Summary
Este artículo presenta un enfoque simple para proporcionar cepas estática gradiente discontinua en un hidrogel celular cargado concéntrico regular alineación de celda para ingeniería de tejidos.
Abstract
Orientación artificial para alineación celular es un tema candente en el campo de la ingeniería de tejidos. La mayoría de la investigación anterior ha investigado solo alineación celular inducida por la cepa en un hidrogel cargadas de célula mediante complejos procesos experimentales y sistemas de control de masas, que se asocian generalmente a problemas de contaminación. Así, en este artículo, proponemos un enfoque simple para construir una gradiente tensión estática usando un chip neumático con una cubierta plástica de PDMS y un sustrato de vidrio transparente UV para la estimulación del comportamiento celular en un hidrogel 3D. Prepolímero de células foto-patternable sobrecarga en la cámara de neumático puede generar una membrana PDMS curva convexa en la cubierta. Después de la reticulación UV, a través de un micropattern circular concéntrica bajo la membrana PDMS curvada y tampón de lavado, un microambiente para la investigación de la célula comportamientos bajo una variedad de cepas degradadas es uno establecido en un único chip fluídico, sin instrumentos externos. Células NIH3T3 fueron demostradas después de observar el cambio en la tendencia de alineación celular bajo dirección de geometría, en cooperación con el estímulo de la cepa, que varió de 15-65% de los hidrogeles. Después de una incubación de 3 días, la geometría de hidrogel había dominado la alineación celular bajo tensión compresiva baja, donde las células alineación a lo largo de la dirección de alargamiento de hidrogel bajo alta tensión a la compresión. Entre éstos, las células demostraron alineación al azar debido a la disipación de la radical orientación de elongación de hidrogel y la orientación de la geometría del hidrogel con dibujos.
Introduction
Servir como un material del bloque que imita un microambiente nativo, un hidrogel que contiene la matriz extracelular (ECM) puede reconstruir biomiméticos tejido andamios para apoyar el crecimiento de la célula. Poseer las funciones de un tejido, alineación de celda organizado es un requisito esencial. Varios 2D (es decir, las células cultivadas en una superficie) y 3D (es decir, las células encapsuladas en un hidrogel) alineaciones de celda se han obtenido por cultivo o encapsular las células o en substratos flexibles con micro- o nano-patrones1. Alineación 3D celular en microarquitectura es más atractiva, como el microambiente está más cercano del tejido propio constructo2,3,4. Un enfoque común para la alineación celular 3D es la localización geométrica de hidrogel forma2,3. Debido al espacio restringido para la proliferación celular en la dirección de eje corto, células objetivo alinear a lo largo de la dirección de eje largo en un hidrogel de micro-patrón. Otro enfoque es aplicar stretch extensible a los hidrogeles para lograr alineación de celdas paralela a la dirección de estiramiento4,5.
Estimulación biofísica en hidrogeles de ECM, como la tensión compresiva o un campo eléctrico, puede regular funciones celulares para la integración adecuada del tejido, proliferación y diferenciación1,2,3. Mucha investigación se ha realizado para investigar el comportamiento celular mediante la aplicación de una condición de tensión a la vez utilizando múltiples control mecánico unidades4,6,7,8,9. Por ejemplo, el uso de motores paso a paso mecánica apretado o estirado en un hidrogel de colágeno de células encapsuladas 3D ha sido un común enfoque7,10. Sin embargo, dicho equipo de control requiere un espacio extra y enfrenta el problema de la contaminación en la incubadora9,7,11,12. Además, el instrumento grande no puede dar un ambiente de control preciso para proporcionar alta reproducibilidad13.
Teniendo en cuenta que hidrogeles cargados de celular se emplean generalmente en la escala micro para aplicaciones biomédicas, es ventajoso combinar técnicas de MEMS para generar un rango de tensión/estiramiento del estímulo a investigar simultáneamente el comportamiento celular en 3D biomiméticos construcciones en vitro2,14,15,16,17,18. Por ejemplo, usando la presión del gas a deformar la membrana PDMS en chips de microfluídica puede dar lugar a varias cepas, conduce la diferenciación celular a diferentes linajes9,16. Sin embargo, hay muchos desafíos técnicos, tales como procesos de fabricación de chips complicados en un cuarto limpio y la integración de software control de motores, bombas, válvulas y gases comprimidos.
En este trabajo, demostramos un enfoque simple para obtener un chip de microfluidos gradiente de tensión estática autosostenible mediante el empleo de un patrón de hidrogel circulares concéntricos y una membrana flexible de PDMS. A diferencia de la mayoría de los enfoques existentes, nuestra plataforma es un dispositivo miniatura portátil y desechable que puede ser fabricado fuera de un salón amarillo y que posee uno mismo-generar tensiones degradadas concéntricos hidrogeles encapsulado en celular, sin equipos mecánicos externos durante la incubación. Comportamientos de células de fibroblastos 3T3 influenciado por una combinación de forma de hidrogel y una variedad de señales de orientación elástico resistencia a la tracción fueron demostrados durante la observación de la alineación celular dentro de entornos 3D ECM-mimético en el chip de gradiente de presión durante 3 días.
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Representative Results
Para comparar las variaciones mecánicas entre cada hidrogel circular en el chip de estimulación completa tensión degradado, medimos el ancho de línea de cada hidrogel circular en dos de las virutas del mismo, con los volúmenes de inyección de 0 μL (figura 4a) y 40 μl (Figura 4b), respectivamente. El alargamiento porcentual en cada círculo se calcularon dividiendo el alargamiento en el chip 40 μl inyectado por las anchuras de línea de los hidrogeles correspondientes en el chip 0 μl inyectado (figura 4C). El hidrogel es un material incompresible, por lo que la tensión vertical de contratación será equivalente a la tensión de elongación lateral. Por lo tanto, el alargamiento porcentual en el chip con el volumen de inyección 40 μl muestra elongación de 15-65%, que puede convertirse en la cepa a la compresión (véase la archivo adicional 1).
Tinción fluorescente de los núcleos celulares y F-actina con DAPI y phalloidin, respectivamente, se realizó para analizar la alineación celular. La tinción DAPI proporcionaron datos sobre orientación nuclear, y la tinción phalloidin fue aplicada para evaluar la difusión de la célula. Figura 5a -c muestra el alineamiento de celda en el chip de gradiente de tensión. En la línea 1, las células 3T3 alinean a lo largo de la dirección radial. En hidrogel 7, las células alineación al azar, y las células alineación a lo largo de la dirección circular en la línea 12. Según el fluorescente coloración de imágenes, se descubrió un cambio de 90 ° desde el ángulo de alineación de la célula de las células 3T3 en la línea 1 (hidrogel máxima elongación en la dirección radial) en el ángulo de alineación de las celdas con la alineación de eje largo de la línea 12 (menor alargamiento de hidrogel en la dirección radial).
En la anterior investigación2,9, células en hidrogeles con dibujos de línea 200 μm pretenden alinear a lo largo de la dirección de eje largo de la hidrogel. Sin embargo, en este estudio, se observó que el tramo alargado en los hidrogeles de 200 μm en la dirección del eje corto proporcionado otro factor para afectar y dominan la alineación celular controlando el porcentaje de la tensión sobre el hidrogel. Para la cepa de 65% de la línea 1, la alineación radical demostró que el tramo de alargamiento del hidrogel domina la alineación de la celda. Para la cepa de 15% en la línea 12, la alineación circular demostró que el efecto de eje largo había dominado la alineación de la celda. Para la cepa de 40% en hidrogel 7, las células alinean al azar debido a la neutralización de los efectos de dirección y tensión de geometría.
Figura 1 . Molde madre de PMMA para PDMS y enchufe fabricación. (a) los componentes separados del molde PMMA, incluyendo una placa inferior, marco límite y un canal de flujo. Después del montaje con cinta de doble cara, (b) el molde de la madre PMMA para la hoja de flujo está formado. (c) molde otro PMMA está montado para el PDMS del enchufe. El número rojo representa la profundidad. (unidad: mm) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Diseño plástico de la fotomáscara para el celular cargado hidrogel Micropattern. Hay dos aberturas con forma de triángulo (2 mm en la línea de fondo y 6,5 mm de altura) conecta a los canales de flujo para suministro de medio de cultivo celular fresco. (a) el plástico photomask está etiquetado con la dimensión. El período de los círculos concéntricos es de 400 nm y el ciclo de trabajo es 50%. El diámetro del centro del círculo es 2 mm. (b) la distribución del photomask, sin etiquetas para impresión láser sobre una capa de plástico transparente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Procesos de fabricación de la gradiente de tensión hidrogel cargadas de celulares a lo largo de la dirección Radial en un Chip fluídico PDMS. (a) un photomask plástico es alineado y pegado bajo el chip con un canal neumático cubierto de TMSPMA. Una micro jeringa con solución de prepolímero de la célula es insertada en la entrada del chip y se utiliza para inyectar aproximadamente 50 μL para llenar el canal de flujo. (b) la salida del canal de flujo se cierra con el PDMS enchufe y se inyecta un adicional 40 μl de solución de prepolímero de la célula. El fondo de cristal es UV-patrón de 30 s para fabricar el hidrogel circular concéntrico en el chip de flujo. (c) se libera la presión del líquido en el canal de flujo desconectando la corriente y la mezcla de las Naciones Unidas-reticulación es lavar con DPBS. (d) un chip con cepa gradiente estático aplica concéntricos hidrogeles cargados de células que están listos para el cultivo de células. Durante el proceso de reticulación UV, se forma (e) una altura gradiente discontinua de hidrogel a lo largo del radio. (f) después de desconectar la toma de corriente, la membrana PDMS se convierte en plana y se aplica tensión de gradiente en los hidrogeles encapsulado en celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. El gradiente de alargamiento de hidrogel puro. El ancho de la línea de alargamiento y porcentaje de hidrogel puro sin encapsulación de la célula en el gradiente de tensión chip el día 3 con el (a) 0 μL (grupo control) y volúmenes de inyección 40 μl (b) . (c) el porcentaje de elongación se calcula dividiendo el valor de la diferencia de anchura de línea entre 40 μl y 0 μL por el ancho de línea de 40 μl. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . Imágenes de actina-núcleo mancha fluorescentes del encapsulado de células 3T3 en las fichas degradado el día 3. La dirección de alineación celular en (- c) línea 1, línea 7 del (d-f) y (g-i) 12 revelan radiales, alineación al azar y alineación circular, respectivamente. Los colores verdes y azules muestran las manchas de la actinia y el núcleo, respectivamente. La línea blanca punteada representa el límite del hidrogel. Barra de escala: 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 1 complementaria. Cálculo de la curvatura en forma de cúpula PDMS. H (x): la curva convexa de PDMS; H0: la diferencia de altura máxima entre la cúpula PDMS antes y después de la deformación; r: el radio de la cúpula; V: el volumen de inyección excesiva de la región de azul, que causa la deformación de PDMS como una cúpula. Para detalles véase la archivo adicional 1 . Haga clic aquí para descargar esta figura.
Archivo complementario 1. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
En este papel, Divulgamos sobre un enfoque simple para comparar comportamiento de alineación de celda después de hidrogel forma orientación y tramo extensible. Una membrana PDMS flexible crea una curvatura en forma de cúpula para generar diferentes alturas de hidrogeles circulares concéntricos. Después de soltar la presión, la membrana PDMS automáticamente aplica fuerza a los hidrogeles micro-patrón para formar el gradiente tensión/alargamiento, con un máximo en el centro y un mínimo en el límite exterior. Como la formación de la cepa gradiente está diseñada por la flexible membrana PDMS y la manipulación de la viruta fluídica, hay varios parámetros importantes que deben ser atendidos: membrana (i) un control preciso del grosor de los PDMS es crucial para ajustar el valor del gradiente de tensión. Si la membrana es demasiado gruesa, incluso el volumen de inyección máxima de prepolímero de celular no será capaz de generar una adecuada curva convexa en la membrana PDMS para la reticulación de altura gradiente de hidrogeles cargados de celular. Por el contrario, una muy delgada membrana PDMS puede aplicar suficiente fuerza a los hidrogeles. Compruebe que el peso de PDMS no curada en el molde de la cubierta PDMS es alrededor de 1.6-2.0 g por chip. (ii) prevención de la contaminación es muy importante durante el manejo de la reticulación del hidrogel celulares cargados en el chip fluídico. Antes de la célula de cultivo en la incubadora, bien lavado con PBS esterilizada en el canal fluídico y utilizando el 75% etanol para limpiar la superficie de la viruta puede ayudar a evitar el problema de la contaminación. (iii) la concentración de fotoiniciador y la dosis de exposición Ultravioleta deben ser cuidadosamente controlada y en la gama de ~0.1% - 2% (0.5% se recomienda). Reticulación en el hidrogel y la sobredosificación de la irradiación UV resultará en viabilidad celular baja. (iv) el ancho de línea del hidrogel con motivos no debe ser demasiado grande. De lo contrario, la tasa de reemplazo de nutrientes en los hidrogeles gruesas no será capaz de apoyar la proliferación celular. Por lo general, se recomienda menos de 300 μm. Se puede variar el espacio entre dos círculos de hidrogel, y se recomienda un ciclo de deber del 50%. (v) mientras que lavar o volver a llenar el canal de flujo con la solución, debe evitarse la formación de burbujas. Pipeteando suavemente la solución en el chip puede ayudar a quitar las burbujas.
El concepto de cepa gradiente generado por la curvatura deformación de PDMS puede actualizarse más a la aplicación de cepas gradiente dinámicas y puede ser integrado con el estímulo bioquímico, que puede beneficiar a muchos estudios sobre la regeneración de tejido funcional. El módulo de inyección fluídica simple con un enchufe de PDMS puede reemplazarse por cualquier sistema neumático avanzado para extendido control experimental. El molde PMMA también puede ser sustituido por un molde recientemente SU-8 o un molde del silicio a granel-grabado al agua fuerte.
Este chip de gradiente de tensión con un hidrogel circular cargados de celular puede generar estática fuerza de compresión sobre el hidrogel 3D sin máquinas mecánicas o eléctricas externas. Por lo tanto, proporciona una plataforma de cribado rápido para investigar comportamientos de la célula en una serie de condiciones de tensión, sin el riesgo de problemas de contaminación causados por la operación de máquinas externas. Sin embargo, estimulación de tensión controlada por el tiempo no es factible porque la membrana PDMS genera cepas hasta la degradación de la hidrogel.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este proyecto fue apoyado por el graduado estudiante de estudio al exterior programa (NSC-101-2917-I-007-010); el programa de Ingeniería Biomédica (NSC-101-2221-E-007-032-MY3); y el programa nacional de nanotecnología (NSC-101-2120-M-007-001-), Consejo Nacional de ciencia de R.O.C., Taiwán. Los autores desean agradecer a Prof. Ali Khademhosseini, Gulden Camci-Unal, Arghya Paul y Ronglih Liao en Harvard Medical School para compartir la tecnología de encapsulación de hidrogel y de la célula.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL black microcentrifuge tube | Argos Technologies | 03-391-161 | This one can be replaced with a neutral color of 1.5 mL tube covered with aluminun foil |
| 10x DPBS | Sigma-Aldrich | 56064C | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| Calcein | Molecular Probe | C1430 | For labeling viable cells |
| CCD | PCO. Imaging | Pixelfly qe | |
| Cell membrane permeating solution | Sigma-Aldrich | X100 | 0.5% Triton X-100 for permeating cell membrane |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Cell nucleus staining |
| Dialysis membrane | Sigma-Aldrich | D9527 | Molecular weight cut-off = 14,000 |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| Double-side tape | 3M | 8003 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500 | gel strength 300, type A, from porcine skin |
| High frequency electronic corona generator | Electro-technic products | MODEL BD-20 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | |
| Micro syringe | Hamilton | 80501 | 50 μL |
| Microscope | Olympus | IX71 | Include two filter sets: LF405/LP-B-000 and LF488/LP-C-000 from Semrock |
| Oxygen plasma machine | Harrick plasma | PDC-001 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cell |
| PDMS | DOW CORNING | Sylgard 184 | Mixture for PDMS chip cast-molding fabrication |
| Pen-Strep | Gibco | 10378-016 | penicillin/streptomycin |
| Photoinitiator | CIBA | Irgacure 2959 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For labeling dead cells |
| Sterile Filtration cup | Millipore | SCGPT05RE | |
| TMSPMA | Sigma-Aldrich | 440159 | For hydrogel immobilization |
| Ultrasonicator | Delta | D150H | 150W, 43kHz |
| UV light | DAIHAN | WUV-L10 | |
| Freeze Dryer | FIRSTEK | 150311025 | |
| NIH3T3(fibroblast) | Food Industry Research and Development Institute(FIRDI) | 08C0011 | |
| MOXI Z Mini Automated Cell Counter | ORFLO | MXZ001 |
References
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