמה שלנו הוא התקן נייד, חד פעמית מיניאטורי זה יכול להיות מפוברק מחוץ חדר צהוב, זה הנו עצמי יצירת זנים מעבר צבע על קונצנטריים אנקפסולציה תא hydrogels, ללא ציוד מכני חיצוניים במהלך הדגירה. 3T3 פיברובלסט תא התנהגויות השפיעו על ידי שילוב של הידרוג צורה, מגוון רחב של הדרכה מתיחה מתיחה רמזים היו הפגינו במהלך הצפיה תא היישור בתוך סביבות תלת-ממד ECM-מימטי בשבב מעבר צבע למתח במשך 3 ימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להשוות את הווריאציות מכני בין כל הידרוג מעגלית בשבב גירוי שהושלמו זן הדרגתיות, אנחנו נמדדים את רוחב הקו כל הידרוג מעגלית בשני שבבי זהה, עם הזרקת כרכים של 0 µL (איור 4a), 40 µL (איור 4b), בהתאמה. Elongations אחוז על כל עיגול היו מחושב על ידי חלוקה של elongations בשבב 40 הזריק µL רוחב הקו hydrogels המתאימה ב- 0 µL הזרקת השבב (איור 4 c). הידרוג היא חומר וחישובים, כך המתח קבלנות אנכי יהיה שווה ערך ל המתח התארכות לרוחב. לכן, elongations אחוז בשבב עם נפח הזרקה 40-µL להראות התארכות 15-65%, אשר ניתן להמיר את המתח compressive (ראה 1 קובץ משלים).
פלורסנט מכתים של גרעין התא, F-אקטין עם דאפי, phalloidin, בהתאמה, נעשה כדי לנתח את היישור הסלולר. ההכתמה דאפי סיפק נתונים על התמצאות גרעינית, ההכתמה phalloidin הוחל להעריך תא מתפשטת. איור 5a -c מציג את היישור תא השבב מעבר צבע למתח. בשורה 1, התאים 3T3 מיושרים לאורך בכיוון רדיאלי. ב הידרוג 7, התאים מיושר באופן אקראי, התאים מיושר לאורך הכיוון המעגלי בשורה 12. בהתאם, פלורסנט צביעת תמונות, התגלה משמרת ב- 90 ° מהזווית של יישור התא של תאי 3T3 בשורה 1 (אלונגציה מרבית הידרוג בכיוון רדיאלי) לזווית יישור של התאים עם ציר זמן היישור קו 12 (הנמוך התארכות הידרוג בכיוון רדיאלי).
2,הקודמת מחקר9, תאים hydrogels בדוגמת קו 200-מיקרומטר במטרה ליישר לאורך כיוון ציר זמן הידרוג. עם זאת, במחקר זה, הבחנו כי רצועת מוארך על hydrogels 200-מיקרומטר בכיוון ציר קצר סיפקה גורם נוסף כדי להשפיע על ותשלטו היישור התאית על ידי שליטה האחוז של הלחץ על הידרוג. לזן של 65% בקו 1, היישור הרדיקלי הוכיח כי התארכות למתוח הידרוג חולש על היישור בתא. לזן של 15% על קו 12, מעגלי יישור הוכיח כי האפקט ארוך-ציר נשלט היישור בתא. לזן של 40% על הידרוג 7, התאים מיושר באופן אקראי בשל הניטרול של האפקט זן והכוונה גאומטריה.
איור 1 . PMMA עובש אמא עבור גיליון PDMS פבריקציה תקע. (א) הרכיבים הנפרדים של כייר PMMA, כולל צלחת התחתון, גבול מסגרת, ערוץ זרימה. לאחר ההרכבה עם סרט הדבקה דו-צדדי, נוצר (b) , התבנית אמא PMMA הגיליון זרימה. (ג) עובש PMMA אחר שמתארגנת בשביל לחבר PDMS. המספר האדום מייצג את העומק. (יחידה: מ מ) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . Photomask פלסטיק, לעיצוב Micropattern הידרוג עמוסי תא. ישנם שני פתחים עם צורות משולש (2 מ מ ובשורה התחתונה ו- 6.5 מ מ גובה) מתחבר ערוצי זרימה לספק תא טריים תרבות בינוני. (א) photomask פלסטיק מסומן עם הממד. התקופה של המעגל קונצנטריים היא 400 ננומטר, את המחזור הוא 50%. הקוטר של מעגל מרכז הוא 2 מ מ. (b) הפריסה photomask, בלי תוויות עבור הדפסת לייזר על סרט פלסטיק שקוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. תהליכי ייצור של המילוי ההדרגתי זן עמוסי תא הידרוג לאורך בכיוון רדיאלי של שבב Fluidic PDMS. (א) photomask פלסטיק מיושר, תקוע מתחת השבב עם ערוץ fluidic מצופים TMSPMA. מזרק מיקרו עם פתרון תא prepolymer מוכנס לתוך הים של השבב ויש להזרקת µL כ-50 כדי למלא את ערוץ הזרימה. (b) בשקע של ערוץ הזרימה סגורה עם PDMS הכנס µL 40 נוספים של פתרון תא prepolymer מוזרק. הזכוכית היא בדוגמת UV ב-30 s כדי לפברק את הידרוג מעגלית קונצנטריים בשבב זרימה. (ג) הלחץ נוזלי הוא שוחרר בתעלה זרימה על ידי ניתוק לשקע, התערובת של האו ם-crosslinking נשטף עם DPBS. (ד) שבב עם זן הדרגתיות סטטי חלה קונצנטריים עמוסי תא hydrogels כי הם מוכנים culturing התא. במהלך תהליך crosslinking UV, נוצר (e) בגובה הדרגה לא רציפה של הידרוג לאורך הרדיוס. (ו) לאחר ניתוק לשקע, קרום PDMS הופך שטוח ומחיל מתח מעבר צבע על hydrogels התא-אנקפסולציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. מעבר הצבע התארכות הידרוג טהור. כאשר רוחב קו התארכות והאחוזים של הידרוג טהור ללא עיטוף תא במעבר הצבע זן שבב ביום 3 עם (א) 0-µL (קבוצת הביקורת) ואמצעי אחסון הזרקה של 40-µL (b) . (ג) אחוז התארכות הוא מחושב על ידי חלוקת הערך של ההבדל ברוחב הקו בין 40 µL 0 µL לפי קו רוחב 40 µL. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 . תמונות מלון פלורסנט הכתם אקטין-גרעין של 3T3 תאים במארז האסימונים מעבר צבע על יום 3. הכיוון יישור תא (-ג) קו 1 (d-f) קו 7, (g-i) קו 12 לחשוף יישור רדיאלי, יישור אקראי ויישור מעגלית, בהתאמה. הצבעים ירוק וכחול להראות את הכתמים אקטין, גרעין, בהתאמה. הקו הלבן המנוקד מייצג את הגבול של הידרוג. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלים איור 1. חישוב שכדור בצורת כיפה PDMS. H(x): העקומה קמורה PDMS; H0: ההבדל הגובה בין הכיפה PDMS לפני ואחרי דפורמציה; r: הרדיוס של הכיפה; V: הזרקת יתר אמצעי האחסון של האזור הכחול, הגורמת להרכב PDMS כמו כיפה. לפרטים, ראה 1 קובץ משלים . אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.
קובץ משלים 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בנייר זה, מדווחים על גישה פשוטה כדי להשוות בהתנהגות התא יישור לאחר הידרוג הצורה והכוונה מתיחה מתיחה. קרום PDMS גמיש יוצר של עקמומיות בצורת כיפה ליצירת בגבהים שונים של hydrogels מעגלית קונצנטריים. לאחר שחרור הלחץ, קרום PDMS כוח מחיל באופן אוטומטי על hydrogels בדוגמת מיקרו ליצירת מעבר צבע למתח/התארכות, עם מקסימום במרכז, מינימום על הגבול החיצוני. היווצרות של המתח הדרגתי הוא תוכנן על ידי קרום PDMS גמיש והטיפול השבב fluidic, ישנם מספר פרמטרים חשובים, זה צריך להיות נוכחת כדי: (i) שליטה מדויקת על העובי של PDMS קרום הוא חיוני כדי להתאים את הערך מעבר צבע למתח. אם הקרום עבה מדי, אפילו הזרקת מרבית נפח התא prepolymer לא תהיה אפשרות לייצר עקומה קמורה נאות קרום PDMS עבור crosslinking מעבר לגובה עמוסי תא hydrogels. לעומת זאת, קרום דק יותר מדי PDMS אין אפשרות להחיל מספיק כוח כדי hydrogels. אנא בדוק כי המשקל של PDMS משומרים בתוך כייר כיסוי PDMS הוא בסביבות 1.6-2.0 גרם לכל שבב. (ii) מניעת זיהום חשוב מאוד בזמן טיפול crosslink הידרוג עמוסי תא בשבב fluidic. לפני תא culturing בחממה, ביסודיות כביסה עם PBS סטיריליים בערוץ fluidic ושימוש 75% אתנול לנגב את המשטח של השבב יכול לעזור למנוע את נושא זיהום. (iii) את הריכוז של photoinitiator, את המינון של חשיפה UV צריך להיזהר ונשלטת בטווח של ~0.1% - 2% (0.5% מומלץ). נגמר-crosslinking את הידרוג, ומינון יתר את הקרנת UV תגרום הכדאיות תא נמוך. (iv) הקו-הרוחב של הידרוג בדוגמת לא צריכה להיות גדולה מדי. אחרת, קצב החלפת מזין hydrogels עבה לא יוכלו לתמוך התפשטות תאים. בדרך כלל, מומלץ פחות מ-300 מיקרומטר. המרווח בין שני מעגלים הידרוג יכולים להיות מגוונים, מחזור 50% חובה מומלץ. (v) בזמן כביסה או מילוי ערוץ הזרימה עם פתרון, יש להימנע היווצרות בועות. Pipetting בעדינות את הפתרון בשבב יכול לעזור להסיר את הבועות.
הרעיון של הדרגתיות המתח שנוצר על ידי עקמומיות מעוותים PDMS ניתן לשדרג עוד יותר בהחלת זנים מעבר צבע דינמי, ניתן לשלב עם גירוי ביוכימי, אשר יכולים להפיק תועלת מחקרים רבים בנושא התחדשות רקמות פונקציונלי. ניתן להחליף את המודול הזרקת fluidic פשוטה עם תקע PDMS כל מערכת fluidic מתקדמות לבקרת ניסיוני המורחבת. ניתן להחליף את התבנית PMMA גם תבנית microfabricated SU-8 או תבנית סיליקון נחרטו בצובר.
השבב מעבר צבע למתח הזה עם הידרוג עמוסי תא מעגלית ניתן להפיק כוח compressive סטטי הידרוג 3D ללא מכונות מכאני או חשמלי חיצוני. לכן, הוא מספק פלטפורמה ההקרנה מהר על חקירת תא התנהגויות בסדרה של תנאים זן, ללא הסיכון של בעיות זיהום הנגרם על ידי פעולת מכונות חיצוני. עם זאת, גירוי זן שבשליטת הזמן אינו בר השגה כי קרום PDMS יוצר זנים עד ההשפלה של הידרוג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
פרויקט זה נתמך על ידי בוגר סטודנט מחקר בחו ל התוכנית (NSC-101-2917-I-007-010); התוכנית הנדסה ביו-רפואית (NSC-101-2221-E-007-032-MY3); ואת התוכנית ננוטכנולוגיה הלאומי (NSC-101-2120-M-007-001-), המועצה הלאומית למדע של R.O.C., טייוואן. המחברים רוצה להודות פרופסור עלי Khademhosseini, Gulden Camci-Unal, Arghya פול, וליאו Ronglih בבית הספר לרפואה בהרווארד לשיתוף הטכנולוגיה כימוס הידרוג ותא.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL black microcentrifuge tube | Argos Technologies | 03-391-161 | This one can be replaced with a neutral color of 1.5 mL tube covered with aluminun foil |
| 10x DPBS | Sigma-Aldrich | 56064C | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| Calcein | Molecular Probe | C1430 | For labeling viable cells |
| CCD | PCO. Imaging | Pixelfly qe | |
| Cell membrane permeating solution | Sigma-Aldrich | X100 | 0.5% Triton X-100 for permeating cell membrane |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Cell nucleus staining |
| Dialysis membrane | Sigma-Aldrich | D9527 | Molecular weight cut-off = 14,000 |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| Double-side tape | 3M | 8003 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500 | gel strength 300, type A, from porcine skin |
| High frequency electronic corona generator | Electro-technic products | MODEL BD-20 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | |
| Micro syringe | Hamilton | 80501 | 50 μL |
| Microscope | Olympus | IX71 | Include two filter sets: LF405/LP-B-000 and LF488/LP-C-000 from Semrock |
| Oxygen plasma machine | Harrick plasma | PDC-001 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cell |
| PDMS | DOW CORNING | Sylgard 184 | Mixture for PDMS chip cast-molding fabrication |
| Pen-Strep | Gibco | 10378-016 | penicillin/streptomycin |
| Photoinitiator | CIBA | Irgacure 2959 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For labeling dead cells |
| Sterile Filtration cup | Millipore | SCGPT05RE | |
| TMSPMA | Sigma-Aldrich | 440159 | For hydrogel immobilization |
| Ultrasonicator | Delta | D150H | 150W, 43kHz |
| UV light | DAIHAN | WUV-L10 | |
| Freeze Dryer | FIRSTEK | 150311025 | |
| NIH3T3(fibroblast) | Food Industry Research and Development Institute(FIRDI) | 08C0011 | |
| MOXI Z Mini Automated Cell Counter | ORFLO | MXZ001 |
References
- Simmons, C. S., Petzold, B. C., Pruitt, B. L. Microsystems for biomimetic stimulation of cardiac cells. Lab Chip. 12 (18), 3235-3248 (2012).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
- Guan, J., et al. The stimulation of the cardiac differentiation of mesenchymal stem cells in tissue constructs that mimic myocardium structure and biomechanics. Biomaterials. 32 (24), 5568-5580 (2011).
- Wan, C. R., Chung, S., Kamm, R. D. Differentiation of embryonic stem cells into cardiomyocytes in a compliant microfluidic system. Ann Biomed Eng. 39 (6), 1840-1847 (2011).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Li, X., Chu, J. S., Yang, L., Li, S. Anisotropic effects of mechanical strain on neural crest stem cells. Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 598-605 (2012).
- Butcher, J. T., Barrett, B. C., Nerem, R. M. Equibiaxial strain stimulates fibroblastic phenotype shift in smooth muscle cells in an engineered tissue model of the aortic wall. Biomaterials. 27 (30), 5252-5258 (2006).
- Ramon-Azcon, J., et al. Gelatin methacrylate as a promising hydrogel for 3D microscale organization and proliferation of dielectrophoretically patterned cells. Lab Chip. 12 (16), 2959-2969 (2012).
- Park, S. H., Sim, W. Y., Min, B. H., Yang, S. S., Khademhosseini, A., Kaplan, D. L. Chip-Based Comparison of the Osteogenesis of Human Bone Marrow- and Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells under Mechanical Stimulation. PLoS One. 7 (9), e46689 (2012).
- Gould, R. A., et al. Cyclic Strain Anisotropy Regulates Valvular Interstitial Cell Phenotype and Tissue Remodeling in 3D Culture. Acta Biomater. 8 (5), 1710-1719 (2012).
- Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Proc Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stemcells. Natl Acad Sci USA. 103 (44), 16095-16100 (2006).
- Sim, W. Y., Park, S. W., Park, S. H., Min, B. H., Park, S. R., Yang, S. S. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
- Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L.
- Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue Eng Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
- Wan, J. Microfluidic-Based Synthesis of Hydrogel Particles for Cell Microencapsulation and Cell-Based Drug Delivery. Polymers. 4 (2), 1084-1108 (2012).
- Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
- Keung, A. J., Kumar, S., Schaffer, D. V. Presentation Counts: Microenvironmental Regulation of Stem Cells by Biophysical and Material. Cues. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 533-556 (2010).
- Segers, V. F., Lee, R. T. Stem-cell therapy for cardiac disease. Nature. 451 (7181), 937-942 (2008).
- Hsieh, H. Y., et al. Gradient static-strain stimulation in a microfluidic chip for 3D cellular alignment. Lab Chip. 14 (3), 482-493 (2014).
