Summary
Bu makalede sürekli sigara degrade statik suşlar doku mühendisliği için hücre hizalama düzenleyen konsantrik bir hücre yüklü hidrojel Tarih sağlamak için basit bir yaklaşım sunar.
Introduction
Yerel bir microenvironment taklit eden bir blok malzeme olarak hizmet veren, hücre dışı Matriks (ECM) içeren bir hidrojel yeniden hücre büyümesini desteklemek için biomimetic doku iskele inşa edebilirsiniz. Bir doku fonksiyonları sahip olmak, organize hücre hizalama temel bir gereksinimdir. Çeşitli (Yani, bir yüzeye kültürlü hücreleri) 2D ve 3D (Yani, bir hidrojel kapsüllenmiş hücreleri) kültür veya hücreleri veya mikro esnek yüzeyler üzerinde Kapsüllenen tarafından elde hücre hizalamaları-ya da nano kalıpları1. Microenvironment yerel doku yapısı2,3,4' e daha yakın olduğu gibi 3D hücre hizalama mikro mimarisi içinde daha çekicidir. 3D hücre hizalama için bir ortak yaklaşım hidrojel şekil2,3geometrik işaretimiz. Nedeniyle kısıtlı alan kısa eksenli yönde hücre çoğalması için hücreleri mikro desenli hidrojel uzun ekseni yönünde boyunca Hizala hedefliyoruz. Çekme dayanımı streç hücre hizalama streç yön4,5' e paralel elde etmek için hydrogels uygulamak için başka bir yaklaşımdır.
Biyofiziksel stimülasyon basınç zorlanma gibi ECM hydrogels üzerinde veya bir elektrik alanı, hücre fonksiyonları için uygun doku Tümleştirme, yayılması ve farklılaşma1,2,3düzenleyen. Hücresel davranış birden çok mekanik denetim birimleri4,6,7,8,9kullanarak bir defada bir yük durumu uygulayarak araştırmak için çok araştırma yapılmıştır. Örneğin, mekanik adım motorlar kullanımı sıkılmış veya 3D cep kapsüllenmiş kollajen hidrojel üzerinde gerilmiş ortak bir yaklaşım7,10oldu. Ancak, bu tür kontrol araçlar ilave alanı gerektirir ve kirlenme kuluçka makinesi7,9,11,12sorunu karşı karşıya. Buna ek olarak, büyük araç yüksek tekrarlanabilirlik13sağlamak için bir hassas kontrol ortamı veremem.
Hücre yüklü hydrogels genellikle Biyomedikal uygulamalar için mikro ölçekte istihdam edilmektedir göz önüne alındığında, MEMS teknikleri zorlanma/streç stimülasyon aynı anda 3D biomimetic yapıları vitro2,14,15,16,17,18cep davranışları araştırmak için bir dizi oluşturmak için birleştirmek için avantajlıdır. Örneğin, gaz basıncı PDMS membran mikrosıvısal fiş deforme kullanarak çeşitli suşları, hücre farklılaşması farklı soy9,16' sürüş için çıkmasına neden olabilir. Ancak, karmaşık çip üretim süreçlerinde bir temiz oda ve yazılım denetim Tümleştirme motor, pompa, vanalar ve sıkıştırılmış gazlar gibi pek çok teknik sorun vardır.
Bu çalışmada, biz kendi kendini idame ettiren bir degrade statik yük mikrosıvısal çip bir eş merkezli dairesel hidrojel desen ve esnek bir PDMS membran istihdam ederek elde etmek için basit bir yaklaşım göstermek. Varolan yaklaşımlar en aksine, bizim bu sarı odanın dışında sahte olduğu ve kuluçka sırasında dış mekanik aletler olmadan konsantrik hücre kapsüllü hydrogels üzerinde gradyan suşları kendini üreten sahip bir taşınabilir ve tek kullanımlık minyatür aygıt platformudur. Çekme dayanımı streç rehberlik ipuçları çeşitli degrade zorlanma yongası 3D ECM mimetic ortamlar içinde hücre hizalama 3 gün boyunca gözlem sırasında gösterdi ve 3T3 fibroblast hücre davranışları hidrojel şekil kombinasyonu tarafından etkiledi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mekanik varyasyonları arasında tamamlanan degrade zorlanma stimülasyon yongası dairesel her hidrojel karşılaştırmak için iki enjeksiyon miktarlar 0 µL (şekil 4a) ve 40 µL (şekil 4b) ile aynı fiş dairesel her hidrojel çizgi genişlikleri sırasıyla şiddetindeydi. Her daire, yüzde elongations karşılık gelen hydrogels 0 µL enjekte yongası (şekil 4 c) çizgi genişlikleri 40 µL enjekte yongası elongations bölünerek hesaplanır. Dikey sözleşme zorlanma yanal uzama zorlanma için eşdeğer olur, böylece hidrojel incompressible bir malzeme var. Bu nedenle, basınç zorlanma için dönüştürülebilir 15-%65 uzama yongası 40-µL enjeksiyon hacmi yüzde elongations göster (bkz. ek dosya 1).
Floresan hücre çekirdeği ve F-aktin DAPI ve phalloidin, sırasıyla, boyama hücresel hizalama analiz etmek için yapıldı. Veri üzerinde nükleer yönlendirme sağlanan DAPI boyama ve phalloidin boyama hücre yayılan değerlendirmek için uygulanır. Şekil 5a -c hücre hizalama degrade zorlanma yongasında gösterir. Hat 1, 3T3 hücreler Radyal yönde uyumlu. Hidrojel 7, hücrelerin rasgele hizaladım ve line 12 dairesel yönde boyunca hücreleri uyumlu. Resim Boyama floresan uygun olarak, hat 1 (Radyal yönde en fazla hidrojel uzama) 3T3 hücrelerde hücre hizalamasını açısı 90 ° vardiya uzun eksen hizalama 12 (en düşük fiyat hidrojel uzama Radyal yönde) doğrultusunda hücrelerle hizalama açısı için keşfedilmiştir.
Önceki araştırma2,9' da 200 µm çizgi desenli hydrogels hücrelerde hidrojel uzun eksen yönünü Hizala hedefliyoruz. Ancak, bu çalışmada, kısa-ekseni yönünde 200 µm hydrogels üzerinde uzun streç başka bir faktör etkiler ve hücre hizalama hidrojel üzerinde yük yüzdesini denetleyerek hakim için sağlanan görülmektedir. Hat %1 65 strain için radikal hizalama hidrojel uzama streç hücre hizalama hakim oldu. Line %12 15 strain için dairesel hizalama uzun eksen etkisi hücre hizalama hakim oldu. Hidrojel %7 40 strain için hücreleri rastgele geometri rehberlik ve zorlanma etkisini nötralize nedeniyle hizalı.
Resim 1 . PMMA anne kalıp PDMS levha ve fiş imalat için. (a) alt plaka, sınır çerçeve ve akışı kanal gibi PMMA kalıp ayrı bileşenleri. Çift taraflı bant ile derleme sonra (b) PMMA anne kalıp akış tablosu için oluşturulur. (c) PDMS fiş için başka bir PMMA kalıp monte edilir. Kırmızı derinliği temsil eder. (birim: mm) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Plastik Photomask tasarım için hücre yüklü hidrojel Micropattern. Üçgen şekiller (2 mm alt satırında ve 6.5 mm içinde yükseklik) ile iki açıklıklar vardır taze hücre kültür ortamı sağlamak için akış kanala bağlanma. (a) plastik photomask boyut ile etiketlenir. Eşmerkezli daire 400 dönemidir nm, iş hacmi ise % 50. Orta daireyi çapı 2 mm. olduğunu (b) photomask düzen etiketleri lazer baskı plastik şeffaf film almak için olmadan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. İmalat süreçleri geçişin zorlanma hücre yüklü hidrojel Radyal yönde boyunca PDMS sıvı yongasında. (a) bir plastik photomask uyumlu ve TMSPMA kaplı bir sıvı kanalı ile belgili tanımlık küçük parça altında sıkışmış. Bir mikro şırınga prepolimer hücre çözümü çip giriş eklenen ve akışı kanal doldurmak için yaklaşık 50 µL enjekte için kullanılan. (b) akışı kanal çıkış ile kapalı PDMS takın ve prepolimer hücre çözümü bir ek 40 µL enjekte edilir. UV-30 için desenli cam alt s eş merkezli dairesel hidrojel akışı yongası imal etmek. (c) çıkış çıkararak sıvı basıncı akışı kanalda yayınlandı ve BM-crosslinking karışımı DPBS ile yıkanır. (d) bir çip statik degrade zorlanma ile hücre kültürü çalışmalarının için hazır konsantrik hücre yüklü hydrogels geçerlidir. (E) hidrojel yarıçapı boyunca sürekli olmayan bir degrade yüksekliğini UV crosslinking işlemi sırasında oluşur. (f) sonra çıkış prizden, PDMS membran düz olur ve degrade stres hücre kapsüllü hydrogels geçerlidir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Saf hidrojel uzama degrade. Uzama çizgi genişliği ve hücre kapsülleme degradedeki olmadan saf hidrojel yüzdesi çipte 3. gün (a) 0-µL ile (kontrol grubu) ve (b) 40-µL enjeksiyon birimleri süzüyorlar. (c) uzama yüzde 40 µL ve 0 µL arasındaki çizgi genişliği fark değerini satır genişliği 40 µL. tarafından bölünerek hesaplanır Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 . Floresan aktin-çekirdek leke görüntülerini 3T3 hücreleri Encapsulated degrade fiş gün 3. (A-c) çizgi 1, (d-f) satır 7 ve (g-ı) line 12 hücre hizalama yönde ortaya Radyal hizalama, rasgele hizalama ve dairesel hizalama, anılan sıraya göre. Yeşil ve mavi renkler aktin ve çekirdek lekeleri, sırasıyla gösterir. Noktalı beyaz çizgi hidrojel sınırlarını temsil eder. Ölçek çubuğu: 200 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ek resim 1. Hesaplama kubbe seklinde PDMS kavisi. F: dışbükey PDMS eğrisi; H0: öncesi ve sonrası deformasyon PDMS kubbe arasındaki maksimum yükseklik farkı; r: kubbe yarıçapı; V: aşırı enjeksiyon hacmi bir kubbe gibi PDMS deformasyona neden olur mavi bölge. Ayrıntılı bilgi için bkz: ek dosya 1 . Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.
Ek dosya 1. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda, hücre hizalama davranışını hidrojel şekil rehberlik ve gerilme streç sonra karşılaştırmak için basit bir yaklaşım üzerinde rapor. Esnek PDMS membran konsantrik dairesel hydrogels farklı yükseklikte üretmek için bir kubbe seklinde eğrilik oluşturur. Basınç bırakmadan sonra PDMS membran degrade zorlanma/uzama, en merkezi ve en azından dış sınır oluşturmak için mikro-desenli hydrogels için kuvvet otomatik olarak uygular. Degrade zorlanma oluşumu esnek PDMS membran ve sıvı çip işlenmesi tarafından tasarlandığı gibi katıldı bazı önemli parametreler bulunur: (i) PDMS kalınlığı hassas kontrol membran degrade zorlanma değeri ayarlamak önemlidir. Membran çok kalın ise, hücre prepolymer bile en fazla enjeksiyon hacmi PDMS membran çapraz hücre yüklü hydrogels degrade yüksekliğini için uygun bir dışbükey eğri oluşturmak mümkün olmayacaktır. Buna ek olarak, bir çok ince PDMS membran hydrogels için yeterli kuvvet uygulayamazsınız. İyileşmemiş PDMS PDMS kapak kalıp içinde ağırlığı yaklaşık 1.6 2.0 g çipi başına olup olmadığını kontrol edin. (ii) kirlilik önleme sıvı yongası hücre yüklü hidrojel crosslink işlenmesi sırasında çok önemlidir. Kuluçka makinesine kültür, iyice akışkan kanaldaki sterilize PBS ile yıkama ve % 75 kullanarak hücre önce çip yüzeyini silmek için etanol kirlilik sorunu önlemek için yardımcı olabilir. (III) photoinitiator konsantrasyonu ve UV Işınlarına maruz kalma doz dikkatli olmalıdır kontrollü ve aralıktaki (% 0.5 önerilir) ~0.1% - %2. Bitti-crosslinking hidrojel ve UV ışınlama doz aşımı düşük hücre canlılığı içinde sonuçlanacaktır. (iv çizgi genişliğini desenli hidrojel çok büyük olmamalıdır. Aksi takdirde, kalın hydrogels besin değiştirme ücretine hücre çoğalması desteklemek mümkün olmayacaktır. Genellikle, daha az 300 µm önerilir. İki hidrojel daire arasındaki boşluğu değiştirilebilir ve % 50 iş hacmi önerilir. (v) yıkama veya çözüm ile akışı kanal dolumu, kabarcık oluşumu kaçınılmalıdır. Yavaşça çip çözümde pipetting kabarcıklar kaldırmak için yardımcı olabilir.
Degrade zorlanma PDMS deforme eğriliği tarafından oluşturulan dinamik degrade suşları uygulamak için daha fazla yükseltilebilir ve fonksiyonel doku rejenerasyonu üzerine birçok çalışma yararlanabilir biyokimyasal stimülasyon ile entegre. Basit sıvı enjeksiyon modülü bir PDMS fiş ile genişletilmiş deneysel kontrol için herhangi bir gelişmiş sıvı sistemi tarafından değiştirilebilir. PMMA kalıp da bir microfabricated SU-8 kalıp veya bir toplu kazınmış silikon kalıp tarafından değiştirilebilir.
Bu degrade zorlanma çip ile dairesel bir hücre yüklü hidrojel dış mekanik veya elektrikli makineler olmadan 3D hidrojel statik basınç gücü oluşturabilir. Bu nedenle, bu hücre davranışları dış makineleri işlemi tarafından neden olduğu kirlilik sorunları riski olmadan zorlanma koşulları bir dizi araştırma için bir hızlı tarama platformu sağlar. Ancak, PDMS membran suşları hidrojel bozulması kadar oluşturduğu için zaman kontrollü zorlanma stimülasyon ulaşılabilir değildir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu proje Lisansüstü Öğrenci Çalışma yurtdışında Program (NSC-101-2917-I-007-010 tarafından) destek verdi; Biyomedikal Mühendisliği programı (NSC-101-2221-E-007-032-MY3); ve nanoteknoloji Ulusal Program (NSC-101-2120-M-007-001-), R.O.C., Tayvan Ulusal Bilim Konseyi. Yazarlar Prof. Ali Khademhosseini, gülden Camci-Ünal, Arghya Paul ve Ronglih Liao, Harvard Tıp Okulu hidrojel ve hücre kapsülleme teknoloji paylaşımı için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL black microcentrifuge tube | Argos Technologies | 03-391-161 | This one can be replaced with a neutral color of 1.5 mL tube covered with aluminun foil |
| 10x DPBS | Sigma-Aldrich | 56064C | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| Calcein | Molecular Probe | C1430 | For labeling viable cells |
| CCD | PCO. Imaging | Pixelfly qe | |
| Cell membrane permeating solution | Sigma-Aldrich | X100 | 0.5% Triton X-100 for permeating cell membrane |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Cell nucleus staining |
| Dialysis membrane | Sigma-Aldrich | D9527 | Molecular weight cut-off = 14,000 |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| Double-side tape | 3M | 8003 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500 | gel strength 300, type A, from porcine skin |
| High frequency electronic corona generator | Electro-technic products | MODEL BD-20 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | |
| Micro syringe | Hamilton | 80501 | 50 μL |
| Microscope | Olympus | IX71 | Include two filter sets: LF405/LP-B-000 and LF488/LP-C-000 from Semrock |
| Oxygen plasma machine | Harrick plasma | PDC-001 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cell |
| PDMS | DOW CORNING | Sylgard 184 | Mixture for PDMS chip cast-molding fabrication |
| Pen-Strep | Gibco | 10378-016 | penicillin/streptomycin |
| Photoinitiator | CIBA | Irgacure 2959 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For labeling dead cells |
| Sterile Filtration cup | Millipore | SCGPT05RE | |
| TMSPMA | Sigma-Aldrich | 440159 | For hydrogel immobilization |
| Ultrasonicator | Delta | D150H | 150W, 43kHz |
| UV light | DAIHAN | WUV-L10 | |
| Freeze Dryer | FIRSTEK | 150311025 | |
| NIH3T3(fibroblast) | Food Industry Research and Development Institute(FIRDI) | 08C0011 | |
| MOXI Z Mini Automated Cell Counter | ORFLO | MXZ001 |
References
- Simmons, C. S., Petzold, B. C., Pruitt, B. L. Microsystems for biomimetic stimulation of cardiac cells. Lab Chip. 12 (18), 3235-3248 (2012).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
- Guan, J., et al. The stimulation of the cardiac differentiation of mesenchymal stem cells in tissue constructs that mimic myocardium structure and biomechanics. Biomaterials. 32 (24), 5568-5580 (2011).
- Wan, C. R., Chung, S., Kamm, R. D. Differentiation of embryonic stem cells into cardiomyocytes in a compliant microfluidic system. Ann Biomed Eng. 39 (6), 1840-1847 (2011).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Li, X., Chu, J. S., Yang, L., Li, S. Anisotropic effects of mechanical strain on neural crest stem cells. Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 598-605 (2012).
- Butcher, J. T., Barrett, B. C., Nerem, R. M. Equibiaxial strain stimulates fibroblastic phenotype shift in smooth muscle cells in an engineered tissue model of the aortic wall. Biomaterials. 27 (30), 5252-5258 (2006).
- Ramon-Azcon, J., et al. Gelatin methacrylate as a promising hydrogel for 3D microscale organization and proliferation of dielectrophoretically patterned cells. Lab Chip. 12 (16), 2959-2969 (2012).
- Park, S. H., Sim, W. Y., Min, B. H., Yang, S. S., Khademhosseini, A., Kaplan, D. L. Chip-Based Comparison of the Osteogenesis of Human Bone Marrow- and Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells under Mechanical Stimulation. PLoS One. 7 (9), e46689 (2012).
- Gould, R. A., et al. Cyclic Strain Anisotropy Regulates Valvular Interstitial Cell Phenotype and Tissue Remodeling in 3D Culture. Acta Biomater. 8 (5), 1710-1719 (2012).
- Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Proc Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stemcells. Natl Acad Sci USA. 103 (44), 16095-16100 (2006).
- Sim, W. Y., Park, S. W., Park, S. H., Min, B. H., Park, S. R., Yang, S. S. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
- Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L.
- Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue Eng Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
- Wan, J. Microfluidic-Based Synthesis of Hydrogel Particles for Cell Microencapsulation and Cell-Based Drug Delivery. Polymers. 4 (2), 1084-1108 (2012).
- Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
- Keung, A. J., Kumar, S., Schaffer, D. V. Presentation Counts: Microenvironmental Regulation of Stem Cells by Biophysical and Material. Cues. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 533-556 (2010).
- Segers, V. F., Lee, R. T. Stem-cell therapy for cardiac disease. Nature. 451 (7181), 937-942 (2008).
- Hsieh, H. Y., et al. Gradient static-strain stimulation in a microfluidic chip for 3D cellular alignment. Lab Chip. 14 (3), 482-493 (2014).
