Summary
Эта статья знакомит простой подход к обеспечению непостоянного градиента статические штаммов на концентрические клеток Ладена гидрогеля регулировать выравнивание ячеек для тканевой инженерии.
Abstract
Искусственные руководство для сотовых выравнивание является горячей темой в области тканевой инженерии. Большинство предыдущих исследований провела расследование одного штамма индуцированной сотовой выравнивание на клетки Ладена гидрогеля с помощью сложных процессов экспериментальных и массового управления системами, которые обычно связаны с вопросами загрязнения. Таким образом в этой статье, мы предлагаем простой подход к построению градиента статической деформации, с использованием оптимизированных чип с пластиковой крышкой PDMS и УФ прозрачной стеклянной подложке для стимуляции клеточного поведения в 3D гидрогеля. Перегрузка форполимера фото patternable клеток в зале аэрогидродинамических может генерировать выпуклой кривой PDMS мембраны на обложке. После УФ сшивки через концентрические круговые микроузор под изогнутой PDMS мембраны и буфера мытья, микроокружение для расследования ячейки поведения при различных штаммов градиента самостоятельно созданной в оптимизированных микросхема, без внешних инструментов. NIH3T3 клетки были продемонстрированы после наблюдения изменений в клеточных выравнивание тенденции под руководством геометрии, в сотрудничестве с штамм стимуляции, которая колебалась от 15-65% на гидрогели. После 3 дней инкубации гидрогеля геометрии доминировали выравнивание ячеек в низкой сжимающие напряжения, где клетки выстраиваются вдоль оси удлинения гидрогеля под высоким Сжимающее напряжение. Между этими клетки показали случайных выравнивания из-за рассеивания радикальной руководство гидрогеля удлинение и геометрии руководством узорной гидрогеля.
Introduction
Качестве блок материала, который имитирует родной микроокружения, гидрогеля, содержащий внеклеточного матрикса (ECM) можно заново строить biomimetic ткани подмости для поддержки роста клеток. Обладать функции ткани, выравнивание организованные ячейки является важным требованием. Различные 2D (т.е. клетки культивировали на поверхности) и 3D (т.е. клетки, инкапсулированные в Гидрогель) рядов клеток были достигнуты путем культивирования или инкапсуляции клетки в или на гибких подложках с микро- или нано структуры1. Выравнивание ячейки 3D в микроархитектуре более привлекательной, как микроокружения ближе к родной ткани построить2,3,4. Один общий подход для выравнивания 3D клеток — геометрические подсказка гидрогеля форма2,3. Из-за ограниченного пространства для пролиферации клеток в короткой оси клетки цель для выравнивания вдоль Лонг-оси в микро узорные гидрогеля. Другой подход заключается в том, чтобы применить растяжение растяжение к гидрогели для достижения выравнивание ячейки параллельно стрейч направление4,5.
Биофизические стимуляции на ECM гидрогели, такие сжимающие напряжения или электрического поля, можно регулировать функции клеток для надлежащего ткани интеграции, распространение и дифференциации1,2,3. Много исследований было сделано для расследования сотовой поведение, применив один из деформированного состояния на время, используя несколько механического управления подразделения4,6,,78,9. Например использование механического шаговые двигатели сжал или растягивается на 3D инкапсулированных клеток коллагена гидрогеля был общий подход7,10. Однако такого контрольного оборудования требуется дополнительное пространство и сталкивается с проблемой загрязнения в инкубатор7,9,,1112. Кроме того большой инструмент не может дать точного управления окружающей среды обеспечить высокую воспроизводимость13.
Учитывая, что клетки Ладена гидрогели, как правило, работают на микро масштабе для биомедицинских приложений, это выгодно совместить MEMS технологии для создания целого ряда штамм/стрейч стимуляции одновременно расследовать поведение ячейки в 3D biomimetic конструкции в пробирке2,14,,1516,17,18. Например используя давление газа деформировать PDMS мембраны microfluidic фишек может привести к различных штаммов, вождение дифференцировки клеток различных линий9,16. Однако есть много технических проблем, таких, как процессы изготовления сложных чип в чистой комнате и интеграции программного обеспечения управления двигателей, насосов, клапанов и сжатых газов.
В этой работе мы демонстрируем простой подход для получения самоподдерживающегося градиента статическое напряжение microfluidic чип, используя шаблон концентрические круговые гидрогеля и гибкие PDMS мембраны. В отличие от большинства существующих подходов Наша платформа является портативным и одноразовые миниатюрное устройство, которое могут быть изготовлены за пределами желтой комнате и который обладает собственной генерации градиента штаммов на концентрические инкапсулированные клетки гидрогели, без внешнего механического оборудования во время инкубации. Поведение клеток фиброцита 3T3 под влиянием сочетания формы гидрогеля и различные растяжение стрейч указания подсказки были продемонстрированы в ходе наблюдения за выравнивание ячеек внутри 3D ECM-подражательный сред в чипе градиента напряжения для 3 дней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы сравнить механические различия между каждой круговой гидрогеля на чипе стимуляции завершенных градиента напряжения, мы измерили ширину линии каждого круговой Гидрогель в двух же фишки, с объемами впрыска 0 мкл (рис. 4a) и 40 мкл (рис. 4b), соответственно. Процент растяжении на каждом круге были рассчитаны путем деления растяжении в 40 мкл вводят чип ширины линии соответствующего гидрогелей в 0 мкл вводят чип (рис. 4 c). Гидрогель является несжимаемой материалом, поэтому вертикальная Договаривающихся штамм будет эквивалентна Боковое удлинение штамм. Таким образом, процент растяжении в чипе с объемом впрыска 40 мкл показать 15-65% удлинение, который может быть преобразован в сжимающие напряжения (см. дополнительный файл 1).
Флуоресцентный пятнать клеточных ядер и F-актина с DAPI и Фаллоидин, соответственно, было сделано для анализа сотовой выравнивание. Пятнать DAPI представили данные о ядерной ориентации, и пятнать Фаллоидин была применена для оценки распространения клеток. Рисунок 5a -c показывает выравнивание ячеек в чипе градиента напряжения. В строке 1 3T3 клетки выстраиваются вдоль радиальном направлении. Гидрогель 7 клетки случайным образом выровнены, в клетки выстраиваются вдоль круговой направление в строке 12. В соответствии с люминесцентные, окрашивание изображения был обнаружен 90 ° сдвиг от угла выравнивание ячеек 3T3 клеток в строке 1 (максимальная гидрогеля удлинение в радиальном направлении) для выравнивания угла ячейки с Лонг оси выравнивания в строке 12 (низкие гидрогеля удлинение в радиальном направлении).
В предыдущих исследований2,9ячейками в 200 микрон Узорные линии гидрогели цель для выравнивания вдоль Лонг-оси гидрогеля. Однако в этом исследовании, мы наблюдали, что удлиненные растянуть на 200 мкм гидрогели в направлении короткой оси представила еще один фактор влияет на и доминировать сотовой выравнивание, контролируя процент нагрузку на гидрогеля. Для 65% деформации на линии 1 радикальной выравнивание доказал, что удлинение стрейч гидрогеля доминирует выравнивание ячейки. Для 15% деформации на линии 12 круговой выравнивание доказал, что эффект Лонг оси доминировали выравнивание ячейки. Для 40% нагрузку на гидрогеля 7 клетки случайно выравниваются вследствие нейтрализации эффекта руководство и деформации геометрии.
Рисунок 1 . ПММА мать прессформы для PDMS лист и изготовление Plug. () разделенных компоненты ПММА плесень, включая нижнюю пластину, границы кадра и канал потока. После сборки с двухсторонней ленты образуется плесень мать ПММА для потока листа (b) . (c) другой ПММА плесень собирается для PDMS вилка. Красный номер представляет глубину. (единицы: мм) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Пластиковые дизайн Photomask для ячейки Ладена гидрогеля микроузор. Есть два отверстия с треугольник формы (2 мм в нижней строке и 6,5 мм в высоту) подключение к каналов потока поставлять свежие клетки питательной среды. () пластиковые photomask помечается с измерением. Период концентрические окружности – 400 Нм и ПВ составляет 50%. Диаметр круга центр – 2 мм. (b) photomask макет, без этикетки для лазерной печати на пластиковой прозрачной пленкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
На рисунке 3. Процессы изготовления градиента деформации клетки Ладена Гидрогель в радиальном направлении в оптимизированных чип PDMS. пластиковые photomask является соответствие и застряла под чип с покрытием TMSPMA аэрогидродинамических каналом. Микро шприца раствором предполимер ячейку вставляется в входе микросхемы и используется для вставки около 50 мкл для заполнения канала потока. (b) на выходе из канала потока закрыт с PDMS plug и вводят дополнительные 40 мкл раствора предполимер клеток. Дне стекла УФ узорные 30 s для изготовления концентрические круговые Гидрогель в чипе потока. (c) давление жидкости выпущен в канале потока, отсоединив розетки и ООН сшивки смесь вымывается с DPBS. (d) чип с статические градиента штамм применяется концентрических клеток Ладена гидрогели, которые готовы для культивирования клеток. В процессе сшивки УФ формируется (e) неконтинуальных градиента высоты гидрогеля вдоль радиуса. (f) после отключения розетки, PDMS мембраны становится плоской и применяет градиента напряжений на инкапсулированные клетки гидрогели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Градиент удлинение чистый Гидрогель. Ширина линии Удлинение и процент чистый Гидрогель без инкапсуляции клеток в градиенте штамм чип на 3 день с () 0-мкл (контрольная группа) и (b) 40 мкл инъекции томов. (c) удлинение процент рассчитывается путем деления значения линии ширины разницы между 40 мкл и 0 мкл ширину линии 40 мкл. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 . Флуоресцентные пятна актин ядро образы 3T3 инкапсулированные клетки в градиента фишки на 3 день. Направление выравнивание ячейки (a-c) линия 1, линия 7 (d-f) и (g-i) линия 12 выявить радиальные, случайные выравнивание и круговой выравнивание, соответственно. Зеленый и синий цвета показывают актина и ядро пятна, соответственно. Пунктирная белая линия представляет собой границу гидрогеля. Линейки: 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительная цифра 1. Расчет кривизны куполообразная PDMS. H(x): выпуклая кривая PDMS; H0: максимальная высота разница между PDMS купол до и после деформации; r: радиус купола; V: чрезмерной инъекции объем синий региона, что приводит к деформации PDMS как купол. Подробнее смотрите в дополнительных файлов 1 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.
Дополнительный файл 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье мы сообщаем о простой подход для сравнения характеристик выравнивания ячеек после гидрогеля форма руководства и растяжение растяжение. Гибкие PDMS мембраны создает куполообразная кривизны для генерации различных высот концентрические круговые гидрогелей. После выпуска давление, PDMS мембраны автоматически применяет силу для микро узорные гидрогели сформировать градиента напряжения/удлинение, в центре максимум и минимум на внешней границе. Как формирование градиента штамм разработан гибкий PDMS мембраны и обработку аэрогидродинамических чип, существует несколько важных параметров, которые должны присутствовать для: (i) точный контроль толщины PDMS мембраны имеет решающее значение для настройки значения градиента напряжения. Если Мембрана нанесена слишком толстым слоем, даже максимальный инъекции объем ячейки форполимера не будет способен генерировать надлежащего выпуклой кривой в PDMS мембраны для сшивки градиента высоты ячейки Ладена гидрогели. Напротив слишком тонкий PDMS мембраны нельзя применять достаточные силы гидрогели. Проверьте, что вес неотвержденных PDMS в форме PDMS Обложка около 1,6-2,0 г на чип. (ii) предотвращение загрязнения является очень важным во время обработки crosslink клетки Ладена Гидрогель в оптимизированных чип. Перед ячейкой культивирования в инкубаторе, тщательно промыванием стерилизованные PBS в оптимизированных канала и с помощью 75% этанола протирать поверхности чипа может помочь избежать проблемы загрязнения. (iii) концентрация фотоинициатора и доза УФ облучения должна быть тщательно контролируемых и в диапазоне ~0.1% - 2% (0,5% рекомендуется). Над сшивки гидрогеля и передозировка УФ-облучения приведет к жизнеспособности низкой клеток. (iv)-ширины линии узорной гидрогеля не должно быть слишком большим. В противном случае уровень питательных замены в толстые гидрогели не будет поддерживать пролиферации клеток. Как правило рекомендуется использовать менее 300 мкм. Расстояние между двумя кругами гидрогеля можно варьировать, и рекомендуется рабочем цикле 50%. (v) во время мытья или заправка канал потока с решения, следует избегать образования пузырьков. Аккуратно дозирование раствора в чип может помочь удалить пузырьки.
Концепция градиента штамма, порожденных PDMS-деформированного кривизны может быть далее повышен до применения динамических градиента штаммов и может быть интегрирована с биохимической стимуляции, который может принести пользу много исследований о функциональных регенерацию. Простой аэрогидродинамических инъекций модуль с вилкой PDMS могут быть заменены любой расширенный аэрогидродинамических системы для расширенной экспериментальной управления. ПММА плесень могут быть заменены microfabricated Су-8 mold или плесень оптом травления кремния.
Этот градиент штамм чип с круговой клеток Ладена гидрогеля может генерировать статические сжимающей силы на 3D гидрогеля без внешних механических или электрических машин. Таким образом он обеспечивает быстрый скрининг платформу для расследования поведения клеток в ряду условий деформации, без риска загрязнения проблем, вызванных работу внешних машин. Однако напряжение контролируемой время стимуляции не достижимо, потому что PDMS мембраны генерирует штаммов до деградации гидрогеля.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Этот проект был поддержан, выпускник Студенческие исследования за рубежом программа (NSC-101-2917-I-007-010); Биомедицинская инженерия программа (NSC-101-2221-E-007-032-MY3); и нанотехнологии национальной программы (NSC-101-2120-M-007-001-), национального научного Совета РПЦ, Тайвань. Авторы хотели бы поблагодарить профессора Али Khademhosseini, Gulden Джамчи-Унал, Arghya пол и Ronglih Liao Гарвардской медицинской школы для совместного использования технологии инкапсуляции гидрогеля и клеток.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL black microcentrifuge tube | Argos Technologies | 03-391-161 | This one can be replaced with a neutral color of 1.5 mL tube covered with aluminun foil |
| 10x DPBS | Sigma-Aldrich | 56064C | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| Calcein | Molecular Probe | C1430 | For labeling viable cells |
| CCD | PCO. Imaging | Pixelfly qe | |
| Cell membrane permeating solution | Sigma-Aldrich | X100 | 0.5% Triton X-100 for permeating cell membrane |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Cell nucleus staining |
| Dialysis membrane | Sigma-Aldrich | D9527 | Molecular weight cut-off = 14,000 |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| Double-side tape | 3M | 8003 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500 | gel strength 300, type A, from porcine skin |
| High frequency electronic corona generator | Electro-technic products | MODEL BD-20 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | |
| Micro syringe | Hamilton | 80501 | 50 μL |
| Microscope | Olympus | IX71 | Include two filter sets: LF405/LP-B-000 and LF488/LP-C-000 from Semrock |
| Oxygen plasma machine | Harrick plasma | PDC-001 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cell |
| PDMS | DOW CORNING | Sylgard 184 | Mixture for PDMS chip cast-molding fabrication |
| Pen-Strep | Gibco | 10378-016 | penicillin/streptomycin |
| Photoinitiator | CIBA | Irgacure 2959 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For labeling dead cells |
| Sterile Filtration cup | Millipore | SCGPT05RE | |
| TMSPMA | Sigma-Aldrich | 440159 | For hydrogel immobilization |
| Ultrasonicator | Delta | D150H | 150W, 43kHz |
| UV light | DAIHAN | WUV-L10 | |
| Freeze Dryer | FIRSTEK | 150311025 | |
| NIH3T3(fibroblast) | Food Industry Research and Development Institute(FIRDI) | 08C0011 | |
| MOXI Z Mini Automated Cell Counter | ORFLO | MXZ001 |
References
- Simmons, C. S., Petzold, B. C., Pruitt, B. L. Microsystems for biomimetic stimulation of cardiac cells. Lab Chip. 12 (18), 3235-3248 (2012).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
- Guan, J., et al. The stimulation of the cardiac differentiation of mesenchymal stem cells in tissue constructs that mimic myocardium structure and biomechanics. Biomaterials. 32 (24), 5568-5580 (2011).
- Wan, C. R., Chung, S., Kamm, R. D. Differentiation of embryonic stem cells into cardiomyocytes in a compliant microfluidic system. Ann Biomed Eng. 39 (6), 1840-1847 (2011).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Li, X., Chu, J. S., Yang, L., Li, S. Anisotropic effects of mechanical strain on neural crest stem cells. Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 598-605 (2012).
- Butcher, J. T., Barrett, B. C., Nerem, R. M. Equibiaxial strain stimulates fibroblastic phenotype shift in smooth muscle cells in an engineered tissue model of the aortic wall. Biomaterials. 27 (30), 5252-5258 (2006).
- Ramon-Azcon, J., et al. Gelatin methacrylate as a promising hydrogel for 3D microscale organization and proliferation of dielectrophoretically patterned cells. Lab Chip. 12 (16), 2959-2969 (2012).
- Park, S. H., Sim, W. Y., Min, B. H., Yang, S. S., Khademhosseini, A., Kaplan, D. L. Chip-Based Comparison of the Osteogenesis of Human Bone Marrow- and Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells under Mechanical Stimulation. PLoS One. 7 (9), e46689 (2012).
- Gould, R. A., et al. Cyclic Strain Anisotropy Regulates Valvular Interstitial Cell Phenotype and Tissue Remodeling in 3D Culture. Acta Biomater. 8 (5), 1710-1719 (2012).
- Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Proc Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stemcells. Natl Acad Sci USA. 103 (44), 16095-16100 (2006).
- Sim, W. Y., Park, S. W., Park, S. H., Min, B. H., Park, S. R., Yang, S. S. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
- Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L.
- Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue Eng Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
- Wan, J. Microfluidic-Based Synthesis of Hydrogel Particles for Cell Microencapsulation and Cell-Based Drug Delivery. Polymers. 4 (2), 1084-1108 (2012).
- Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
- Keung, A. J., Kumar, S., Schaffer, D. V. Presentation Counts: Microenvironmental Regulation of Stem Cells by Biophysical and Material. Cues. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 533-556 (2010).
- Segers, V. F., Lee, R. T. Stem-cell therapy for cardiac disease. Nature. 451 (7181), 937-942 (2008).
- Hsieh, H. Y., et al. Gradient static-strain stimulation in a microfluidic chip for 3D cellular alignment. Lab Chip. 14 (3), 482-493 (2014).
