Summary
Dit artikel introduceert een eenvoudige benadering aan het verstrekken van niet-continu verlopende statische spanningen op een concentrische cel-beladen hydrogel te reguleren celuitlijning voor weefselengineering.
Abstract
Kunstmatige begeleiding voor cellulaire uitlijning is een hot topic op het gebied van weefselengineering. Allermeest naar de vorige onderzoek heeft één stam-geïnduceerde cellulaire uitlijning op een cel-beladen hydrogel onderzocht met behulp van complexe experimentele processen en massale controle systemen, die meestal geassocieerd met besmetting kwesties. Dus, in dit artikel stellen wij een simpele aanpak aan de opbouw van een kleurovergang statische belasting met behulp van een fluidic chip met een plastic PDMS cover en een UV transparant glas substraat voor de stimulatie van cellulaire gedrag in een 3D hydrogel. Overbelading foto-patternable cel prepolymeren in het fluidic kamer kunt genereren een convex gebogen PDMS membraan op de cover. Na UV crosslinking, via een concentrische circulaire micropattern onder de gebogen PDMS membraan, en buffer wassen, een communicatie voor behandelende cel gedrag onder een verscheidenheid van kleurovergang stammen is zelf gevestigd in één fluidic chip, zonder externe instrumenten. NIH3T3 cellen werden aangetoond na het observeren van de verandering in de trend van de cellulaire uitlijning onder begeleiding van de meetkunde, in samenwerking met de stimulatie van de stam, die van 15-65% op hydrogels variëren. Na een 3-daagse incubatie domineerde de hydrogel geometrie de celuitlijning onder lage druksterkte stam, waar cellen uitgelijnd langs de hydrogel rek richting onder hoge druksterkte stam. Tussen deze toonden de cellen willekeurige uitlijning als gevolg van de afbraak van de radicale begeleiding van hydrogel rek en de richtsnoeren van de geometrie van de patroon hydrogel.
Introduction
Een blok-materiaal dat een inheemse communicatie bootst bijeenkomen, kan een hydrogel extracellulaire matrix (ECM) met herbouwen biomimetische weefsel steigers ter ondersteuning van de celgroei. Om te bezitten van de functies van een weefsel, is georganiseerde Celuitlijning een essentiële eis. Diverse 2D (dat wil zeggen, de cellen gekweekt op een oppervlak) en 3D (dat wil zeggen, de cellen ingekapseld in een hydrogel) cel uitlijning zijn bereikt door kweken of inkapselen van cellen in of op flexibele ondergronden met micro- of nano-patronen1. 3D uitlijning in microarchitectuur is aantrekkelijker te maken, zoals de communicatie dichter bij de inheemse weefsel construct2,3,4 is. Een gemeenschappelijke aanpak voor 3D Celuitlijning is de geometrische cue hydrogel vorm2,3. Vanwege de beperkte ruimte voor celproliferatie in de richting van de korte-as willen cellen uitgelijnd langs de richting van de lange-as in een micro-patroon hydrogel. Een andere benadering is trekvast stretch beroep openstaan bij de hydrogels om Celuitlijning parallel aan de stretch richting4,5.
Biofysische stimulatie op ECM hydrogels, zoals druksterkte stam of een elektrisch veld, kan reguleren cel functies voor goede weefsel integratie, proliferatie en differentiatie1,2,3. Veel onderzoek is gedaan om te onderzoeken van cellulaire gedrag door één stam voorwaarde toe te passen op een moment met behulp van meerdere mechanische controle eenheden4,6,7,8,9. Bijvoorbeeld is het gebruik van mechanische stap motors geperst of uitgerekt over een 3D cel-ingekapseld collageen hydrogel een gemeenschappelijke aanpak7,10. Echter, dergelijke controlerende apparatuur vereist extra ruimte en geconfronteerd met het probleem van de besmetting in de incubator7,9,11,12. Daarnaast het grote instrument niet het geven van een nauwkeurige controleomgeving te bieden hoge reproduceerbaarheid13.
Gezien het feit dat de cel-beladen hydrogels meestal op de micro-schaal voor biomedische toepassingen worden ingezet, is het voordelig om te combineren MEMS technieken voor het genereren van een aantal van de stam/stretch stimulatie te onderzoeken gelijktijdig cel gedrag in 3D biomimetische constructies in vitro2,14,15,16,17,18. Bijvoorbeeld kan met behulp van gasdruk te vervormen het PDMS membraan in microfluidic chips aanleiding geven tot verschillende stammen, celdifferentiatie rijden naar verschillende geslachten9,16. Er zijn echter vele technische uitdagingen, zoals de gecompliceerde chip fabricage processen in een schone kamer en de software controle integratie van motoren, pompen, afsluiters en samengeperste gassen.
In dit werk tonen we een eenvoudige benadering van een zichzelf onderhoudende kleurovergang static-stam microfluidic chip verkrijgen door gebruik te maken van een concentrische circulaire hydrogel patroon en een flexibele PDMS membraan. In tegenstelling tot de meeste van de bestaande benaderingen is ons platform een draagbare en wegwerp miniatuur-apparaat dat kan worden vervaardigd buiten een gele kamer en die bezit zelf genereren kleurovergang stammen op concentrische cel-ingekapseld hydrogels, zonder externe mechanische apparatuur tijdens de incubatie. 3T3 fibroblast cel gedrag beïnvloed door een combinatie van hydrogel vorm en een scala aan treksterkte stretch begeleiding signalen werden gedemonstreerd tijdens de observatie van de celuitlijning in 3D ECM-mimetische omgevingen in de kleurovergang stam-chip voor 3 dagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om te vergelijken de mechanische variaties tussen elke circulaire hydrogel in de voltooide kleurovergang stam stimulatie-chip, we gemeten de breedte van de lijn van elke ronde hydrogel in twee van de dezelfde chips, met injectie hoeveelheid 0 µL (figuur 4a) en 40 µL (figuur 4b), respectievelijk. Het percentage versnellingen op elke cirkel werden berekend door de versnellingen in de 40 µL-geïnjecteerd chip door de breedte van de lijn van de overeenkomstige hydrogels in de 0 µL-geïnjecteerd chip (Figuur 4 c). De hydrogel is een niet-samendrukbaar materiaal, zodat de verticale aanbestedende stam gelijkwaardig aan de spanning van de laterale rek zullen. Dus, het percentage versnellingen in de chip met het 40-µL geïnjecteerde volume Toon 15-65% rek, die kan worden geconverteerd naar de druksterkte stam (Zie aanvullende bestand 1).
Fluorescerende kleuring van de celkernen en F-actine met DAPI en phalloidin, respectievelijk, werd gedaan om het analyseren van de cellulaire uitlijning. De kleuring van de DAPI gegevens verstrekt over nucleaire oriëntatie, en de phalloidin kleuring werd toegepast voor de beoordeling van de verspreiding van de cel. Figuur 5a -c toont de celuitlijning in de kleurovergang stam-chip. In lijn 1, de 3T3 cellen uitgelijnd langs de radiale richting. In hydrogel 7, de cellen uitgelijnd willekeurig en cellen uitgelijnd langs de cirkelvormige richting in lijn 12. Overeenkomstig de fluorescerende vlekken van beelden, werd een verschuiving van de 90 ° van de hoek van de celuitlijning van de 3T3 cellen in lijn 1 (maximale hydrogel rek in de radiale richting) naar de hoek van de uitlijning van de cellen met de aanpassing van de lange-as in lijn 12 (laagste hydrogel rek in de radiale richting) ontdekt.
In het vorige onderzoek2,9willen cellen in 200-µm lijn-patroon hydrogels uitgelijnd langs de richting van de lange-as de hydrogel. In deze studie merkte we echter dat het verlengde traject op de 200-µm hydrogels in de richting van de korte-as een andere factor om te beïnvloeden en domineren de cellulaire uitlijning verstrekt door het beheersen van het percentage van de stam op de hydrogel. Voor de druk van de 65% op lijn 1 bewezen de radicale uitlijning dat het traject van de rek van de hydrogel de celuitlijning domineert. Voor de druk van 15% op lijn 12 bewezen de circulaire uitlijning dat het effect van de lange-as de celuitlijning domineerde. Voor de druk van 40% op de hydrogel 7, de cellen uitgelijnd willekeurig als gevolg van de neutralisatie van de meetkunde begeleiding en stam effect.
Figuur 1 . PMMA moeder schimmel voor PDMS blad en Plug Fabrication. (a) de gescheiden componenten van de PMMA schimmel, waaronder een bodemplaat, grens frame en stroom kanaal. Na montage met dubbelzijdige tape, wordt (b) de PMMA moeder mal voor het flow-blad gevormd. (c) een andere PMMA schimmel is gemonteerd voor de PDMS sluit. Het rode nummer vertegenwoordigt de diepte. (eenheid: mm) Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Kunststof Photomask ontwerp voor de cel-beladen Hydrogel Micropattern. Er zijn twee openingen met driehoek vormen (2 mm op de lijn van de onderkant en 6,5 mm in hoogte) verbinden met de kanalen van de stroom te leveren verse cel kweekmedium. (a) de kunststof photomask is gemarkeerd met de dimensie. De periode van de concentrische cirkel is 400 nm, en het pulserend sproeien is 50%. De diameter van de middencirkel is 2 mm. (b) de photomask lay-out, zonder etiketten voor laserafdrukken op een plastic transparante folie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Fabricage processen van het verloop van de stam cel-beladen Hydrogel langs de radiale richting in een PDMS Fluidic Chip. (a) een plastic photomask is uitgelijnd en vast onder de chip met een TMSPMA-gecoate fluidic kanaal. Een micro-spuit met prepolymer cell oplossing is ingevoegd in de inlaat van de chip en gebruikt voor het injecteren van ongeveer 50 µL om te vullen het flow-kanaal. (b) de uitlaat van de stroom-kanaal wordt afgesloten met de PDMS sluit en een extra 40 µL van prepolymer cell oplossing wordt geïnjecteerd. De glazen bodem is UV-patroon voor 30 s tot het fabriceren van de concentrische circulaire hydrogel in de stroom-chip. (c) de vloeistof druk wordt vrijgegeven in het kanaal van de stroom door de stekker uit het stopcontact en het VN-crosslinking mengsel is weggespoeld met DPBS. (d) een chip met statische kleurovergang stam geldt concentrische cel-beladen hydrogels die klaar voor het kweken van de cel zijn. Tijdens het crosslinking UV wordt (e) een niet-continu verlopende hoogte hydrogel langs de straal gevormd. (f) na de stekker uit het stopcontact, het PDMS membraan wordt plat en kleurovergang stress is van toepassing op de hydrogels cel-ingekapseld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Het zuivere Hydrogel rek verloop. De breedte van de uitvoerregel rek en het percentage zuivere hydrogel zonder inkapseling van de cel in het verloop van de stam chip op dag 3 met de (a) 0-µL (controlegroep) en (b) 40-µL injectie volumes. (c) het rek percentage wordt berekend door de waarde van de lijn breedte verschil tussen 40 µL en 0 µL door de lijndikte van 40 µL. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . Fluorescerende actine-nucleus vlek beelden van de 3T3 cellen ingekapseld in de kleurovergang Chips op dag 3. De cel uitlijning richting (a-c) lijn 1, lijn 7 van de (d-f) en (g-i) lijn 12 onthullen radiale uitlijning, willekeurige uitlijning en circulaire uitlijning, respectievelijk. De groene en blauwe kleuren tonen de actine en kern vlekken, respectievelijk. De gestippelde witte lijn geeft de grens van de hydrogel. Schaal bar: 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende figuur 1. Berekening van de koepel-vormige PDMS kromming. H: de convexe PDMS curve; H0: het maximale hoogteverschil tussen de PDMS koepel voor en na vervorming; r: de straal van de koepel; V: het overmatige geïnjecteerde volume van het blauwe gebied, waardoor de PDMS vervorming als een koepel. Zie aanvullende bestand 1 voor meer informatie. Klik hier voor het downloaden van dit cijfer.
Aanvullende bestand 1. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze paper rapporteren we op een eenvoudige benadering te vergelijken het uitlijningsgedrag cel na hydrogel vorm begeleiding en treksterkte rek. Een flexibele membraan PDMS creëert een koepel-vormige kromming voor het genereren van verschillende hoogtes van concentrische circulaire hydrogels. Na het loslaten van de druk, het PDMS membraan automatisch toegepast kracht op de hydrogels micro-patroon te vormen van de kleurovergang stam/rek, met een maximum in het midden en ten minste bij de buitenste rand. Zoals de vorming van de kleurovergang stam is ontworpen door de flexibele PDMS membraan en de behandeling van de fluidic chip, zijn er verschillende belangrijke parameters die moeten worden bijgewoond aan: (i) nauwkeurige controle van de dikte van het PDMS membraan is van cruciaal belang om de waarde van de kleurovergang stam. Als het membraan te dik is, zal zelfs het maximale geïnjecteerde volume van cel prepolymeren niet zitten kundig voor een juiste convexe curve genereren in het membraan van de PDMS voor crosslinking een kleurovergang hoogte van cel-beladen hydrogels. Daarentegen toepassen niet een te dunne PDMS membraan voldoende kracht op de hydrogels. Controleer of het gewicht van de niet-uitgeharde PDMS in de mal PDMS dekking ongeveer 1.6-2.0 g per spaander. (ii) verontreiniging preventie is zeer belangrijk bij het hanteren van de referentie van de cel-beladen hydrogel in de fluidic chip. Voor cel kweken in de incubator, grondig wassen met gesteriliseerde PBS in het fluidic kanaal en met behulp van 75% kan ethanol te vegen van het oppervlak van de chip helpen om te voorkomen dat het probleem van de besmetting. (iii) de concentratie van photoinitiator en de dosering van UV blootstelling moeten voorzichtig zijn gecontroleerd en in het bereik van ~0.1% - 2% (0,5% wordt aanbevolen). Over-crosslinking de hydrogel en de UV-bestraling overdosis zal resulteren in de levensvatbaarheid van de laag cellen. (iv) de lijndikte van de patroon hydrogel mag niet te groot. De nutriënten vervangingsratio in het dikke hydrogels zal anders niet kunnen ter ondersteuning van celproliferatie. Meestal wordt minder dan 300 µm aanbevolen. De afstand tussen twee hydrogel cirkels kan worden gevarieerd, en een taakcyclus van 50% wordt aanbevolen. (v) tijdens het wassen of bijvullen van het kanaal van de stroom met de oplossing, moet de vorming van luchtbellen voorkomen worden. Zachtjes pipetteren de oplossing in de chip kan helpen om luchtbellen te verwijderen.
Het concept van kleurovergang stam gegenereerd door PDMS-vervormd kromming verder kan worden opgewaardeerd tot dynamische kleurovergang stammen toe te passen en kan worden geïntegreerd met de biochemische stimulatie, die vele studies op functionele weefselregeneratie kan profiteren. De eenvoudige fluidic injectie-module met een stekker PDMS kan worden vervangen door een geavanceerde fluidic voor uitgebreide experimentele controle. De PMMA schimmel kan ook worden vervangen door een mal microfabricated SU-8 of een bulk-geëtst siliconen mal.
Deze chip kleurovergang stam met een cirkelvormige cel-beladen hydrogel kan het genereren van statische drukkracht op het 3D hydrogel zonder externe mechanische of elektrische machines. Daarom biedt het een snelle screening-platform voor het onderzoek van de cel gedrag in een reeks stam voorwaarden, zonder het risico van besmetting problemen veroorzaakt door de werking van externe machines. Tijd bestuurde stam stimulatie is echter niet haalbaar omdat het PDMS membraan stammen tot de afbraak van de hydrogel genereert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit project werd ondersteund door de Graduate Student studie in het buitenland programma (NSC-101-2917-I-007-010); het programma van de biomedische ingenieurstechnieken (NSC-101-2221-E-007-032-MY3); en de nanotechnologie nationale programma (NSC-101-2120-M-007-001-), National Science Council van de R.O.C., Taiwan. De auteurs bedank Prof. Ali Khademhosseini, Gulden Camci-Unal, Arghya Paul en Ronglih Liao aan Harvard Medical School voor het delen van de hydrogel en cel inkapseling-technologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL black microcentrifuge tube | Argos Technologies | 03-391-161 | This one can be replaced with a neutral color of 1.5 mL tube covered with aluminun foil |
| 10x DPBS | Sigma-Aldrich | 56064C | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| Calcein | Molecular Probe | C1430 | For labeling viable cells |
| CCD | PCO. Imaging | Pixelfly qe | |
| Cell membrane permeating solution | Sigma-Aldrich | X100 | 0.5% Triton X-100 for permeating cell membrane |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Cell nucleus staining |
| Dialysis membrane | Sigma-Aldrich | D9527 | Molecular weight cut-off = 14,000 |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| Double-side tape | 3M | 8003 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500 | gel strength 300, type A, from porcine skin |
| High frequency electronic corona generator | Electro-technic products | MODEL BD-20 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | |
| Micro syringe | Hamilton | 80501 | 50 μL |
| Microscope | Olympus | IX71 | Include two filter sets: LF405/LP-B-000 and LF488/LP-C-000 from Semrock |
| Oxygen plasma machine | Harrick plasma | PDC-001 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cell |
| PDMS | DOW CORNING | Sylgard 184 | Mixture for PDMS chip cast-molding fabrication |
| Pen-Strep | Gibco | 10378-016 | penicillin/streptomycin |
| Photoinitiator | CIBA | Irgacure 2959 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For labeling dead cells |
| Sterile Filtration cup | Millipore | SCGPT05RE | |
| TMSPMA | Sigma-Aldrich | 440159 | For hydrogel immobilization |
| Ultrasonicator | Delta | D150H | 150W, 43kHz |
| UV light | DAIHAN | WUV-L10 | |
| Freeze Dryer | FIRSTEK | 150311025 | |
| NIH3T3(fibroblast) | Food Industry Research and Development Institute(FIRDI) | 08C0011 | |
| MOXI Z Mini Automated Cell Counter | ORFLO | MXZ001 |
References
- Simmons, C. S., Petzold, B. C., Pruitt, B. L. Microsystems for biomimetic stimulation of cardiac cells. Lab Chip. 12 (18), 3235-3248 (2012).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
- Guan, J., et al. The stimulation of the cardiac differentiation of mesenchymal stem cells in tissue constructs that mimic myocardium structure and biomechanics. Biomaterials. 32 (24), 5568-5580 (2011).
- Wan, C. R., Chung, S., Kamm, R. D. Differentiation of embryonic stem cells into cardiomyocytes in a compliant microfluidic system. Ann Biomed Eng. 39 (6), 1840-1847 (2011).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Li, X., Chu, J. S., Yang, L., Li, S. Anisotropic effects of mechanical strain on neural crest stem cells. Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 598-605 (2012).
- Butcher, J. T., Barrett, B. C., Nerem, R. M. Equibiaxial strain stimulates fibroblastic phenotype shift in smooth muscle cells in an engineered tissue model of the aortic wall. Biomaterials. 27 (30), 5252-5258 (2006).
- Ramon-Azcon, J., et al. Gelatin methacrylate as a promising hydrogel for 3D microscale organization and proliferation of dielectrophoretically patterned cells. Lab Chip. 12 (16), 2959-2969 (2012).
- Park, S. H., Sim, W. Y., Min, B. H., Yang, S. S., Khademhosseini, A., Kaplan, D. L. Chip-Based Comparison of the Osteogenesis of Human Bone Marrow- and Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells under Mechanical Stimulation. PLoS One. 7 (9), e46689 (2012).
- Gould, R. A., et al. Cyclic Strain Anisotropy Regulates Valvular Interstitial Cell Phenotype and Tissue Remodeling in 3D Culture. Acta Biomater. 8 (5), 1710-1719 (2012).
- Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Proc Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stemcells. Natl Acad Sci USA. 103 (44), 16095-16100 (2006).
- Sim, W. Y., Park, S. W., Park, S. H., Min, B. H., Park, S. R., Yang, S. S. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
- Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L.
- Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue Eng Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
- Wan, J. Microfluidic-Based Synthesis of Hydrogel Particles for Cell Microencapsulation and Cell-Based Drug Delivery. Polymers. 4 (2), 1084-1108 (2012).
- Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
- Keung, A. J., Kumar, S., Schaffer, D. V. Presentation Counts: Microenvironmental Regulation of Stem Cells by Biophysical and Material. Cues. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 533-556 (2010).
- Segers, V. F., Lee, R. T. Stem-cell therapy for cardiac disease. Nature. 451 (7181), 937-942 (2008).
- Hsieh, H. Y., et al. Gradient static-strain stimulation in a microfluidic chip for 3D cellular alignment. Lab Chip. 14 (3), 482-493 (2014).
