Summary
Questo articolo introduce un approccio semplice per fornire ceppi statici gradiente discontinuo su un idrogel di cella-carichi concentrici per regolare l'allineamento di cella per l'ingegneria tissutale.
Abstract
Guida artificiale per allineamento cellulare è un tema caldo nel campo dell'ingegneria tissutale. La maggior parte della ricerca precedente ha studiato singolo allineamento cellulare indotta da sforzo su un idrogel carichi di cella utilizzando processi sperimentali complessi e controllo impianti di massa, che sono associate solitamente con problemi di contaminazione. Così, in questo articolo, vi proponiamo un approccio semplice per creare un gradiente ceppo statico utilizzando un chip fluidico con una copertura di plastica PDMS e un substrato di vetro trasparente UV per la stimolazione del comportamento cellulare in un idrogel 3D. Sovraccarico prepolimero cella foto-derivativazione nella camera di fluidica può generare una membrana PDMS curva convessa sulla copertina. Dopo reticolazione UV, attraverso un micropattern circolare concentrico sotto la membrana PDMS curvilinea e tampone di lavaggio, un microambiente per inquirente cella comportamenti sotto una varietà di ceppi di gradiente è self-consolidata in un singolo chip fluidico, senza strumenti esterni. Le cellule NIH3T3 sono state dimostrate dopo aver osservato il cambiamento di tendenza allineamento cellulare sotto la Guida di geometria, in collaborazione con stimolazione del ceppo, che varia da 15-65% su idrogel. Dopo 3 giorni di incubazione, la geometria di idrogel dominato l'allineamento della cella sotto sforzo di compressione basso, dove le cellule allineati lungo la direzione di allungamento di idrogel sotto alta deformazione compressiva. Tra questi, le cellule hanno mostrato allineamento casuale a causa della dissipazione del Consiglio radicale di idrogel allungamento e la Guida di geometria dell'idrogel di fantasia.
Introduction
Che serve come un blocco di materiale che imita un microambiente nativo, un idrogel contenenti matrice extracellulare (ECM) può ri-costruire impalcature tessuto biomimetici per supportare la crescita delle cellule. Per possedere le funzioni di un tessuto, cellula organizzata allineamento è un requisito essenziale. Vari 2D (cioè, cellule coltivate su una superficie) e 3D (ad esempio, le celle incapsulate in un idrogel) gli allineamenti delle cellule sono stati raggiunti da coltura o incapsulamento di cellule in o su substrati flessibili con micro- o nano-pattern1. Allineamento della cella 3D in microarchitettura è più attraente, come il microambiente è più vicino al tessuto nativo costrutto2,3,4. Un approccio comune per l'allineamento di cella 3D è il cue geometrico di idrogel forma2,3. A causa dello spazio limitato per proliferazione delle cellule nella direzione dell'asse corto, celle obiettivo allineare lungo la direzione di assi lunghi in un idrogel di micro-fantasia. Un altro approccio consiste nell'applicare a trazione Allungamento a idrogel per raggiungere celle allineamento parallelo alla direzione stretch4,5.
Stimolazione biofisica su idrogeli di ECM, come deformazione compressiva o un campo elettrico, può regolare le funzioni delle cellule per integrazione tissutale adeguata, proliferazione e differenziazione1,2,3. Gran parte della ricerca è stato fatto per studiare il comportamento cellulare mediante l'applicazione di una condizione di sforzo alla volta utilizzando più controllo meccanico unità4,6,7,8,9. Ad esempio, l'uso di motori passo-passo meccanico spremuto o allungato su un idrogel di collagene 3D incapsulato delle cellule è stato un approccio comune7,10. Tuttavia, tale apparecchiatura di controllo richiede spazio aggiuntivo e affronta il problema della contaminazione nell'incubatore7,9,11,12. Inoltre, lo strumento di grandi dimensioni non può dare un ambiente di controllo preciso di fornire elevata riproducibilità13.
Considerando che carichi di cella idrogeli sono in genere impiegati su micro-scala per applicazioni biomediche, è vantaggioso per combinare le tecniche MEMS per generare una gamma di stimolazione di ceppo/tratto contemporaneamente studiare i comportamenti delle cellule in 3D biomimetici costrutti in vitro2,14,15,16,17,18. Ad esempio, utilizzando la pressione del gas per deformare la membrana PDMS in chip microfluidici possa dar luogo a vari ceppi, guidando la differenziazione delle cellule a diversi lignaggi9,16. Tuttavia, ci sono molte sfide tecniche, quali i processi di fabbricazione di complicati chip in una camera pulita e il software di integrazione di controllo dei motori, pompe, valvole e gas compressi.
In questo lavoro, dimostriamo un approccio semplice per ottenere un chip di gradiente statico-ceppo microfluidici autosufficiente con l'ausilio di un modello di idrogel circolari concentrici e una membrana flessibile di PDMS. Diversamente dalla maggior parte degli approcci esistenti, la nostra piattaforma è un dispositivo portatile e USA e getta in miniatura che può essere fabbricato fuori una camera gialla e che possiede auto-generazione di gradienti ceppi su concentrici idrogeli incapsulato in cella, senza attrezzature meccaniche esterne durante l'incubazione. Comportamenti di cellulare dei fibroblasti 3T3 influenzata da una combinazione di forma idrogel e una varietà di segnali di orientamento elasticizzato trazione sono stati dimostrati durante l'osservazione di allineamento della cella all'interno di ambienti 3D ECM-mimetici nel chip gradiente di deformazione per 3 giorni.
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Representative Results
Per confrontare le variazioni meccaniche tra ogni idrogel circolare nel chip stimolazione ceppo gradiente completato, abbiamo misurato la larghezza di riga di ogni idrogel circolare in due i chip stesso, con volumi di iniezione di 0 µ l (Figura 4a) e 40 µ l (Figura 4b), rispettivamente. Il percentuali allungamenti al ogni cerchio sono stati calcolati dividendo gli allungamenti nel chip 40 µ l-iniettato per la larghezza di riga nel caso degli idrogeli corrispondente nel chip 0 µ l-iniettato (Figura 4c). L'idrogel è un materiale incomprimibile, così il ceppo contraente verticale sarà equivalente al ceppo di allungamento laterale. Di conseguenza, il percentuali allungamenti nel chip con il volume di iniezione di 40-µ l Visualizza 15-65% di allungamento, che può essere convertito al ceppo alla compressione (Vedi supplementari File 1).
Macchiatura fluorescente dei nuclei delle cellule e F-actina con DAPI e falloidina, rispettivamente, allo scopo di analizzare l'allineamento cellulare. La colorazione DAPI fornito dati sull'orientamento nucleare, e la colorazione falloidina è stata applicata per valutare la diffusione delle cellule. Figura 5a -c Mostra l'allineamento della cella nel chip gradiente di deformazione. Nella riga 1, le cellule 3T3 allineati lungo la direzione radiale. In idrogel 7, le celle allineate in modo casuale, e cellule allineati lungo la direzione circolare nella riga 12. In conformità con la colorazione immagini di fluorescente, è stato scoperto uno spostamento di 90 ° dall'angolo di allineamento delle cellule delle cellule 3T3 in linea 1 (idrogel massimo allungamento in direzione radiale) per l'angolo di allineamento delle celle con l'allineamento di assi lunghi in linea 12 (minima idrogel allungamento in direzione radiale).
Nella precedente ricerca2,9, cellule a 200 µm con motivi linea idrogeli mirano a allineare lungo la direzione di assi lunghi dell'idrogel. Tuttavia, in questo studio, abbiamo osservato che il tratto allungato l'idrogel di 200 µm nella direzione dell'asse corto fornito un altro fattore per influenzare e dominare l'allineamento cellulare controllando la percentuale del ceppo sull'idrogel. Per il ceppo di 65% sulla linea 1, l'allineamento radicale ha dimostrato che il tratto di allungamento dell'idrogel domina l'allineamento della cella. Per il ceppo di 15% sulla linea 12, l'allineamento circolare ha dimostrato che l'effetto di lungo-asse dominato l'allineamento della cella. Per il 40% di deformazione su idrogel 7, le cellule allineati in modo casuale dovuto la neutralizzazione dell'effetto geometria di orientamento e di sforzo.
Figura 1 . PMMA madre stampo per fabbricazione di spina e lastra PDMS. (a) i componenti separati dello stampo PMMA, tra cui una piastra inferiore, frame di contorno e canale di flusso. Dopo il montaggio con nastro biadesivo, (b) la muffa di madre PMMA per il foglio di flusso è formata. (c) stampo un altro PMMA viene assemblato per collegare il PDMS. Il numero rosso rappresenta la profondità. (unità: mm) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Plastica Photomask Design per il Micropattern di idrogel carichi di Cell. Ci sono due aperture con forme di triangolo (2mm presso la linea di fondo e 6,5 mm di altezza) di collegamento ai canali di flusso per la fornitura di terreno di coltura di cellule fresche. (a) strato di fotoresist plastica è etichettata con la dimensione. Il periodo del cerchio concentrico è di 400 nm e il duty cycle è del 50%. Il diametro del cerchio di centrocampo è 2mm (b) il layout di fotomaschere, senza etichette per stampa laser su una pellicola di plastica trasparente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 3. Processi di fabbricazione della sfumatura ceppo idrogel cella-carichi lungo la direzione radiale in un Chip fluidico PDMS. (a) un photomask plastica è allineato e bloccato sotto il chip con un canale fluidico rivestite con TMSPMA. Una micro-siringa con la soluzione di cella prepolimero viene inserita nell'ingresso del chip e usata per iniettare circa 50 µ l per riempire il canale di flusso. (b) l'uscita del canale di flusso è chiuso con il PDMS spina e un ulteriori 40 µ l di soluzione di cella prepolimero viene iniettato. Il fondo di vetro è UV-fantasia per 30 s per fabbricare l'idrogel circolari concentrici nel chip flusso. (c) la pressione del liquido viene rilasciata nel canale di flusso staccando la presa e la miscela di ONU-reticolazione è lavata fuori con DPBS. (d) un chip con ceppo gradiente statico si applica concentrici idrogeli carichi di cellula che sono pronti per la coltura delle cellule. Durante il processo di reticolazione UV, è formata (e) un'altezza di gradiente discontinuo di idrogel lungo il raggio. (f) dopo aver staccato la presa, la membrana PDMS diventa pianeggiante e si applica gradienti stress nel caso degli idrogeli incapsulato in cella. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 4. Il gradiente di allungamento di idrogel puro. La larghezza della riga di allungamento e la percentuale di idrogel puro senza incapsulamento cella del gradiente di deformazione chip il giorno 3 con la (a) 0-µ l (gruppo di controllo) e (b) 40-µ l iniezione volumi. (c) la percentuale di allungamento è calcolata dividendo il valore della differenza di larghezza di linea tra 40 µ l e 0 µ l per lo spessore della linea di 40 µ l. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Immagini di actina-nucleo macchia fluorescente del 3T3 celle incapsulate nei chip gradiente il giorno 3. La direzione di allineamento delle cellule in linea (a-c) 1 (d-f) linea 7 e linea (g-i) 12 rivelare allineamento radiale, casuale e allineamento circolare, rispettivamente. I colori verdi e blu indicano le macchie dell'actina e nucleo, rispettivamente. La linea bianca tratteggiata rappresenta il limite dell'idrogel. Barra della scala: 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Complementare nella figura 1. Calcolo della curvatura a forma di cupola PDMS. H (x): la curva PDMS convessa; H0: la differenza di altezza massima tra la cupola PDMS prima e dopo la deformazione; r: il raggio della cupola; V: il volume di iniezione eccessiva della regione blu, che causa la deformazione di PDMS come una cupola. Per dettagli, vedere complementare File 1 . Per favore clicca qui per scaricare questa figura.
File supplementari 1. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
In questa carta, segnaliamo su un approccio semplice per confrontare il comportamento di allineamento delle cellule dopo idrogel forma di orientamento e di allungamento a trazione. Una membrana flessibile di PDMS crea una curvatura a forma di cupola per la generazione di diverse altezze di idrogeli circolari concentrici. Dopo aver rilasciato la pressione, la membrana PDMS applica automaticamente la forza per il micro-fantasia idrogeli per formare gradiente ceppo/allungamento, con un massimo al centro e un minimo al confine esterno. Come la formazione del ceppo gradiente è progettata dalla membrana flessibile di PDMS e la gestione del chip fluidico, ci sono diversi parametri importanti che dovrebbero essere seguiti: membrana (i) un controllo preciso dello spessore del PDMS è fondamentale per regolare il valore del gradiente di deformazione. Se la membrana è troppo spessa, anche il volume di iniezione massima del prepolimero cella non sarà in grado di generare una curva convessa corretta nella membrana PDMS per reticolazione un'altezza gradiente di idrogeli carichi di cella. Al contrario, una membrana PDMS troppo sottile non può applicare forza sufficiente nel caso degli idrogeli. Si prega di controllare che il peso di non polimerizzato PDMS nello stampo copertura PDMS è circa 1.6-2.0 g / chip. (ii) la contaminazione prevenzione è molto importante durante la manipolazione di crosslink dell'idrogel di cella-carichi nel chip fluidico. Prima cella coltura nell'incubatrice, accuratamente lavaggio con PBS sterile nel canale fluidico e con 75% etanolo per pulire la superficie del chip può contribuire ad per evitare il problema di contaminazione. (iii) la concentrazione di fotoiniziatore e il dosaggio dell'esposizione UV dovrebbe essere attenti controllata e nella gamma di ~0.1% - 2% (0,5% è raccomandato). Over-reticolazione l'idrogel di iperdosaggio l'irradiazione di ultravioletti comporterà la vitalità cellulare basso. (iv) lo spessore della linea dell'idrogel di fantasia non dovrebbe essere troppo grande. In caso contrario, il tasso di sostituzione dei nutrienti nel caso degli idrogeli spessa non sarà in grado di sostenere la proliferazione delle cellule. Di solito, meno di 300 µm è raccomandato. La spaziatura tra due cerchi di idrogel può essere variata, e un 50% duty cycle è raccomandato. (v) durante il lavaggio o il canale di flusso con soluzione di riempimento, deve essere evitata la formazione di bolle. Pipettaggio delicatamente la soluzione nel chip può contribuire a rimuovere le bolle.
Il concetto di gradiente ceppo generato da PDMS-deforme curvatura può essere ulteriormente aggiornato all'applicazione dinamiche gradiente ceppi e può essere integrato con stimolazione biochimica, che possa beneficiare di molti studi sulla rigenerazione dei tessuti funzionali. Il modulo semplice iniezione fluidico con una spina PDMS può essere sostituito da qualsiasi sistema fluidico avanzato per controllo sperimentale esteso. Lo stampo PMMA può essere sostituito anche da una muffa microfabbricati SU-8 o una muffa del silicone inciso a massa.
Questo chip di gradiente ceppo con un idrogel carichi di cella circolare può generare la forza di compressione statica sull'idrogel 3D senza macchine meccaniche o elettriche esterne. Di conseguenza, fornisce una piattaforma di screening rapido per indagare i comportamenti di cella in una serie di condizioni di sforzo, senza il rischio di problemi di contaminazione causato tramite il funzionamento di macchine esterne. Tuttavia, ceppo temporizzato stimolazione non è realizzabile, perché la membrana PDMS genera ceppi fino la degradazione dell'idrogel.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo progetto è stato sostenuto dal Graduate Student studio all'estero programma (NSC-101-2917-I-007-010); il programma di ingegneria biomedica (NSC-101-2221-E-007-032-MY3); e il programma nazionale di nanotecnologia (NSC-101-2120-M-007-001-), Consiglio nazionale della scienza della Repubblica di Cina, Taiwan. Gli autori vorrei ringraziare Prof Ali Khademhosseini, Unal-Gulden Carafa, Arghya Paul e Ronglih Liao presso la Harvard Medical School per la condivisione della tecnologia di incapsulamento di idrogel e cella.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL black microcentrifuge tube | Argos Technologies | 03-391-161 | This one can be replaced with a neutral color of 1.5 mL tube covered with aluminun foil |
| 10x DPBS | Sigma-Aldrich | 56064C | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| Calcein | Molecular Probe | C1430 | For labeling viable cells |
| CCD | PCO. Imaging | Pixelfly qe | |
| Cell membrane permeating solution | Sigma-Aldrich | X100 | 0.5% Triton X-100 for permeating cell membrane |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Cell nucleus staining |
| Dialysis membrane | Sigma-Aldrich | D9527 | Molecular weight cut-off = 14,000 |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| Double-side tape | 3M | 8003 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500 | gel strength 300, type A, from porcine skin |
| High frequency electronic corona generator | Electro-technic products | MODEL BD-20 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | |
| Micro syringe | Hamilton | 80501 | 50 μL |
| Microscope | Olympus | IX71 | Include two filter sets: LF405/LP-B-000 and LF488/LP-C-000 from Semrock |
| Oxygen plasma machine | Harrick plasma | PDC-001 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cell |
| PDMS | DOW CORNING | Sylgard 184 | Mixture for PDMS chip cast-molding fabrication |
| Pen-Strep | Gibco | 10378-016 | penicillin/streptomycin |
| Photoinitiator | CIBA | Irgacure 2959 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For labeling dead cells |
| Sterile Filtration cup | Millipore | SCGPT05RE | |
| TMSPMA | Sigma-Aldrich | 440159 | For hydrogel immobilization |
| Ultrasonicator | Delta | D150H | 150W, 43kHz |
| UV light | DAIHAN | WUV-L10 | |
| Freeze Dryer | FIRSTEK | 150311025 | |
| NIH3T3(fibroblast) | Food Industry Research and Development Institute(FIRDI) | 08C0011 | |
| MOXI Z Mini Automated Cell Counter | ORFLO | MXZ001 |
References
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