Summary
Cet article présente une approche simple non continu dégradés souches statiques sur un hydrogel concentrique chargés de cellule pour réguler l’alignement de la cellule pour l’ingénierie tissulaire.
Abstract
Guide artificiel pour alignement cellulaire est un sujet d’actualité dans le domaine de l’ingénierie tissulaire. La plupart de la recherche antérieure a enquêté sur alignement cellulaire induite par la souche unique, sur un hydrogel de cellules chargées en utilisant des procédés expérimentaux complexes et massive, contrôle des systèmes, qui sont généralement associés aux problèmes de contamination. Ainsi, dans cet article, nous proposons une approche simple pour renforcer un gradient allongement statique à l’aide d’une puce fluidique avec un couvercle en plastique de PDMS et un substrat de verre transparent UV pour la stimulation du comportement cellulaire dans un hydrogel en 3D. Prépolymère de cellule photo-en surcharge dans la chambre fluidique peut générer une membrane PDMS courbe convexe sur la couverture. Après réticulation UV, grâce à une composition circulaire concentrique sous la membrane PDMS incurvé et tampon de lavage, un micro-environnement pour cellule chargée de l’enquête comportements sous une variété de souches dégradés est autonome établie sur un seul circuit fluidique, sans instruments externes. Les cellules NIH3T3 ont été démontrées après avoir observé le changement dans la tendance de l’alignement cellulaires sous la direction de géométrie, en collaboration avec stimulation de souche, qui variait de 15 à 65 % sur hydrogels. Après 3 jours d’incubation, la géométrie de l’hydrogel a dominé l’alignement de la cellule sous contrainte de compression faible, où les cellules alignement le long de la direction d’élongation hydrogel sous contrainte de compression élevé. Entre eux, les cellules ont montré alignement aléatoire en raison de la dissipation de l’orientation radicale de l’allongement de l’hydrogel et la direction de la géométrie de l’hydrogel à motifs.
Introduction
Agissant comme un matériel de bloc qui imite un micro-environnement natif, un hydrogel contenant la matrice extracellulaire (ECM) peut reconstruire biomimétique tissu échafaudages pour soutenir la croissance des cellules. Pour posséder les fonctions d’un tissu, alignement de cellule organisée est une condition essentielle. 2D (c'est-à-dire les cellules cultivées sur une surface) et 3D (c.-à-d. les cellules encapsulées dans un hydrogel) divers alignements de cellules ont été obtenues en culture ou d’encapsulation des cellules dans ou sur des substrats flexibles avec micro- ou nano-modèles1. Alignement de cellule 3D en microarchitecture est plus attrayant, car le microenvironnement est plus proche au tissu native construct2,3,4. Une approche courante pour l’alignement de la cellule 3D est le repère géométrique de l’hydrogel forme2,3. En raison de l’espace restreint de la prolifération cellulaire dans la direction de l’axe court, cellules visent à aligner le long de la direction de l’axe dans un hydrogel micro à motifs. Une autre approche consiste à appliquer la traction extensible pour les hydrogels à obtenir un alignement de cellule parallèle à la direction extensibles4,5.
Stimulation biophysique sur ECM hydrogels, comme souche de compression ou un champ électrique, peut réguler les fonctions des cellules pour l’intégration tissulaire adéquate, la prolifération et la différenciation1,2,3. Beaucoup de recherches ont été effectuée pour étudier comportement cellulaire en appliquant une condition de déformation à l’aide de plusieurs unités de contrôle mécanique4,6,7,8,9. Par exemple, l’utilisation des moteurs mécaniques pas pressé ou tendu sur un hydrogel de collagène de cellules encapsulées 3D a été une approche commune7,10. Toutefois, ce dispositif contrôle nécessite plus d’espace et fait face à la question de la contamination dans l’incubateur7,9,11,12. En outre, le grand instrument ne peut pas donner un environnement de contrôle précis pour fournir la reproductibilité élevée13.
Étant donné que chargés de cellule hydrogels travaillent habituellement à l’échelle micro pour des applications biomédicales, il est avantageux de combiner les techniques de MEMS pour générer un ensemble de souche/tronçon stimulation d’étudier simultanément les comportements cellulaires en biomimétique 3D constructions in vitro2,14,15,16,17,18. Par exemple, en utilisant la pression de gaz pour déformer la membrane PDMS de puces microfluidiques peut donner lieu à différentes souches, la différenciation cellulaire au volant de différentes lignées9,16. Cependant, il y a de nombreux défis techniques, tels que les procédés de fabrication de puces compliquée dans une salle blanche et de l’intégration de contrôle de logiciel des moteurs, pompes, vannes et les gaz comprimés.
Dans ce travail, nous démontrons une approche simple pour obtenir une puce microfluidique gradient de déformation statique autosuffisante en employant un modèle hydrogel circulaires concentriques et une membrane souple de PDMS. Contrairement à la plupart des approches existantes, notre plate-forme est un appareil miniature portable et jetable qui peut être fabriqué à l’extérieur de la chambre jaune et qui possède des souches dégradés sur concentriques hydrogels cellule encapsulée, sans équipement mécanique externe au cours de l’incubation de l’auto-production. Comportements de cellules fibroblastes 3 t 3 influencé par une combinaison de forme hydrogel et une variété des repères d’orientation stretch traction ont été démontrées lors de l’observation de l’alignement de la cellule dans des environnements 3D ECM-mimétique à la puce de souche dégradé pendant 3 jours.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pour comparer les variations mécaniques entre chaque hydrogel circulaire dans la puce de stimulation souche gradient dûment rempli, nous avons mesuré la largeur de chaque circulaire hydrogel dans deux des puces mêmes, avec des volumes d’injection 0 µl (Figure 4 a) et 40 µL (Figure 4 b), respectivement. Les allongements pour cent à chaque cercle ont été calculés en divisant les allongements dans la puce 40 µL-injecté par les largeurs de ligne des hydrogels correspondants à la puce de µL-injecté 0 (Figure 4C). L’hydrogel est un matériau incompressible, donc la souche verticale contractante sera équivalente à la souche de l’élongation latéral. Par conséquent, les allongements de pourcentage dans la puce avec le volume d’injection de 40 µL montrent 15-65 % d’allongement, qui peut être converti à la souche de compression (voir supplémentaire 1 fichier).
Une coloration fluorescente des noyaux cellulaires et actine-F avec DAPI et la phalloïdine, respectivement, a été faite pour analyser l’alignement cellulaire. La coloration DAPI a fourni des données sur l’orientation nucléaire, et la coloration de la phalloïdine a été appliquée pour évaluer la propagation de la cellule. Figure 5 a -c indique l’alignement de la cellule dans la puce de gradient de déformation. Dans la ligne 1, les cellules 3 t 3 alignement le long de la direction radiale. Hydrogel 7, les cellules alignement au hasard, en cellules alignement le long de la direction circulaire en ligne 12. Conformément à la fluorescence coloration des images, un changement de 90 ° de l’angle d’alignement de cellules des cellules 3 t 3 dans la ligne 1 (élongation maximale hydrogel dans le sens radial) à l’angle de l’alignement des cellules avec l’alignement de l’axe en ligne 12 (le plus bas hydrogel allongement dans le sens radial) a été découvert.
Dans la précédente recherche2,9, cellules de 200 µm à motif de ligne hydrogels visent à aligner le long de la direction de l’axe de l’hydrogel. Toutefois, dans cette étude, nous avons observé que le tronçon allongé sur les hydrogels de 200 µm dans la direction de l’axe court fourni un autre facteur pour affecter et dominer l’alignement cellulaire en contrôlant le pourcentage de la souche sur l’hydrogel. Pour la souche de 65 % sur la ligne 1, l’alignement radicale s’est avéré que le tronçon de l’élongation de l’hydrogel domine l’alignement de la cellule. Pour la souche de 15 % sur la ligne 12, l’alignement circulaire a prouvé que l’effet axe dominé l’alignement de la cellule. Pour la souche de 40 % sur hydrogel 7, les cellules alignement au hasard en raison de la neutralisation de l’effet de la géométrie d’orientation et de la souche.
Figure 1 . Moule mère PMMA pour feuille de PDMS et fiche Fabrication. (a) les composants sont séparés du moule PMMA, notamment une plaque de fond, trame de limite et canal d’écoulement. Après l’assemblage avec du ruban adhésif double-face, (b) le moule mère PMMA pour la feuille de débit est formé. (c) moule un autre PMMA est assemblé pour les PDMS fiche. Le numéro rouge représente la profondeur. (unité : mm) S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Design de Photomask en plastique pour la composition d’Hydrogel chargés de cellule. Il y a deux ouvertures avec formes triangulaires (2 mm sur la ligne de fond et 6,5 mm de hauteur) connexion aux canaux d’écoulement pour fournir un milieu de culture cellulaire fraîches. (a) le plastique photomasque est étiqueté avec la dimension. La période du cercle concentrique est de 400 nm et le rapport cyclique est de 50 %. Le diamètre du cercle de centre est de 2 mm. (b) la disposition de photomasque, sans étiquettes pour impression laser sur un film plastique transparent. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 3. Des procédés de fabrication du Gradient de souche Hydrogel chargés de cellule dans la Direction radiale dans une puce fluidique de PDMS. (a) un photomasque plastique est aligné et coincé sous la puce avec un canal fluidique enduit de TMSPMA. Une seringue à injection avec solution cellulaire prépolymère est inséré dans la prise de la puce et utilisé pour injecter environ 50 µL pour remplir le canal d’écoulement. (b) la sortie du chenal d’écoulement est fermée avec les PDMS brancher et une supplémentaire de 40 µL de solution cellulaire prépolymère est injecté. Le fond du verre est aux motifs UV pendant 30 s pour fabriquer l’hydrogel circulaire concentrique dans la puce de flux. (c) la pression liquide est libérée dans le chenal d’écoulement en débranchant la prise et le mélange de l’ONU-réticulation est délavé avec le SPD. (d) une puce avec allongement statique de gradient s’applique concentriques hydrogels chargées de cellules qui sont prêts pour la culture cellulaire. Pendant le processus de réticulation UV, est formé (e) à une hauteur non continu dégradée d’hydrogel le long du rayon. (f) après avoir débranché la prise, la membrane PDMS devient plate et s’applique aux stress dégradé les hydrogels cellule encapsulée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 4. Le Gradient d’allongement Hydrogel Pure. La largeur de ligne de l’élongation et le pourcentage d’hydrogel pure sans encapsulation de cellules dans le gradient de souche puce le jour 3 avec (a) 0-µL (groupe témoin) et volumes d’injection 40 µL (b) . (c) le pourcentage d’allongement est calculé en divisant la valeur de la différence de largeur de ligne entre 40 µL et 0 µL par la largeur de la ligne de 40 µL. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 . Fluorescents images actine-noyau tache de la cellules 3 t 3 renfermées dans les Chips dégradé le jour 3. La direction d’alignement de cellule dans la ligne 1 (a-c) , (d-f) lignes 7 et (g-i) 12 révèlent l’alignement radial, alignement aléatoire et alignement circulaire, respectivement. Les couleurs vertes et bleues indiquent les taches de l’actine et noyau, respectivement. La ligne blanche en pointillés correspond à la limite de l’hydrogel. Echelle : 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Supplémentaire Figure 1. Calcul de la courbure en forme de dôme PDMS. H (x) : la courbe convexe PDMS ; H0 : la différence de hauteur entre le dôme PDMS avant et après déformation ; r : le rayon de la coupole ; V : le volume d’injection excessive de la région de bleu, ce qui provoque la déformation de PDMS comme un dôme. Voir 1 de fichier supplémentaire pour plus de détails. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
Fichier complémentaire 1. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dans cet article, nous présentons une approche simple de comparer le comportement de l’alignement de cellule après orientation forme hydrogel et stretch traction. Une membrane souple de PDMS crée une courbe en forme de dôme pour générer les différentes hauteurs des hydrogels circulaires concentriques. Après avoir relâché la pression, la membrane PDMS applique automatiquement la force pour les hydrogels micro à motifs pour former la souche dégradé/allongement, avec un maximum au centre et au moins à la limite extérieure. Étant donné que la formation de la souche gradient vise par la membrane souple de PDMS et la manipulation de la puce fluidique, il y a plusieurs paramètres importants qu’il faut : (i) un contrôle précis de l’épaisseur de la PDMS membrane est crucial pour régler la valeur du gradient de déformation. Si la membrane est trop épaisse, même le volume d’injection maximale du prépolymère de cellule ne sera pas en mesure de générer une bonne courbe convexe dans la membrane PDMS pour une hauteur gradient d’hydrogels de cellules chargées de réticulation. En revanche, une membrane PDMS trop mince ne peut s’appliquer suffisamment de force pour les hydrogels. Veuillez vérifier que le poids du PDMS non polymérisée dans le moule de la couverture PDMS est environ 1,6 à 2,0 g / puce. (ii) prévention de la contamination est très importante lors de la manipulation de la liaison croisée de l’hydrogel chargés de cellule dans la puce fluidique. Avant cellule mise en culture dans un incubateur, soigneusement laver avec du PBS stérile dans le chenal fluidique et à l’aide de 75 % éthanol pour essuyer la surface de la puce peut permettre d’éviter le problème de la contamination. (iii) la concentration de photo-initiateur et la dose d’exposition aux rayons UV doivent être soigneusement contrôlé et dans la gamme des ~0.1% - 2 % (0,5 % est recommandé). Over-réticulation l’hydrogel et un surdosage de l’irradiation UV se traduira par la viabilité cellulaire faible. (iv) la largeur de la ligne de l’hydrogel à motifs ne devrait pas être trop grande. Dans le cas contraire, le taux de remplacement des éléments nutritifs dans les hydrogels épais ne sera pas en mesure de soutenir la prolifération cellulaire. En général, inférieure à 300 µm est recommandé. L’espacement entre les deux cercles d’hydrogel peut être variée, et un cycle de 50 % est recommandé. (v) tout en lavant ou recharger le canal d’écoulement avec la solution, la formation de bulles doit être évitée. Pipetage doucement la solution dans la puce peut aider à enlever les bulles.
La notion de gradient souche générée par courbure PDMS déformée peut être perfectionnée à l’application des souches gradients dynamiques et peut être intégrée avec stimulation biochimique, qui peut bénéficier de nombreuses études sur la régénération des tissus fonctionnels. Le module d’injection fluidique simple avec un bouchon PDMS peut être remplacé par n’importe quel système fluidique avancé pour contrôle expérimental étendu. Le moule PMMA peut également être remplacé par une moisissure microfabriques SU-8 ou un moule silicone gravé en vrac.
Cette puce de souche dégradé avec un hydrogel circulaire chargées de cellule peut générer une force de compression statique sur l’hydrogel 3D sans les machines mécaniques ou électriques externes. Par conséquent, il fournit une plate-forme de dépistage rapide pour enquêter sur les comportements de cellule dans une série de conditions de déformation, sans risque de problèmes de contamination causée par l’exploitation des machines externes. Toutefois, la stimulation de temporisation, la souche n’est pas réalisable étant donné que la membrane PDMS génère des souches jusqu'à la dégradation de l’hydrogel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce projet a été soutenu par la Graduate Student étude à l’étranger programme (NSC-101-2917-I-007-010) ; le programme de génie biomédical (NSC-101-2221-E-007-032-MY3) ; et le Programme National de nanotechnologie (NSC-101-2120-M-007-001-), Conseil National des sciences de la République de Chine, Taïwan. Les auteurs tiens à remercier le professeur Ali Khademhosseini, Gulden Cantin-Unal, Arghya Paul et Ronglih Liao à la Harvard Medical School pour le partage de la technologie d’encapsulation hydrogel et cellulaire.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL black microcentrifuge tube | Argos Technologies | 03-391-161 | This one can be replaced with a neutral color of 1.5 mL tube covered with aluminun foil |
| 10x DPBS | Sigma-Aldrich | 56064C | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| Calcein | Molecular Probe | C1430 | For labeling viable cells |
| CCD | PCO. Imaging | Pixelfly qe | |
| Cell membrane permeating solution | Sigma-Aldrich | X100 | 0.5% Triton X-100 for permeating cell membrane |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Cell nucleus staining |
| Dialysis membrane | Sigma-Aldrich | D9527 | Molecular weight cut-off = 14,000 |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| Double-side tape | 3M | 8003 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500 | gel strength 300, type A, from porcine skin |
| High frequency electronic corona generator | Electro-technic products | MODEL BD-20 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | |
| Micro syringe | Hamilton | 80501 | 50 μL |
| Microscope | Olympus | IX71 | Include two filter sets: LF405/LP-B-000 and LF488/LP-C-000 from Semrock |
| Oxygen plasma machine | Harrick plasma | PDC-001 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cell |
| PDMS | DOW CORNING | Sylgard 184 | Mixture for PDMS chip cast-molding fabrication |
| Pen-Strep | Gibco | 10378-016 | penicillin/streptomycin |
| Photoinitiator | CIBA | Irgacure 2959 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For labeling dead cells |
| Sterile Filtration cup | Millipore | SCGPT05RE | |
| TMSPMA | Sigma-Aldrich | 440159 | For hydrogel immobilization |
| Ultrasonicator | Delta | D150H | 150W, 43kHz |
| UV light | DAIHAN | WUV-L10 | |
| Freeze Dryer | FIRSTEK | 150311025 | |
| NIH3T3(fibroblast) | Food Industry Research and Development Institute(FIRDI) | 08C0011 | |
| MOXI Z Mini Automated Cell Counter | ORFLO | MXZ001 |
References
- Simmons, C. S., Petzold, B. C., Pruitt, B. L. Microsystems for biomimetic stimulation of cardiac cells. Lab Chip. 12 (18), 3235-3248 (2012).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
- Guan, J., et al. The stimulation of the cardiac differentiation of mesenchymal stem cells in tissue constructs that mimic myocardium structure and biomechanics. Biomaterials. 32 (24), 5568-5580 (2011).
- Wan, C. R., Chung, S., Kamm, R. D. Differentiation of embryonic stem cells into cardiomyocytes in a compliant microfluidic system. Ann Biomed Eng. 39 (6), 1840-1847 (2011).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Li, X., Chu, J. S., Yang, L., Li, S. Anisotropic effects of mechanical strain on neural crest stem cells. Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 598-605 (2012).
- Butcher, J. T., Barrett, B. C., Nerem, R. M. Equibiaxial strain stimulates fibroblastic phenotype shift in smooth muscle cells in an engineered tissue model of the aortic wall. Biomaterials. 27 (30), 5252-5258 (2006).
- Ramon-Azcon, J., et al. Gelatin methacrylate as a promising hydrogel for 3D microscale organization and proliferation of dielectrophoretically patterned cells. Lab Chip. 12 (16), 2959-2969 (2012).
- Park, S. H., Sim, W. Y., Min, B. H., Yang, S. S., Khademhosseini, A., Kaplan, D. L. Chip-Based Comparison of the Osteogenesis of Human Bone Marrow- and Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells under Mechanical Stimulation. PLoS One. 7 (9), e46689 (2012).
- Gould, R. A., et al. Cyclic Strain Anisotropy Regulates Valvular Interstitial Cell Phenotype and Tissue Remodeling in 3D Culture. Acta Biomater. 8 (5), 1710-1719 (2012).
- Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Proc Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stemcells. Natl Acad Sci USA. 103 (44), 16095-16100 (2006).
- Sim, W. Y., Park, S. W., Park, S. H., Min, B. H., Park, S. R., Yang, S. S. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
- Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L.
- Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue Eng Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
- Wan, J. Microfluidic-Based Synthesis of Hydrogel Particles for Cell Microencapsulation and Cell-Based Drug Delivery. Polymers. 4 (2), 1084-1108 (2012).
- Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
- Keung, A. J., Kumar, S., Schaffer, D. V. Presentation Counts: Microenvironmental Regulation of Stem Cells by Biophysical and Material. Cues. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 533-556 (2010).
- Segers, V. F., Lee, R. T. Stem-cell therapy for cardiac disease. Nature. 451 (7181), 937-942 (2008).
- Hsieh, H. Y., et al. Gradient static-strain stimulation in a microfluidic chip for 3D cellular alignment. Lab Chip. 14 (3), 482-493 (2014).
