Summary
이 문서는 조직 공학에 대 한 셀 정렬을 조절 하는 동심 셀-라덴 히드로에 연속 되지 않은 그라데이션 정적 긴장을 제공 하는 간단한 방법을 소개 합니다.
Abstract
세포 정렬에 대 한 인공 지침 조직 공학의 분야에서 뜨거운 주제입니다. 이전 연구의 대부분 복잡 한 실험 프로세스 및 대량 시스템 제어는 일반적으로 관련 된 오염 문제를 사용 하 여 셀 라덴 히드로에 단일 스트레인 유발 세포 맞춤을 조사 했다. 따라서,이 문서에서 3 차원 하이드로 겔에 세포 행동의 자극에 대 한 플라스틱 PDMS 커버와 UV 투명 유리 기판 유체 칩을 사용 하 여 그라데이션 정적 스트레인을 구축 하는 간단한 방법 제안 한다. 유체 챔버에 오버 로딩 사진 patternable 셀 prepolymer 표지에 볼록한 곡선된 PDMS 멤브레인을 생성할 수 있습니다. 자외선 가교 후 곡선된 PDMS 막 및 버퍼, 조사 셀 microenvironment 동심 원형 micropattern를 통해 다양 한 그라데이션 긴장 아래 행동은 외부 기기 없이 단일 유체 칩에 자체 설립. NIH3T3 세포 형상 지도 아래, 협력 hydrogels 15-65%에서 다양 한 긴장 자극 세포 맞춤 트렌드의 변화를 관찰 한 후 증명 했다. 3 일 배양 후 히드로 형상 낮은 압축 변형, 셀 정렬 셀 높은 압축 변형 히드로 신장 방향을 따라 정렬 지배. 이들, 사이 셀 하이드로 겔 신장 패턴화 된 하이드로 겔의 형상 지도의 급진적인 지침의 소산 인 임의의 맞춤을 보였다.
Introduction
네이티브 microenvironment을 블록 자료로 제공, 세포 외 기질 (ECM)를 포함 하는 하이드로 겔 세포 성장을 지원 하기 위해 생체 모방 조직 건설 기계를 다시 구축할 수 있습니다. 조직 기능을 소유 하기 위하여 조직 된 셀 정렬 필수 요건 이다. 다양 한 2D (즉, 세포 표면에 경작) 및 차원 (즉, 셀에는 히드로) 셀 정렬 배양 하거나 캡슐화 셀 또는 마이크로 유연한 기판에 의해 달성 되었습니다-또는 나노 패턴1. 3 차원 셀 맞춤 마이크로아키텍처에는 microenvironment는 기본 조직 구조2,,34에 가까운 더 매력적 이다. 1 개의 일반적인 방법은 3D 셀 맞춤 히드로 모양2,3의 기하학적 큐입니다. 짧은 축 방향으로 셀 확산에 대 한 제한 된 공간 때문에 셀 마이크로 패턴 히드로에서 긴 축 방향을 따라 정렬 하고자 합니다. 또 다른 방법은 셀 맞춤 스트레칭 방향4,5에 평행을 달성 하기 위해 hydrogels 인장 스트레치를 적용할 것입니다.
압축 변형 등 ECM hydrogels에 생물 자극 또는 전기 필드를 적절 한 조직 통합, 확산 및 감 별 법1,2,3에 대 한 셀 함수를 조절할 수 있습니다. 많은 연구가 여러 기계적 제어 단위4,6,7,,89를 사용 하 여 한 번에 하나의 긴장 상태를 적용 하 여 세포 행동을 조사 하는 일 하고있다. 예를 들어 기계적 단계 모터를 사용 하 여 압착 또는 공통 접근7,10되었습니다 3D 셀 캡슐화 콜라겐 하이드로 겔에 뻗어. 그러나, 이러한 제어 장비 추가 공간이 필요 하 고 인큐베이터7,9,,1112에 오염 문제를 직면. 또한, 큰 악기는 정밀 하 게 제어 환경을 제공 하는 높은 재현성13을 드릴 수 없습니다.
셀-라덴 hydrogels 생물 의학 응용 프로그램에 대 한 마이크로 스케일에 일반적으로 고용 되어 고려 하 고, 동시에 3D biomimetic 구문을 생체 외에서2,14,15,,1617,18에 셀 행동을 조사 하기 위해 스트레인/스트레칭 자극의 범위를 생성 하는 MEMS 기술을 결합 하 여 유리 하다. 예를 들어 다른 계보9,16에 세포 분화를 유도 하는 다양 한 긴장을 증가 줄 수 있습니다 가스 압력을 사용 하 여 미세 칩에서 PDMS 막 변형. 그러나, 복잡 한 칩 제조 프로세스 클린 룸 및 모터, 펌프, 밸브, 압축된 가스의 소프트웨어 제어 통합 등 많은 기술적인 도전이 있다.
이 작품에서 동심 원형 히드로 패턴 그리고 유연한 PDMS 멤브레인을 채용 하 여 자립 그라데이션 정적 스트레인 미세 칩을 얻기 위해 간단한 방법을 보여 줍니다. 기존 접근법의 대부분과 달리 우리의 플랫폼은 휴대용 및 처분할 수 있는 소형 장치 그 자체는 인큐베이션 기간 동안 외부 기계 장비 없이 동심의 세포 캡슐화 hydrogels에 그라데이션 긴장 생성 보유 하 고 있는 노란 방 밖에 서 날조 될 수 있다. 3T3 fibroblast 세포 행동 히드로 모양의 조합에 의해 영향을 하 고 인장 스트레칭 지도 신호의 다양 한 일 동안 그라데이션 변형 칩에서 3D ECM 모방 환경에서 셀 정렬의 관찰 동안 시연 했다.
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Representative Results
완성 된 그라데이션 변형 자극 칩에서 각 원형 히드로 사이 기계적인 유사 비교를 우리가 주입 양의 0 µ L (그림 4a)와 40 µ L (그림 4b), 같은 칩의 두 각 원형 하이드로 겔의 선 폭 각각 측정. 각 원형에 백분율 elongations 0 µ L 주입 칩 (그림 4c)에서 해당 hydrogels의 선 폭 40 µ L 주입 칩에서 elongations 나누어 계산 했다. 히드로 비압축 소재 이므로 수직 계약 부담 측면 신장 긴장에 해당 될 것입니다. 따라서, 40 µ L 주입 량과 칩에 백분율 elongations 15-65% 신장, 압축 변형으로 변환 될 수 있는 표시 ( 보충 파일 1참조).
각각, 세포 핵 및 F-말라 DAPI와 phalloidin, 형광 얼룩 세포 맞춤 분석 이루어졌다. 핵 방향에 데이터를 제공 하는 DAPI 얼룩 그리고 셀 확산을 평가에 적용 된 phalloidin 얼룩. 그림 5a -c 그라데이션 변형 칩에서 셀 맞춤을 보여 줍니다. 1 호선, 3T3 세포 반지름 방향에 따라 정렬. 하이드로 겔 7에 셀 무작위로, 정렬 하 고 셀 라인 12 원형 방향을 따라 정렬 합니다. 이미지를 얼룩이 지기 형광에 선 12 (최저 히드로 신장 레이디얼 방향에서)에서 긴 축 정렬 셀의 정렬 각도를 줄 1 (반지름 방향에서 최대 히드로 신장) 3T3 세포의 셀 정렬의 각도에서 90 ° 변화 발견 되었다.
이전 연구2,9, 셀 라인 꽃무늬 hydrogels 200 µ m에에서는 히드로의 긴 축 방향을 따라 정렬 하고자 합니다. 그러나,이 연구에서 우리 짧은 축 방향으로 200 µ m hydrogels에 길쭉한 스트레칭 또 다른 요소에 영향을 하 고는 히드로에 긴장의 비율을 조절 하 여 세포 정렬 지배 제공 관찰. 라인 1에 65% 부담에 대 한 급진적인 맞춤은 히드로의 신장 스트레치 셀 정렬 지배 입증 했다. 15%에 긴장 라인 12에 대 한 원형 맞춤 긴 축 효과 셀 정렬 지배 입증 했다. 히드로 7에 40% 부담, 셀 정렬 임의로 형상 지도 스트레인 효과의 무력화 때문.
그림 1 . PDMS 시트 및 플러그 제조 PMMA 어머니 형. (a)는 분리 된 구성 요소는 바닥판, 경계 프레임, 그리고 흐름 채널을 포함 하 여 PMMA 형의. 더블 양면 테이프와 조립 후 (b) 흐름 시트 PMMA 어머니 형 형성 됩니다. (c)는 PDMS 플러그에 대 한 또 다른 PMMA 금형 조립 된다. 빨간색 숫자는 깊이 나타냅니다. (단위: mm) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 셀-라덴 히드로 Micropattern에 대 한 플라스틱 포토 마스크 디자인. 삼각형 모양 (2 mm 결론에, 높이 6.5 m m)와 두 개의 구멍을 있다 신선한 세포 배양 공급 흐름 채널에 연결. (a) 플라스틱 포토 마스크 표시 됩니다 차원에서. 동심 서클의 기간은 400 nm, 듀티 사이클은 50%. 센터 서클의 직경은 2 m m. (b) 플라스틱 투명 필름에 레이저 인쇄 레이블 없이 포토 마스크 레이아웃. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3. 그라데이션 제작 공정 PDMS 유체 칩에 방사형 방향 따라 셀 라덴 히드로 스트레인. (a) 플라스틱 포토 마스크 정렬 이며 TMSPMA 코팅 유체 채널 칩 아래 붙어. 중합체 셀 솔루션 마이크로 주사기에 칩의 삽입 이며 흐름 채널을 채우기 위해 약 50 µ L를 주사 하는 데 사용. (b) 흐름 채널의 출구로 폐쇄는 PDMS 연결 하 고 중합체 세포 솔루션의 추가 40 µ L 주입. 유리 바닥은 30에 대 한 UV 꽃무늬 흐름 칩에 동심 원형 하이드로 겔을 조작 하는 s. 액체 압력은 발표 흐름 채널에 콘센트를 분리 하 여 (c) 와 유엔-가교 혼합물 DPBS와 씻. (d) 칩에 정적 그라데이션 변형 세포 배양에 대 한 준비가 동심 셀-라덴 hydrogels 적용 됩니다. 자외선 가교 과정 (e) 반경에 따라 하이드로 겔의 연속 되지 않은 그라데이션 높이 형성 된다. (f) 후 콘센트 뽑기, PDMS 막 평면 되 고 세포 캡슐화 hydrogels에 그라데이션 스트레스를 적용 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4. 순수 하이드로 겔 신장 그라데이션. 신장 선 너비와 셀에서에서 캡슐화 없이 순수 하이드로 겔의 백분율은 (는) 0 µ L와 함께 하루 3에 칩 (제어 그룹) 및 (b) 40 µ L 주입 볼륨 스트레인. (c) 신장 백분율은 선 두께 40 µ L.에 의해 선 폭 차이 40 µ L 0 µ L의 값을 나누어 계산 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . 3 일에 그라데이션 칩에서 3T3 세포 캡슐화의 형광 걸 핵 얼룩 이미지. 1 호선 (-c) , (d-f) 7, 선과 (g-i) 선 12 셀 정렬 방향을 공개 방사형 정렬, 임의의 정렬 및 원형 맞춤, 각각. 녹색 및 파랑 색상 각각 말라와 핵 얼룩을 보여줍니다. 점선된 흰색 라인은 하이드로 겔의 경계를 나타냅니다. 눈금 막대: 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1. 돔 모양의 PDMS 곡률의 계산. H(x): 볼록 PDMS 곡선; H0: 최대 높이 차이 PDMS 돔 전후 변형; r: 반지름 돔; 된 돔으로 PDMS 변형 하면 파란 지역의 과다 주입 볼륨. 자세한 내용은 보충 파일 1 을 참조 하십시오. 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보조 파일 1. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 논문에서 우리 히드로 모양 지도 인장 스트레치 후 셀 정렬 동작을 비교 하는 간단한 방법에 보고 합니다. 유연한 PDMS 막 동심 원형 hydrogels의 다른 고도 생성 하기 위한 돔 모양의 곡률을 만듭니다. 압력을 해제 한 후 PDMS 막 자동으로 그라데이션 변형/신장, 센터에서 최대와 최소 바깥 경계에 형성에 마이크로 패턴 hydrogels에 강제 적용 됩니다. 에 참석 해야 합니다 몇 가지 중요 한 매개 변수는 그라데이션 긴장의 형성 유연한 PDMS 막과 유체 칩의 처리에 의해 설계: (i)는 PDMS의 두께의 정확한 제어 막이 그라데이션 변형 값을 조정 하는 중요 한. 막 너무 두꺼운 경우 셀 prepolymer의 최대 사출 볼륨도 가교 셀 라덴 hydrogels의 그라데이션 높이 대 한 PDMS 막에서 적절 한 볼록한 곡선을 생성할 수 없습니다. 반면, 너무 얇은 PDMS 막은 hydrogels에 충분 한 힘을 적용할 수 없습니다. PDMS 커버 금형에서 uncured PDMS의 무게는 칩 당 약 1.6-2.0 g을 확인 하시기 바랍니다. (2) 오염 방지 유체 칩에 셀-라덴 히드로 crosslink 처리 하는 동안 매우 중요 하다. 인큐베이터에서 배양, 철저 하 게 유체 채널에서 소독된 PBS로 세척 하 고 75%를 사용 하 여 셀 전에 에탄올 칩의 표면을 닦아 오염 문제를 피하기 위해 도울 수 있다. (iii) photoinitiator의 농도 UV 노출의 복용량은 조심 한다 통제 및 범위 ~0.1%-2% (0.5% 권장). 오버-가교는 하이드로 겔 고 UV 방사선 도달 했 나 봐 낮은 세포 생존 능력에 발생 합니다. (패턴화 된 하이드로 겔의 선 폭 iv)는 너무 커서 해서는 안됩니다. 그렇지 않으면, 두꺼운 hydrogels에 영양 보충 속도 지원 세포 증식 수 없습니다. 일반적으로, 보다 적은 300 µ m 것이 좋습니다. 두 개의 히드로 동그라미 사이의 간격, 다양 하 고 50% 듀티 사이클 것이 좋습니다. (v) 동안 세척 또는 채우는 솔루션 흐름 채널, 거품 형성을 피해 야 한다. 부드럽게 칩에서 솔루션 pipetting 거품을 제거 시킬 수 있습니다.
그라데이션 변형 PDMS 변형 곡률에 의해 생성 된의 개념 더 업그레이드할 수 동적 그라데이션 긴장을 적용 하 고 기능 조직 재생에 대 한 많은 연구에 혜택을 받을 수 있는 생 화 확 적인 자극으로 통합 될 수 있다. PDMS 플러그와 간단한 유체 주입 모듈 확장된 실험 제어에 대 한 어떤 고급 유체 시스템으로 교체할 수 있습니다. PMMA 금형 ﹙ SU-8 형 또는 대량 에칭 실리콘 몰드로 교체할 수 있습니다.
원형 셀-라덴 히드로와 그라데이션 변형 칩이 외부 기계 또는 전기 기계 없이 3D 히드로에 정적 압축 힘을 생성할 수 있습니다. 따라서, 그것은 일련의 외부 컴퓨터의 작동에 의해 발생 하는 오염 문제의 위험 없이 변형 조건에 셀 행동 조사에 대 한 빠른 심사 플랫폼을 제공 합니다. 그러나 PDMS 막은 히드로의 저하까지 긴장을 생성 하기 때문에, 시간 제어 긴장 자극 달성 되지 않습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 프로젝트 지원으로 대학원 학생 연구 해외 프로그램 (NSC-101-2917-I-007-010); 공학 프로그램 (NSC-101-2221-E-007-032-MY3); 그리고 나노기술 국가 프로그램 (NSC-101-2120-M-007-001-), R.O.C., 대만의 국가 과학 위원회. 저자는 교수 알리 Khademhosseini, 네델란드의 화 Camci-Unal, 대단하다 폴, 및 하버드의과 대학에서 Ronglih 리아 하이드로 겔 및 셀 캡슐화 기술을 공유 하기 위한 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL black microcentrifuge tube | Argos Technologies | 03-391-161 | This one can be replaced with a neutral color of 1.5 mL tube covered with aluminun foil |
| 10x DPBS | Sigma-Aldrich | 56064C | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| Calcein | Molecular Probe | C1430 | For labeling viable cells |
| CCD | PCO. Imaging | Pixelfly qe | |
| Cell membrane permeating solution | Sigma-Aldrich | X100 | 0.5% Triton X-100 for permeating cell membrane |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Cell nucleus staining |
| Dialysis membrane | Sigma-Aldrich | D9527 | Molecular weight cut-off = 14,000 |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| Double-side tape | 3M | 8003 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500 | gel strength 300, type A, from porcine skin |
| High frequency electronic corona generator | Electro-technic products | MODEL BD-20 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | |
| Micro syringe | Hamilton | 80501 | 50 μL |
| Microscope | Olympus | IX71 | Include two filter sets: LF405/LP-B-000 and LF488/LP-C-000 from Semrock |
| Oxygen plasma machine | Harrick plasma | PDC-001 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cell |
| PDMS | DOW CORNING | Sylgard 184 | Mixture for PDMS chip cast-molding fabrication |
| Pen-Strep | Gibco | 10378-016 | penicillin/streptomycin |
| Photoinitiator | CIBA | Irgacure 2959 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For labeling dead cells |
| Sterile Filtration cup | Millipore | SCGPT05RE | |
| TMSPMA | Sigma-Aldrich | 440159 | For hydrogel immobilization |
| Ultrasonicator | Delta | D150H | 150W, 43kHz |
| UV light | DAIHAN | WUV-L10 | |
| Freeze Dryer | FIRSTEK | 150311025 | |
| NIH3T3(fibroblast) | Food Industry Research and Development Institute(FIRDI) | 08C0011 | |
| MOXI Z Mini Automated Cell Counter | ORFLO | MXZ001 |
References
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