方法文章

用于刺激载细胞水凝胶中细胞行为的梯度应变芯片

7.6K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/53715

⸱

2017年8月8日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of NanoEngineering and MicroSystems, National Tsing Hua University, 2Department of Engineering and System, National Tsing Hua University

本文内容

摘要

本文介绍了一种简单的方法，可在含细胞的同心水凝胶上施加非连续梯度静态应变，以调控组织工程中的细胞取向。

摘要

细胞排列的人工引导是组织工程领域的一个研究热点。以往大多数研究采用复杂的实验流程和大量控制系统，通过单轴应变诱导负载细胞的水凝胶中细胞的排列，但这些方法通常存在污染问题。因此，本文提出一种简单的方法，利用带有塑料PDMS盖层和紫外透明玻璃基底的微流控芯片，在三维水凝胶中构建梯度静态应变，以调控细胞行为。在微流控腔室内过量加载可光图案化的细胞预聚物，可在盖层上形成凸面曲率的PDMS膜。经过紫外交联后，结合曲面PDMS膜下方的同心圆微图案以及缓冲液清洗，在单个微流控芯片内即可自发建立一个用于研究多种梯度应变下细胞行为的微环境，无需依赖外部仪器。通过观察NIH3T3细胞在几何引导与应变刺激协同作用下的排列趋势变化（水凝胶上的应变范围为15–65%），验证了该方法的有效性。经过3天培养后发现，在低压缩应变条件下，水凝胶的几何形貌主导细胞排列方向；而在高压缩应变条件下，细胞沿水凝胶伸长方向排列。在这两种情况之间，由于水凝胶伸长方向的径向引导作用与图案化水凝胶的几何引导作用相互抵消，细胞呈现随机排列状态。

引言

水凝胶作为一种模拟天然微环境的块体材料，可含有细胞外基质（ECM），用于重建支持细胞生长的仿生组织支架。要实现组织功能，有序的细胞排列是基本要求。通过在具有微米或纳米结构的柔性基底上培养或包埋细胞，已在二维（即细胞在表面培养）和三维（即细胞包埋于水凝胶中）条件下实现了多种细胞排列方式1。其中，微结构中的三维细胞排列更具吸引力，因其微环境更接近天然组织构造2,3,4。实现三维细胞排列的一种常用方法是利用水凝胶形状提供的几何引导信号2,3。由于细胞在短轴方向上的增殖空间受限，细胞倾向于沿微图案化水凝胶的长轴方向排列。另一种方法是对水凝胶施加拉伸应力，使细胞沿拉伸方向平行排列4,5。

在细胞外基质水凝胶上施加生物物理刺激（如压缩应变或电场），可调节细胞功能，促进组织的适当整合、增殖和分化1,2,3。已有大量研究通过使用多个机械控制装置，每次施加一种应变条件来探究细胞行为4,6,7,8,9。例如，利用机械步进电机对包埋细胞的三维胶原蛋白水凝胶进行挤压或拉伸是一种常见方法7,10。然而，此类控制设备需要额外空间，并且存在在培养箱中引发污染的风险7,9,11,12。此外，大型仪器难以提供精确的控制环境，从而影响实验的高重复性13。

考虑到含细胞水凝胶通常在微米尺度上用于生物医学应用，将MEMS技术与之结合，可在体外同时对三维仿生结构中的细胞行为施加多种应变/拉伸刺激进行研究，具有显著优势in vitro2,14,15,16,17,18。例如，利用气体压力使微流控芯片中的PDMS膜发生形变，可产生不同的应变，从而诱导细胞向不同谱系分化9,16。然而，该方法仍存在诸多技术挑战，例如在洁净室中进行芯片制备过程复杂，以及电机、泵、阀门和压缩气体的软件控制集成困难等问题。

本研究展示了一种简单的方法，通过采用同心圆状水凝胶图案和柔性聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜，制备出自维持梯度静态应变的微流控芯片。与大多数现有方法不同，该平台是一种便携式、一次性微型装置，可在黄光洁净室以外的环境中制备，并在培养过程中无需外部机械设备即可在包埋细胞的同心圆水凝胶中自动生成梯度应变。在为期3天的观察中，展示了在梯度应变芯片的三维细胞外基质模拟环境中，3T3成纤维细胞行为受水凝胶形状与多种拉伸引导信号共同影响下的细胞取向排列情况。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. GelMA 的合成

  1. 称取10 g明胶粉末，加入含有100 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）的玻璃烧瓶中。将磁力搅拌子放入烧瓶，并将烧瓶置于磁力搅拌加热板上。
  2. 用铝箔覆盖烧瓶以防止水分蒸发。将加热板温度设定为50–60 °C，搅拌速度设为100 rpm，持续搅拌1小时，使明胶粉末充分溶解。
  3. 明胶完全溶解后，使用移液器极其缓慢地（每秒一滴）加入8 mL甲基丙烯酸酐。在60 °C下反应3小时。
  4. 向烧瓶中加入预热的DPBS（40 °C），调节终体积至500 mL，并继续搅拌15分钟，以充分混合并终止反应。
  5. 同时，将透析膜（截留分子量14 kDa）剪成若干段，每段长25 cm。将其浸入去离子水（DI水）中15分钟，并打结封闭透析管的一端。
  6. 将适量（30–60 mL）聚合物溶液装入透析管中，封闭另一端。将透析管放入盛有去离子水的5 L塑料烧杯中，透析一周。每天更换去离子水两次，并在透析过程中维持溶液温度在40–50 °C。
  7. 将透析后的溶液从透析管中收集至500 mL玻璃瓶中。取约450–500 mL溶液加入500 mL滤杯（孔径0.22 µm），对滤杯施加真空压力，使溶液通过滤膜以实现无菌过滤。
  8. 将无菌过滤后的聚合物溶液分装至多个50 mL无菌离心管中，于-80 °C超低温冰箱中保存3–5天。
  9. 将-80 °C保存的聚合物使用冷冻干燥机冻干1周，得到GelMA。将制备好的GelMA储存于-80 °C超低温冰箱中。

2. 3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯（TMSPMA）修饰

  1.  将商用载玻片切割成两小块（25 mm × 37.5 mm），浸入0.5 M NaOH溶液中4小时。用大量去离子水清洗载玻片。
  2. 将载玻片置于玻璃容器内的95%乙醇中，并将其放置在超声波清洗器中，于43 kHz下清洗15分钟。取出后自然晾干。
  3. 将载玻片浸入含5% TMSPMA的99.5%乙醇溶液中，反应1小时。
  4. 用95%乙醇清洗载玻片，晾干后在80 °C烘箱中退火2小时，以固化TMSPMA涂层。

3. 芯片制备

  1. 取一块2 mm厚和一块0.3 mm厚的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）板，将双面胶带贴在PMMA板的一面，并揭去其中一侧的离型纸。保留两块2 mm厚的PMMA板和一块1 mm厚的PMMA板不贴双面胶带。
  2. 将未贴双面胶带的2 mm厚PMMA板用激光切割成42 mm × 30 mm，作为底板。将贴有双面胶带的2 mm厚PMMA板切割成边界框架，外尺寸为42 mm × 30 mm，内尺寸为37.5 mm × 25 mm。
  3. 将贴有双面胶带的0.3 mm厚PMMA板激光切割成一个直径为12 mm的中心圆，在圆的两侧相对位置分别设有宽2 mm、长8 mm的两个流道（图1a）。
  4. 为制备用于浇铸PDMS盖板的PMMA模具，使用双面胶带将步骤3.2–3.3中的三个PMMA部件组装在一起（图1b）。
  5. 将贴有双面胶带的2 mm厚PMMA板激光切割成5 cm × 5 cm的片材，其上具有3 × 3排列的8.5 mm × 8.5 mm的空心矩形。另将一块5 cm × 5 cm的片材切割成3 × 3排列的直径为4 mm的空心圆。将未贴双面胶带的1 mm厚PMMA板激光切割成5 cm × 5 cm的PMMA底板。
  6. 通过使用双面胶带组装步骤3.5中的三个PMMA部件，制备用于浇铸PDMS塞的PMMA模具（图1c）。
  7. 将30 g PDMS弹性体与3 g PDMS固化剂按比例充分混合，然后在真空腔中脱气1 h，以制备PDMS盖板和PDMS塞。
  8. 将1.8–2.0 g上述混合物浇注入PDMS盖板用PMMA模具中，并用适量混合物填充PDMS塞用PMMA模具的每个腔室。另将10 g未固化的PDMS混合物浇注到一个空白的10 cm塑料板中。将这些模具置于真空腔中脱气30 min。
  9. 在80 °C下固化PDMS 2 h。待固化后的PDMS在模具上冷却后，将其从PMMA模具中剥离，得到PDMS盖板和PDMS塞。
  10. 在PDMS盖板流道两端打两个直径约为3 mm的孔。
  11. 将从10 cm塑料板上成型的PDMS片材切成多个1 cm × 1 cm的立方体，并在每个PDMS立方体上打一个直径为3 mm的孔。将两个未固化的1 cm × 1 cm PDMS立方体贴附在PDMS盖板的开口处（作为培养基储液池，并有助于梯度环形水凝胶结构的固化过程），然后在80 °C下固化1 h。
  12. 将带有两个PDMS储液池的PDMS盖板与TMSPMA涂层载玻片进行键合：预先将PDMS盖板的键合面和TMSPMA涂层载玻片置于氧气等离子体处理仪（30 W射频功率（高模式）、600 mTorr压缩空气）或高频电子电晕发生器（115 V，50/60 Hz，0.35 A）中进行90 s的O2等离子体处理。
  13. 使经等离子体处理的PDMS盖板表面与TMSPMA载玻片接触，并紧密压合，通过形成Si-O-Si键实现永久性键合。
    注意：将芯片置于80 °C烘箱中加热1 h可进一步增强键合强度。
  14. 冷却后，将芯片浸入95%乙醇中15 min，随后自然晾干。接着在紫外线下照射灭菌1 h，并将其存放在超净工作台中用铝箔包裹的盒子内。

4. 细胞负载水凝胶的静态梯度应变

  1. 打印并裁剪一张尺寸为 25 mm × 37.5 mm 的光刻掩模，通过打印布局图案来完成 图2b 在透明薄膜上。调整打印尺寸以 图2b 以匹配尺寸 图 2a.
  2. 在37 °C水浴中准备含10% FBS、1%青霉素-链霉素和250 mL DPBS的100 mL DMEM培养基，用作细胞培养基。
  3. 称取25 mg冻干GelMA，加入含有0.3 mL预热（37 °C）细胞培养基的1.5 mL黑色微量离心管中。将微量离心管置于实验室搅拌器/加热板上，直至GelMA完全溶解于培养基中。
  4. 将50 mg光引发剂称量至微量离心管中，加入1 ml DPBS，置于80 °C烘箱中加热15 min，或直至光引发剂完全溶解。
  5. 取25 µL步骤4.4中的10%光引发剂，加入步骤4.3的微量离心管中。用移液器反复吹打数次以充分混匀。
  6. 计数 3 x 106 使用自动细胞计数器对NIH 3T3细胞进行计数。将细胞悬液在200 × g离心5分钟，弃去上清液，再用175 µL细胞培养基重悬细胞。
  7. 将步骤4.6中的细胞溶液加入步骤4.5的微量离心管中，得到含有5% GelMA、0.5%光引发剂和约6 × 10⁶个细胞/mL的预聚物细胞溶液6 3T3 细胞/mL。混匀后，取 100 µL 细胞预聚物加入 100 µL 微量注射器中。
  8. 手动对齐（参见 图3a将光刻掩模的一片放置在无菌梯度应变芯片的底片上，并用一滴去离子水将其位置固定。将装有预聚物细胞溶液的100 µL微注射器连接到芯片的入口。
  9. 放置（参见 图3b使用微量注射器将50 µL预聚物细胞溶液注入流道中，然后用PDMS塞子封闭出口。再注入额外40 µL溶液，使圆形PDMS膜形成凸起的弧面。
  10. 将芯片连同第4.9步中的光掩模（底部）、微注射器（入口）和PDMS塞子（出口）一起移至紫外灯（365 nm，9 mW/cm²）下2）并在流体室中将其暴露于30至45秒以交联同心环形水凝胶。
  11. 移除PDMS塞子和微型注射器以释放液体压力（参见 图3c使用预热的DPBS填充1 mL注射器，从入口到出口冲洗3次，以洗去未交联的树脂。
  12. 用约 100 µL 细胞培养基填充流道。
  13. 将芯片置于无菌培养皿中，并在5% CO₂条件下培养2 在37 °C条件下培养一周，每天更换培养基。
  14. 在孵育4小时后的第0天取三个芯片作为对照组，第3天取三个芯片作为实验组，使用20倍物镜的显微镜拍摄图像。利用软件测量每条水凝胶从第1线到第12线的线宽例如， ImageJ）来计算压缩应变（ 图4).
    注：伸长率的计算方法是将40 µL与0 µL时的线宽差值除以40 µL时的线宽。

5. 用于取向分析的细胞染色

  1. 使用注射器将室温下的 4% 多聚甲醛（PFA）DPBS 溶液注入流控芯片中，持续 15 分钟，以固定含细胞的水凝胶。
    注意：PFA 具有毒性，操作时需谨慎。
  2. 用含 0.5% 细胞膜通透剂的 DPBS 溶液替换原有溶液，在室温下孵育 10 分钟，以通透细胞膜。
  3. 用 PBS 洗涤样品 3 次，每次洗涤间隔 5 至 10 分钟（使用已装液的注射器，如步骤 5.1 所述）。
  4. 将 1% BSA 溶液通过进样口用注射器注入流体通道，在室温下孵育 45–60 分钟。
  5. 向含有 Alexa Fluor 488 鬼笔环肽的离心管中加入 1.5 mL 甲醇，配制成终浓度为 6.6 µM 的储备液。
  6. 取步骤 5.5 中的 5 µL Alexa Fluor 488 鬼笔环肽，加入到含 0.1% BSA 的 200 µL DPBS 溶液中稀释，得到终浓度为 0.165 µM 的 Alexa Fluor 488 鬼笔环肽工作液。
  7. 用移液器将 200 µL 上述混合液加入流体通道，在 37 °C 孵育 45–60 分钟以进行肌动蛋白染色。随后按前述方法用 PBS 洗涤样品 3 次。
  8. 用 PBS 配制 1 µg/mL 的 DAPI 溶液，使其流经芯片，并在 37 °C 下孵育 5 分钟以染色细胞核。
  9. 用移液器将 DPBS 加入流体通道，洗去染色液，再用 PBS 溶液重新充满流体室，以便使用荧光显微镜成像。
  10. 使用倒置荧光显微镜，在 40 倍放大倍数下，结合 CCD 探测器及激发/发射波长分别为 488/520 nm 和 358/461 nm 的滤光片组，采集水凝胶中 3T3 细胞的荧光图像，分别用于 Alexa Fluor 488 鬼笔环肽（肌动蛋白）和 DAPI（细胞核）的检测。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

为了比较完成梯度应变刺激芯片中每个圆形水凝胶之间的力学变化，我们测量了两个相同芯片中每个圆形水凝胶的线宽，分别对应注射体积为 0 µL（图 4a）和 40 µL（图 4b）。各圆环处的伸长百分比通过将 40 µL 注射芯片中的伸长量除以 0 µL 注射芯片中相应水凝胶的线宽计算得出（图 4c）。水凝胶为不可压缩材料，因此垂直收缩应变等于横向伸长应变。因此，在注射体积为 40 µL 的芯片中，伸长百分比显示为 15–65%，可转换为压缩应变（见补充文件 1）。

使用DAPI和鬼笔环肽分别对细胞核和F-肌动蛋白进行荧光染色，以分析细胞的排列情况。DAPI染色提供了细胞核取向的数据，而鬼笔环肽染色用于评估细胞铺展情况。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本文报道了一种简单的方法，用于比较细胞在水凝胶形状引导和拉伸作用后的排列行为。通过柔性聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜形成穹顶状曲面，从而制备具有不同高度的同心环形水凝胶。释放压力后，PDMS膜会自动对微图案化水凝胶施加作用力，形成梯度应变/拉伸，其中中心处最大，外边界处最小。由于梯度应变的形成依赖于柔性PDMS膜和流体芯片的操作，因此有几个关键参数需要注意：（i）精确控制PDMS膜的厚度对于调节梯度应变值至关重要。若膜过厚，即使注入最大体积的细胞预聚物，也无法在PDMS膜中形成适当的凸面曲线，从而无法交联出具有梯度高度的载细胞水凝胶；相反，若PDMS膜过薄，则无法对水凝胶施加足够的力。请确保PDMS盖模中未固化PDMS的重量约为每芯片1.6–2.0 g。（ii）在流体芯片中处理载细胞水凝胶交联过程中，防止污染非常重要。在将芯片放入培养箱进行细胞培养前，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）彻底冲洗流体通道，并用75%乙醇擦拭芯片表面，有助于避免污染问题。（iii）光引发剂的浓度和紫外光照射剂量应严格控制在约0.1%–2%范围内（推荐使用0.5%）。过度交联水凝胶或过量紫外照射会导致细胞活性降低。（iv）图案化水凝胶的线宽不宜过大，否则厚水凝胶中的营...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本项目得到了研究生出国研修计划（NSC-101-2917-I-007-010）、生物医学工程计划（NSC-101-2221-E-007-032-MY3）、纳米技术国家计划（NSC-101-2120-M-007-001-）以及中国台湾科技部（MOST-104-2221-E-007-072-MY3）和中国台湾国家科学委员会的资助。作者谨此感谢哈佛医学院的 Ali Khademhosseini、Gulden Camci-Unal、Arghya Paul 和 Ronglih Liao 教授分享水凝胶与细胞封装技术。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 黑色微量离心管Argos Technologies 03-391-161可用铝箔包裹的中性颜色 1.5 mL 离心管替代
10x DPBSSigma-Aldrich56064C
Alexa Fluor 488 鬼笔环肽 InvitrogenA12379 
BSASigmaA1595
钙黄绿素Molecular ProbeC1430用于标记活细胞
CCDPCO. ImagingPixelfly qe
细胞膜通透溶液Sigma-AldrichX100含 0.5% Triton X-100，用于通透细胞膜
DAPISigma-AldrichD8417细胞核染色
透析膜Sigma-AldrichD9527截留分子量 = 14,000
DMEMGibco11995-065
双面胶带3M8003
FBSHycloneSH30071.03
明胶Sigma-AldrichG2500凝胶强度 300，A 型，来源于猪皮
高频电子电晕发生器Electro-technic productsMODEL BD-20
甲基丙烯酸酐Sigma-Aldrich276685
微量注射器Hamilton8050150 μL 
显微镜OlympusIX71配备两套滤光片：Semrock 公司的 LF405/LP-B-000 和 LF488/LP-C-000
氧气等离子体处理仪Harrick plasmaPDC-001
多聚甲醛Sigma-AldrichP6148用于细胞固定
PDMSDOW CORNINGSylgard 184用于 PDMS 芯片浇铸成型的混合物
青霉素-链霉素溶液（Pen-Strep）Gibco10378-016青霉素/链霉素
光引发剂CIBAIrgacure 2959
碘化丙啶Sigma-AldrichP4170用于标记死细胞
无菌过滤杯MilliporeSCGPT05RE
TMSPMASigma-Aldrich440159用于水凝胶固定化
超声波破碎仪DeltaD150H150W，43kHz
紫外灯DAIHANWUV-L10
冷冻干燥机FIRSTEK150311025
NIH3T3（成纤维细胞）食品工业发展研究所（FIRDI）08C0011
MOXI Z Mini 自动细胞计数仪ORFLOMXZ001

参考文献

  1. Simmons, C. S., Petzold, B. C., Pruitt, B. L. Microsystems for biomimetic stimulation of cardiac cells. Lab Chip. 12 (18), 3235-3248 (2012).
  2. Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
  3. Guan, J., et al. The stimulation of the cardiac differentiation of mesenchymal stem cells in tissue constructs that mimic myocardium structure and biomechanics. Biomaterials. 32 (24), 5568-5580 (2011).
  4. Wan, C. R., Chung, S., Kamm, R. D. Differentiation of embryonic stem cells into cardiomyocytes in a compliant microfluidic system. Ann Biomed Eng. 39 (6), 1840-1847 (2011).
  5. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  6. Li, X., Chu, J. S., Yang, L., Li, S. Anisotropic effects of mechanical strain on neural crest stem cells. Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 598-605 (2012).
  7. Butcher, J. T., Barrett, B. C., Nerem, R. M. Equibiaxial strain stimulates fibroblastic phenotype shift in smooth muscle cells in an engineered tissue model of the aortic wall. Biomaterials. 27 (30), 5252-5258 (2006).
  8. Ramon-Azcon, J., et al. Gelatin methacrylate as a promising hydrogel for 3D microscale organization and proliferation of dielectrophoretically patterned cells. Lab Chip. 12 (16), 2959-2969 (2012).
  9. Park, S. H., Sim, W. Y., Min, B. H., Yang, S. S., Khademhosseini, A., Kaplan, D. L. Chip-Based Comparison of the Osteogenesis of Human Bone Marrow- and Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells under Mechanical Stimulation. PLoS One. 7 (9), e46689(2012).
  10. Gould, R. A., et al. Cyclic Strain Anisotropy Regulates Valvular Interstitial Cell Phenotype and Tissue Remodeling in 3D Culture. Acta Biomater. 8 (5), 1710-1719 (2012).
  11. Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Proc Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stemcells. Natl Acad Sci USA. 103 (44), 16095-16100 (2006).
  12. Sim, W. Y., Park, S. W., Park, S. H., Min, B. H., Park, S. R., Yang, S. S. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
  13. Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. Strain-Induced Alignment in Collagen Gels. PLoS One. 4 (6), e5902(2009).
  14. Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue Eng Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
  15. Wan, J. Microfluidic-Based Synthesis of Hydrogel Particles for Cell Microencapsulation and Cell-Based Drug Delivery. Polymers. 4 (2), 1084-1108 (2012).
  16. Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
  17. Keung, A. J., Kumar, S., Schaffer, D. V. Presentation Counts: Microenvironmental Regulation of Stem Cells by Biophysical and Material. Cues. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 533-556 (2010).
  18. Segers, V. F., Lee, R. T. Stem-cell therapy for cardiac disease. Nature. 451 (7181), 937-942 (2008).
  19. Hsieh, H. Y., et al. Gradient static-strain stimulation in a microfluidic chip for 3D cellular alignment. Lab Chip. 14 (3), 482-493 (2014).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

GelMA PDMS NIH3T3

相关文章