Summary
这篇文章介绍了一个简单的方法,对提供非连续梯度静态菌株对同心单元格拉丹水凝胶来调节单元格对齐方式为组织工程。
Abstract
人工指导细胞对齐方式是在组织工程领域的热点话题。大部分的先前的研究已经进行单个单元格拉丹的水凝胶应变诱导细胞对准使用复杂的实验过程和质量控制系统,这是通常与污染问题。因此,在本文中,我们提出一种构建流控芯片用塑料的聚二甲基硅氧烷盖和紫外透明的玻璃基板,刺激的 3D 水凝胶的细胞行为的静态应变梯度的简单方法。超载的照片; 细胞预聚物中射流室可以生成凸曲线的 PDMS 膜在封面上。紫外光交联后通过弯曲的聚二甲基硅氧烷膜和缓冲区洗,调查细胞微环境下的同心圆形优缺点行为下个变种的梯度是自建在单一的流控芯片,没有外部文书。观察到的几何在指导下,在合作与应变刺激,相差 15-65%的水凝胶细胞对齐趋势变化后论证了 NIH3T3 细胞。后 3 天孵化,水凝胶几何主导下低的压应变,单元格对齐方式哪里细胞沿水凝胶伸长率高的压缩应变下的方向排列。这些,之间细胞细胞随机对齐方式由于耗散的激进指导的水凝胶伸长和图案的水凝胶的几何指导。
Introduction
作为模仿一个本机的微环境块材料,含细胞外基质 (ECM) 水凝胶可以重新生成仿生支架支持细胞的生长。拥有组织的职能,组织单元格对齐方式是一项基本要求。各种 (即,细胞表面) 2D 和 3D (即,封装在水凝胶的细胞) 培养或封装细胞中或与微型柔性衬底上取得了单元格对齐方式-或纳米模式1。在微体系结构的三维单元格对齐方式是更有吸引力,因为微环境是更接近于自然组织构造2,,34。三维单元格对齐方式的一个常用方法是水凝胶形状2,3的几何提示。由于细胞增殖在短轴方向的受限空间,细胞目的沿微图案的水凝胶的长轴方向对齐。另一种方法是适用于凝胶来实现单元格对齐方式平行于拉伸方向4,5拉抻。
生物物理刺激对 ECM 的水凝胶,如压缩应变或电场的作用,能调节细胞功能的适当组织一体化、 增殖和分化1,,23。很多研究已经通过使用多个机械控制单位4,6,7,,89一次应用一个应变条件探讨细胞行为。例如,机械步进电动机使用挤压或拉伸对 3D 封装细胞胶原凝胶一直共同的办法7,10。然而,这种控制的设备需要额外空间并面临孵化器7,9,,1112中受污染的问题。此外,大型仪器不能精确的控制环境,以提供高重复性13。
考虑到单元格拉丹水凝胶通常受雇在微尺度生物医学应用,它有利于结合 MEMS 技术来生成一个范围的应变/拉伸刺激同时探讨细胞行为在 3D 仿生构造体外2,14,15,16,,1718。例如,利用气体压力变形聚二甲基硅氧烷膜在微流控芯片可以引起不同品系,开车去不同的谱系9,16细胞分化。然而,有许多技术难题,如在一个干净的房间和软件控制集成的电机、 泵、 阀门和压缩的气体的复杂的芯片制造工艺。
在这项工作,我们演示了一个简单的方法来获得自我维持的梯度静态应变微流控芯片采用同心圆形水凝胶模式和灵活的 PDMS 膜。不同于大多数现有的方法,我们的平台是便携式和一次性使用的微型设备,可以制作黄色房间外面并拥有自生梯度菌株对同心细胞封装水凝胶,无需外部机械设备孵化期间。3T3 成纤维细胞细胞行为受水凝胶形状组合和期间的观察 3 天内 3D ECM 拟态环境梯度应变片在单元格对齐方式显示出各种拉伸弹力的指导线索。
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Representative Results
若要比较每个循环的水凝胶在完成的应变梯度刺激芯片之间的机械变化,我们分别测量中的两个相同的芯片,具有 0 微升 (图 4a) 注射量和 40 µ L (图 4b),每个循环水凝胶的线条宽度。%伸长率每个圆圈都伸长 40 µ L 注射芯片中的除以相应的水凝胶在 0 微升注射芯片 (图 4 c) 的线宽。水凝胶是一种不可压缩的材料,所以垂直订约应变将相当于横向伸长应变。因此,芯片与 40 µ L 注射量的百分比理论伸长值的修正显示 15 65%伸长,可以转换为压缩应变 (见补充文件 1)。
荧光染色细胞核和 F-肌动蛋白与 DAPI 和鬼笔,分别进行了分析的细胞的对齐方式。DAPI 染色提供了关于核定位数据和鬼笔染色用于评估细胞传播。图 5a-c显示单元格对齐方式中梯度应变片。在第 1 行,3T3 细胞沿径向方向排列。在凝胶 7,细胞随机,对齐和单元格对齐沿圆周方向在第 12 行。根据荧光染色图像,发现了带长轴对齐 (水凝胶最低伸长率在径向方向) 12 行中的单元格的对齐方式角度 90 ° 转向视角下的单元格对齐方式的 3T3 细胞 (伸长率最高的水凝胶在径向方向) 1 号线。
在以前研究2,9,在 200-µ m 线图案水凝胶的细胞目的对齐沿长轴方向的水凝胶。然而,在这个研究中,我们观察到 200 微米水凝胶在短轴方向拉长伸展动作所产生的影响和支配的细胞的对齐方式通过控制应变对水凝胶的百分比的另一个因素。1 号线 65%应变,激进的对齐方式证明水凝胶伸长拉伸占主导地位的单元格对齐方式。对于 15%应变第 12 行,圆对齐方式证明了长轴效应占主导地位的单元格对齐方式。水凝胶 7 40%应变,细胞随机排列由于中立化几何指导和应变效应。
图 1.聚二甲基硅氧烷薄板和插头制作 PMMA 母亲模具。(a)分离的组分的 PMMA 模具,包括底板、 边框架和流道。装配后用双面胶带,形成了(b)流量表 PMMA 母亲模具。(c)另一个 PMMA 模具组装而成的聚二甲基硅氧烷堵塞。红色数字表示深度。(单位: mm)请点击这里查看此图的大版本。
图 2.单元格拉丹水凝胶优缺点塑料光掩模设计。有两个开口三角形形状 (2 毫米在底线和高度 6.5 毫米) 连接到流渠道供应新鲜细胞培养基。(a)塑料光掩模标记与维度。同心圆段是 400 毫微米和占空比是 50%。中心圆的直径为 2 毫米 (b)光掩模布局,没有塑料的透明薄膜激光打印的标签。请点击这里查看此图的大版本。
图 3。制造工艺的渐变应变沿径向方向的单元格拉丹水凝胶在 PDMS 流控芯片。(a)塑料光掩膜与对齐,并根据芯片在一起,TMSPMA 涂覆的流体通道。与预聚体的细胞液微注射器是插入到芯片的入口和用于注入约 50 µ L 填补流通道。(b)流道出口关闭与 PDMS 插头和注入额外 40 µ L 的预聚体的细胞液。玻璃底部是 UV 图案为 30 s 制作同心圆形水凝胶流芯片中的。(c)液体的压力被释放在流道中拔出插座和联合国交联混合物被淘汰掉的新方案。(d)与静态应变梯度的芯片适用准备细胞培养的同心单元格拉丹的水凝胶。在紫外交联过程中,形成了(e)水凝胶沿半径非连续梯度高度。(f) 后拔出插座,PDMS 膜变得平坦和梯度压力对细胞封装的水凝胶。请点击这里查看此图的大版本。
图 4。纯净水凝胶伸长率梯度。伸长的线宽和无细胞封装在渐变中的纯净水凝胶的百分比应变芯片第 3 天与(a) 0 微升 (对照组) 和(b) 40 µ L 注射量。(c)除以 40 µ L 的线宽线宽度差 40 µ L 和 0 µ L 之间的值计算得出伸长率是请点击这里查看此图的大版本。
图 5.荧光的肌动蛋白核染色图像的 3T3 细胞中天 3 上的梯度芯片的封装。单元格对齐方向(g-i)第 12 行,第 1 行(c) 、 (d f)一行 7 人,揭示径向对齐、 随机对齐和圆形的对齐方式,分别。绿色和蓝色颜色分别显示肌动蛋白和核的污渍。白色虚线表示水凝胶的边界。条码秤: 200 µ m.请点击这里查看此图的大版本。
补充的图 1。的圆顶状的聚二甲基硅氧烷曲率计算。H(x): 凸的聚二甲基硅氧烷曲线;H0: 聚二甲基硅氧烷圆顶变形; 前后最大高度差异: 半径圆顶;五: 蓝色的区域,这将导致一个圆顶的聚二甲基硅氧烷变形过度的注射量。有关详细信息请参阅补充文件 1 。请点击这里下载此图。
补充文件 1。请点击这里下载此文件。
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Discussion
在本文中,我们报告一个简单的方法来比较水凝胶形状指导和拉伸拉伸后的单元格对齐方式行为。灵活的 PDMS 膜创建用于生成不同高度的同心圆形水凝胶圆顶形的曲率。后释放压力,PDMS 膜自动适用力于微图案水凝胶形成梯度应变延伸,与中心的最大值和最小值外, 边界处。应变梯度的形成由灵活的 PDMS 膜和处理的流控芯片设计的正应参加的几个重要参数: (i) 精确控制厚度的聚二甲基硅氧烷膜是关键要调整应变梯度值。如果膜太厚,甚至最大注射量的细胞预聚体不能在单元格拉丹水凝胶梯度高度交联的聚二甲基硅氧烷膜中生成适当的凸曲线。相比之下,太薄的聚二甲基硅氧烷膜,不能适用水凝胶的足够的力量。请检查未硫化聚二甲基硅氧烷 PDMS 盖模具的重量是大约 1.6-2.0 g 每个芯片。(在流控芯片单元格拉丹水凝胶交联处理期间,ii) 污染防治是非常重要的。在细胞培养中孵化器、 彻底与流体通道中无菌的 PBS 洗涤和使用 75%乙醇擦拭表面的芯片可以帮助避免污染问题。(iii) 光引发剂浓度及紫外线照射的剂量必须小心控制并在范围内的 ~0.1%-2%(推荐 0.5%)。在交联水凝胶和吸食了过量的紫外线照射会导致低细胞活力。(iv) 图案的水凝胶线宽度不应太大。否则,在厚厚的水凝胶中的养分替代率不能够支持细胞增殖。通常,建议使用小于 300 µ m。水凝胶的两个圆之间的间距也可多种多样,并建议 50%工作周期。(v) 在洗涤或加气流道的解决方案时,应避免泡沫的形成。轻轻地吹打在芯片解决方案可以有助于消除气泡。
梯度应变产生的聚二甲基硅氧烷变形曲率的概念可以进一步升级到应用动态梯度菌株,可以结合生化刺激,功能性组织再生的许多研究都可以受惠。简单的流体注入模块与 PDMS 插头可以由任何先进的射流扩展实验控制系统取代。PMMA 模具也可以超微型苏 8 模具或批量蚀刻硅模具所取代。
这个梯度应变片圆形细胞满载水凝胶可以生成静态的压缩力,在没有外部机械或电气机器的 3D 水凝胶。因此,它为研究细胞行为的一系列的应变条件,而没有风险的外部机器操作引起的污染问题提供快速筛选平台。然而,时间控制应变刺激不是可以实现的因为 PDMS 膜生成株直到退化的水凝胶。
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Disclosures
作者没有透露。
Acknowledgments
这个项目被支持由研究生学生研究国外程序 (NSC-101-2917-I-007-010);生物医学工程项目 (NSC-101-2221-E-007-032-MY3);和纳米技术国家计划 (NSC-101-2120-M-007-001-) 的侨生,台湾国家科学委员会。作者想要感谢阿里 Khademhosseini,荷兰货币恰姆彻纳尔,阿格保罗教授和哈佛大学医学院嵘利廖分享的水凝胶和单元格的封装技术。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL black microcentrifuge tube | Argos Technologies | 03-391-161 | This one can be replaced with a neutral color of 1.5 mL tube covered with aluminun foil |
10x DPBS | Sigma-Aldrich | 56064C | |
Alexa Fluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
BSA | Sigma | A1595 | |
Calcein | Molecular Probe | C1430 | For labeling viable cells |
CCD | PCO. Imaging | Pixelfly qe | |
Cell membrane permeating solution | Sigma-Aldrich | X100 | 0.5% Triton X-100 for permeating cell membrane |
DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Cell nucleus staining |
Dialysis membrane | Sigma-Aldrich | D9527 | Molecular weight cut-off = 14,000 |
DMEM | Gibco | 11995-065 | |
Double-side tape | 3M | 8003 | |
FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500 | gel strength 300, type A, from porcine skin |
High frequency electronic corona generator | Electro-technic products | MODEL BD-20 | |
Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | |
Micro syringe | Hamilton | 80501 | 50 μL |
Microscope | Olympus | IX71 | Include two filter sets: LF405/LP-B-000 and LF488/LP-C-000 from Semrock |
Oxygen plasma machine | Harrick plasma | PDC-001 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cell |
PDMS | DOW CORNING | Sylgard 184 | Mixture for PDMS chip cast-molding fabrication |
Pen-Strep | Gibco | 10378-016 | penicillin/streptomycin |
Photoinitiator | CIBA | Irgacure 2959 | |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For labeling dead cells |
Sterile Filtration cup | Millipore | SCGPT05RE | |
TMSPMA | Sigma-Aldrich | 440159 | For hydrogel immobilization |
Ultrasonicator | Delta | D150H | 150W, 43kHz |
UV light | DAIHAN | WUV-L10 | |
Freeze Dryer | FIRSTEK | 150311025 | |
NIH3T3(fibroblast) | Food Industry Research and Development Institute(FIRDI) | 08C0011 | |
MOXI Z Mini Automated Cell Counter | ORFLO | MXZ001 |
References
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