Summary
Denne rapporten beskriver protokoller for å karakterisere interaksjoner mellom bakteriell ytre membran proteiner og menneskelige supplement regulator vitronectin. Protokollene kan brukes å studere bindende reaksjoner og biologisk funksjon av vitronectin i en bakterie-art.
Abstract
Bakterier benytte supplement regulatorer som gå utenom vert immunrespons. Her beskriver vi protokoller for å vurdere rollen vitronectin oppkjøpet på bakteriell cellen overflaten skuespill i motstanden mot vert immunsystemet. Flow cytometri eksperimenter identifisert humant plasma vitronectin som en ligand for bakteriell reseptor ytre membran protein H Haemophilus influenzae type f. Enzym knyttet immunosorbent analysen var ansatt å karakterisere protein-protein interaksjoner mellom renset rekombinante proteiner H og vitronectin og bindende affinitet ble vurdert ved hjelp av bio-lag interferometry. Biologiske betydningen av binding av vitronectin protein H på bakteriell celleoverflaten i unndragelse av immunrespons vert ble bekreftet en serum motstand analysen med normal og vitronectin-utarmet humant serum. Betydningen av vitronectin i bakteriell tilslutning ble analysert bruker glass lysbilder med og uten vitronectin belegg, etterfulgt av Gram flekker. Til slutt, bakteriell vedheft til human alveolar epithelial celle monolayers ble undersøkt. Protokollene beskrevet her kan enkelt tilpasses til studiet av en bakterie-art av interesse.
Introduction
Vitronectin (Vn) er en viktig menneskelig glykoprotein involvert i å opprettholde homeostase via regulering av fibrinolytisk. Vn fungerer også som et supplement regulator begrenser terminal komplementbanen under C5b6-7 sammensatt dannelse og C9 polymerisasjon. Flere bakteriell patogener har vist å rekruttere Vn til celleoverflaten som motstå supplement deponering1,2,3. I tillegg fungerer Vn som en "sandwich" molekyl mellom bakterier og vert epithelial celle reseptorene, og dermed fremme overholdelse og internalization patogener2,4,5. Binding av Vn til bakteriell celleoverflaten er formidlet av andre aktuelle uidentifisert proteiner. Klargjørende fullt funksjonell rolle Vn-binding i unndragelse av immunrespons slange vil derfor kreve identifikasjon av Vn-rekruttering proteiner.
Det første trinnet i å identifisere Vn-bindende proteiner er å teste om en patogen rundt kan binde renset Vn. flowcytometri er en praktisk og enkel metode for å avgjøre om Vn er bundet til patogen celler. I denne studien vurdert vi binding av Vn til ulike Haemophilus influenzae type f (Hif) kliniske isolater6. Metoden beskrevet heri er kvantitative og kan brukes til å skille bindende kapasiteten til en rekke bakterielle stammer. I en tidligere studie karakteriserte vi protein H (PH) HIF som en Vn-bindende protein7. Derfor studien, Vn-bindende potensialet av vill-type (WT) Hif og Hif M10Δlph mutanter ble sammenlignet med beskrevet protokollene.
Når det er bestemt at en patogen binder Vn, er det andre trinnet å karakterisere den overflaten proteom for å identifisere potensielle Vn-bindende proteiner. En rekke tilnærminger kan brukes til dette formålet8,9, men disse metodene er ikke beskrevet i denne rapporten. Metoden passer undersøke protein-protein interaksjoner er å recombinantly express valgte bakteriell overflaten proteiner i E. coli og rense ved affinitet kromatografi. Her bruker vi PH og dets molekylær interaksjon med Vn for å illustrere metoden. Interaksjoner mellom rekombinant PH og Vn var preget bruker et enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA)7 og en nylig utviklet etikett-fri teknikk kjent som bio-lags interferometry (BLI)10,11. Mens ELISAs kan brukes til å bekrefte protein-protein interaksjoner, gir BLI detaljert data om kinetic parameterne for samhandlinger.
For å studere Vn funksjonelle rolle i bakteriell tilslutning, kan to forskjellige analyser benyttes. Første analysen beskrevet her er direkte måling av bakteriell tilslutning til Vn-belagt glassflater, mens andre analysen undersøker tilslutning til overflaten av epitelceller. Første analysen, glass lysbilder ble belagt med Vn og binding av WT eller mutant Hif stammer ble vurdert av Gram-flekken og mikroskopi. Denne teknikken skiller lett bakterier basert på evnen til å binde Vn12. Bakteriell vedheft til pattedyrceller var da analysert ved å legge kulturperler bakterier på en monolayer av type II alveolar epitelceller; bakteriell vedlegg ble vurdert ved å telle antall colony-forming enheter (CFUs). Overholdt og internalisert bakterier kan skilles i tilstedeværelse eller fravær av Vn4,13.
Rollen Vn oppkjøpet i bakteriell serum motstand ble evaluert med en serum drapet analysen (dvs., serum bakteriedrepende aktivitet). For å vurdere betydningen av Vn oppkjøpet i serum motstand, var bakteriedrepende aktiviteten av Vn-utarmet serum (VDS) forhold til normal humant serum (NHS). Lett metoden skiller Vn-bindende versus ikke-bindende bakterier basert på serum motstand. Vi anvendt denne metoden for å studere rollen til Vn i serum motstanden av flere bakteriell patogener4,12.
Mange metoder er rapportert for å studere vert-patogen interaksjoner. Her beskriver vi et sett med protokoller som kan enkelt tilpasses til studiet av enhver patogen for å vurdere Vn rolle i patogenesen. Vi testet disse protokollene ved hjelp av ulike patogener, og Hif ble valgt som et eksempel for denne rapporten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. analyse av Vn som en bakteriell overflaten Protein Ligand
-
Påvisning av Vn-binding på bakteriell overflaten med flowcytometri
Merk: I flowcytometri, vi pleide siden scatter og videresende scatter gate positive hendelser. For å undersøke interaksjonene med Vn, Hif kliniske isolater (n = 10)7 ble valgt med E. coli BL21 (DE3) som en negativ kontroll (figur 1A).- Kultur Hif kliniske isolater i hjernen-hjertet infusjon (BHI) medium supplert med 10 µg/mL NAD og hemin på 37 ° C med skjelvende på 200 rpm. Bruk Luria-Bertani medium for å kultur E. coli14. Høste Hif i midten av Logg fase (OD600 = 0,3)15, og resuspend bakterier i fosfat-bufret saltvann (PBS), pH 7.2, som inneholder 1% (w/v) bovin serum albumin (BSA) (blokkerer buffer; PBS-BSA). Justere suspensjon 109 CFU/mL.
- Overføre dele med 5 x 106 CFU til 5 mL polystyren runde bunn rør (12 x 75 mm2) og legge 1 mL av blokkering buffer. Sentrifuge suspensjon på 3500 × g ved romtemperatur (RT)16 for 5 min for å pellets bakterier, så nøye Sug opp for å fjerne nedbryting uten å forstyrre pellet.
- Resuspend bakteriell pellets med 50 μL blokkerer bufferen som inneholder 250 nM Vn og Inkuber prøvene 1t på RT uten risting. Etter inkubasjon pellets bakterier med sentrifugering 3500 x g i 5 minutter, deretter vaske pellets tre timene benytter PBS og lignende sentrifugering skritt.
- Legge til 50 μL av primære sauer anti-Vn polyklonale antistoffer (pAbs) på 1: 100 fortynning i PBS-BSA bakteriell pellets. Inkuber suspensjon 1t på RT, deretter vaske bakterier tre ganger med PBS fjerne ubundet antistoffer (som beskrevet i trinn 1.1.3).
- Deretter legger til 50 μL av PBS-BSA inneholder fluorescein isothiocyanate (FITC)-konjugert esel anti-sauer pAbs (1: 100 fortynning) og Inkuber på RT 1t i mørket.
- Forbered en tom kontroll ved rugende bakterier med blokkering buffer bare og pAbs uten Vn.
- Vask bakterier tre ganger med 1 mL av blokkering buffer og pellets suspensjon av sentrifugering, som beskrevet i delen 1.1.2. Endelig resuspend bakteriell pellets med 300 µL av PBS og analysere ved flyt cytometri7.
-
ELISA analyse av samspillet mellom rekombinant PH og Vn
Merk: Kontroller må tas for å utelate uspesifikke bindende. Menneskelige faktor H (FH) eller C4b-binding protein (C4BP) brukes som positive og negative kontroller, henholdsvis.- Fortynn hver av menneskelige proteiner (Vn, FH og C4BP) separat til 50 nM i Tris-HCl, pH 9.0 (belegg buffer). Dispensere 100 µL av protein løsning i hver brønn av en Polysorp være ferdig innen plate. Lukk platene med lokk og lagre på 4 ° C over natten (16 h) å lette immobilisering av protein på plate mikrotiterbrønnene.
- Forkaste løsningen fra være ferdig innen platen ved å vippe opp ned over vasken og vaske brønnene tre ganger med 300 µL PBS/godt. Blokkere belagt brønnene 1t på RT med PBS med 2,5% (w/v) BSA (PBS-BSA).
- Fjerne blokkering løsningen, vaskes brønnene tre ganger med 300 µL av PBS 0,05 prosent (v/v) mellom 20 (PBST) per brønn. Legge til 100 µL av 50 nM rekombinant hans-merket PH hvert utvalg godt og ruge 1t på RT. Legg 100 µL av PBS-BSA i kontroll brønner.
Merk: Lph genet koding PH fra Hif ble forsterket av PCR og klonet i pET26b uttrykk vektoren som legger en 6 × hans-kode på C-terminus av uttrykt protein. Rekombinant vektoren ble forvandlet til E. coli BL21(DE3) for uttrykket. Ni-NTA harpiks ble brukt til å rense rekombinante proteiner15. - Forkaste protein løsningen og fjerne ubundet proteiner ved å vaske brønnene tre ganger med 300 µL av PBST per brønn. Legge til 100 µL av PBS-BSA inneholder pepperrotperoksidase (HRP)-konjugert anti-hans pAbs (1:10, 000 fortynning) og Inkuber 1t på RT.
- Klargjør 20 mM løsning A ved oppløsning tetramethylbenzidine i en løsning av 5% aceton eller 45% metanol. For å forberede løsning B, oppløse 19,2 g av sitronsyre i 1000 mL av H2O, justere pH til 4,25 ved å legge til KOH, deretter legge 230 µL av 30% H2O2. Lagre begge løsninger i mørket på RT. Like før bruk, bland 500 µL løsning B med 9,5 mL A for å forberede ELISA oppdagelsen reagensen.
- Vask brønnene tre ganger med 300 µL av PBST per brønn og gjenkjenner antigen-antistoff komplekser ved å legge til 100 µL av ELISA oppdagelsen reagensen i hver brønn.
- Legge til 50 µL av H 1 M2så4/well å stoppe reaksjonen. Måle optisk densitet av ved 450 nm likner en microplate.
-
Studie av the samhandling kinetics av rekombinant PH og Vn bruker BLI
- Nakkens menneskelige Vn på Amin-reaktive sensorer med Amin kopling metode, ifølge produsentens retningslinjer11.
- Bruker PBS, serielt fortynne ligand (rekombinant PH) fra 0 til 4 µM og overføre de resulterende løsningene til en 96-brønns svart, flat bunn være ferdig innen plate. Utføre eksperimentet på 30 ° C med en BLI instrument17.
- Legg til data-mappen i den BLI analyse programvaren. Velg 'sensor utvalg' . Deretter, velg 'reference godt' (Vn-belagt sensor i PBS) for subtraksjon.
- Velg 'justere y til baseline' og velg 'interstep korreksjon og justere Association'. Trykk 'prosessdata' som vil automatisk åpne kategorien analyse.
- Velg alternativet 'association og dissosiasjon' under montering kurve i kategorien analyser. Velg modellen "1:1 bindende og globale passer". Trykk "passer kurven" og eksport passende data17.
2. karakterisering av rollen Vn i bakteriell tilslutning
-
Studie av bakteriell tilslutning til Vn-belagt glassoverflater
- Forberede en 2 µg/mL løsning av Vn i PBS og Pipetter 10 µL av denne løsningen på et glass mikroskop lysbildet som en eneste dråpe. La rullegardinlisten tørke på lysbildet i 30 min på RT. Coat et lysbilde med menneskelige serum albumin (HSA) som en negativ kontroll.
- Vask protein-belagt glass lysbilder tre ganger av dipping lysbildene i to sekunder i et beaker med PBS for å fjerne overflødig ubestrøket protein. Legge til 20 mL frisk Hif kultur (beskrevet i trinn 1.1.1) i en steril plast Petriskål og senk den Vn- / HSA-belagt glass lysbilder i kultur medium. Inkuber retter på 37 ° C i 1 time med skjelvende på 20 rpm.
Merk: Hif M10 og Hif M10Δlph var vokst i flytende BHI medium eller sjokolade agar plater. Mediet for lph mutant ble supplert med 10 µg/mL kanamycin15. - Etter inkubasjon fjerne eventuelle ubundet bakterier av submerging lysbildene tre ganger i et beaker fylt med PBS. Visualisere bakterier ved Gram flekker, som beskrevet.
- Fjerne overflødig PBS fra hvert lysbilde ved å vippe den og rørende kanten på papir. Air-Dry lysbilder for 3-5 minutter på RT og ordne overholdt bakterier ved å passere hvert lysbilde tre ganger over varme.
- Holde lysbildet i kantene med to fingre på et flekker brett, så Legg til 3-4 dråper (200-300 µL) 2,3% crystal violet løsning. Vent 60 s og vask lysbildene under en svak strøm av tap vann for 3-4 s.
- Legge til 3-4 dråper 0,33% joden løsning på lysbildene. Vente 1 min og skyll lysbildet under en svak strøm av vann fra springen. Nøye tørke lysbildene ved blotting papir.
- Legge til 3-4 dråper decolorizing løsning som inneholder 75% isopropylalkohol og 25% aceton på lysbildet. 5 – 10 s, vaskes lysbildet under en svak strøm av vann fra springen.
- Legg til 3-4 dråper (200-300 µL) grunnleggende carbolfuchsin løsning. Vente 1 min og skyll lysbildene under en svak strøm av vann fra springen. Tørr lysbildene bruker blotting papir.
- Visualisere bakterier under en lys mikroskop, velge en oljeneddyp linsen på 100 X forstørrelse18. Sammenligne etterlevelse av Hif WT og mutant bakterier på glassflater Vn - og HSA-belagt.
-
Studie av Vn-avhengige overholdelse av bakterier epitelceller
Merk: Denne effektiv overholdelse av analysen ble brukt i våre tidligere studier4,7.- Kultur A549 celler (type II alveolar epitelceller) i en 75 cm2 vev kultur bolle med F12 medium med 10% (vol/vol) fetal kalv serum (FCS) (komplett medium) og 5 µg/mL gentamicin. Inkuber flasken i en inkubator med 5% CO2 på 37 ° C for 3 dager inntil 80% confluent (confluency kan anslås ved å visualisere dekning av cellene med invertert mikroskopet). Følgende fire trinn beskriver hvordan å forberede epitelceller analysen19,20.
- Vask celle monolayer i flasken to ganger med 20 mL PBS av mild virvlende. For å koble cellene fra kolbe overflaten, legge 2 mL celle avdeling enzym løsning og Inkuber kolbe for 5 min på 37 ° C. Tapp flasken håndflaten koble alle cellene fra plast overflaten. Pipetter opp og ned et par ganger å spre celle klumper.
- Legge til 18 mL F12 komplett medium kolbe og overføre hele cellen suspensjon slik 50 mL steril Falcon. Sentrifuge celle suspensjon i 5 min på 200 x g ved RT og kast nedbryting. Resuspend celle pellet i 10 mL av F12 komplett medium.
- Fjerne 10 µL av cellen suspensjon og plassere den i et Eppendorf rør, deretter legge 90 µL Trypan blå løsning. Laste inn prøven i en hemocytometer (dybde 0,1 mm) etter plassering av dekkglassvæske.
- Telle alle levedyktig celler i områder A, B, C og D (hvert felt består av 16 torg, og hvert kvadrat har et areal på 0.0025 mm2), deretter beregne gjennomsnittlig antall celler ([A + B + C + D] / 4). Beregne antall celler per milliliter hjelp av følgende ligning:
Levedyktig celler/mL = gjennomsnittlig celle antall × 104 × fortynning faktor20.
Merk: Her fortynningsfaktoren er 10. - Fortynne celle suspensjon til 5.0 x 103 celler/mL med komplett middels med 5 µg/mL gentamicin. Dispensere 500 μL celle suspensjon i hver brønn av en 24-vel celle kultur plate. Inkuber platen på 37 ° C i 5% CO2 til cellene er 90% confluent.
- Før bakteriell infeksjon, fjerne mediet fra brønnene og legge F12 medium (uten FCS), deretter ruge over natten på 37 ° C.
- Vask celle monolayer tre ganger med 500 µL av PBS på rett sted plate is og legge 100 µL av pre kjølt F12 medium som inneholder 10 µg/mL av Vn. Incubate plate ved 4 ° C i 1 time. Kontroll brønner, Legg bare F12 medium.
- Etter inkubasjon forkaste løsningen av pipettering og vask celle laget to ganger med 1 mL av PBS på RT. Resuspend en kultur for fersk vokst Hif M10 (trinn 1.1.1) i F12 medium (2 × 108 CFU/mL). Tilsett 100 µL av denne bakteriell suspensjon hver brønn og Inkuber platen i 2t på 37 ° C.
Merk: Hver også inneholder ca 2 x 105 A549 celler. Infisert, 2 x 107 bakteriell CFU ble lagt, tilsvarer et mangfold av infeksjon av 100. - Fjerne mediet av pipettering og vask A549 epitelceller tre ganger med PBS. Legge til 50 µL/vel av cellen avdeling løsning og ruge platen i 5 min på 37 ° C.
- Deretter legger til 50 µL av F12 komplett medium per brønn for å stoppe den enzymatiske reaksjonen. Overføre epitelceller (≈100 μL [dvs, hele volumet]) fra hver brønn til 6-mL røret som inneholder fire glassperler. Lyse cellene på RT av vortexing i 2 minutter.
- Fortynne 10 µL av cellen lysate 100-fold ved å legge 10 µL av lysate 990 µL av F12 medium. Plate 10 µL av utvannet utvalget på en sjokolade agar tallerken.
- Inkuber sjokolade agar platen på 37 ° C over natten og telle koloniene. Hver kolonien representerer en CFU.
- Kultur A549 celler (type II alveolar epitelceller) i en 75 cm2 vev kultur bolle med F12 medium med 10% (vol/vol) fetal kalv serum (FCS) (komplett medium) og 5 µg/mL gentamicin. Inkuber flasken i en inkubator med 5% CO2 på 37 ° C for 3 dager inntil 80% confluent (confluency kan anslås ved å visualisere dekning av cellene med invertert mikroskopet). Følgende fire trinn beskriver hvordan å forberede epitelceller analysen19,20.
3. analyse av Vn-avhengige motstand mot bakteriedrepende aktiviteten i humant Serum
- Kjøp NHS fra en kommersiell kilde. Forberede VDS som beskrevet tidligere12. Fylle VDS 180 nM Vn som tilsvarer Vn i NHS.
- Klargjør inaktivert serum (hans) ved oppvarming NHS på 56 ° C i 30 min for å deaktivere supplement proteiner.
Merk: Den optimale serum konsentrasjonen (5%) og inkubasjon tid (15 min) for analysen beskrevet i trinnene 3.3-3,7 var bestemt empirisk Hif15; parameterne kan variere for andre bakterielle patogener. - Kultur bakterier (i dette tilfellet, Hif M10 og mutant Hif M10Δlph) til midten av Logg fase (OD600 = 0,3). Pellets bakterier med sentrifugering 3500 x g i 10 min.
- Resuspend bakteriell pellets med 1 volum druesukker gelatin Veronal buffer (DGVB++, pH 7.3) med 2,5% (w/v) glukose, 2 mM MgCl2, 0.15 mM CaCl2og 0,1% (wt/vol) gelatin.
- Legge til 1,5 x 103 CFU bakterier mot 100 µL av DGVB++ inneholder 5% serum (NHS, hans, VDS, eller VDS + 180 nM Vn). Inkuber prøven på 37 ° C i 15 min med skjelvende på 300 rpm.
- Fjerne en 10 µL aliquot fra reaksjonsblandingen på 0 min (T0 utvalget) og 15 minutter (Tt utvalget) og plate på sjokolade agar. Inkuber platen på 37 ° C over natten.
- Etter inkubasjon telle koloniene vises på tallerkenen. Beregne prosentandelen av bakterier drepte12 hjelp av følgende ligning: (CFU på Tt) / (CFU på T0) × 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vn-binding til overflaten av bakterier ble bestemt av flowcytometri. Alle Hif kliniske isolater testet i denne studien rekruttert Vn til celleoverflaten. Ingen samspillet Vn med celleoverflaten ble observert i E. coli negativ kontroll belastningen (figur 1A). Som vist i figur 1B, er PH en stor Vn-bindende protein på overflaten av Hif celler. Binding av Vn av WT Hif belastningen forårsaket M10 en endring i befolkningen, mens Hif M10Δlph ikke ble bundet Vn og opptrådte ligner på kontrollen.
Protein-protein interaksjoner mellom PH og Vn ble anslått av ELISA og BLI. Rekombinant PH fikk lov til å binde med menneskelige faktor H, Vn og C4BP (negativ kontroll) belagt på brønnene av være ferdig innen ELISA plater. Bundet PH ble beregnet ved hjelp av en anti-hans pAbs. Resultatene klart indikerte en vesentlig grad av samhandling mellom PH og Vn og faktor H, i forhold til C4BP (figur 2A). Samspillet mellom PH og Vn ble anslått i sanntid ved hjelp av BLI. Figur 2 B viser PH bindende svar kurver for Vn-belagt sensor overflaten. Bindende affinitet (i dette tilfellet, Kd = 2.2 µM) ble beregnet ved å tilpasse dataene til stabil bindende kinetics.
Bakterier mangler uttrykk for PH på cellens overflate (Hif M10Δlph) viste redusert tilslutning til Vn-belagt glassflater sammenlignet WT celler (Figur 3A). I tillegg forbedret tilstedeværelsen av Vn på overflaten av epitelceller betydelig etterlevelse av Hif (Figur 3B). Disse resultatene indikerte at PH-Vn samspillet bidratt betydelig til bakteriell etterlevelse.
Vn er en velkjent supplement inhibitor. For å beregne komplement-hemmer aktiviteten, serum-mediert drapet ble undersøkt i tilstedeværelse og fravær av Vn. WT Hif celler utstilt høyere serum motstand enn M10Δlph mutant celler. Ingen bakterier ble drept i nærvær av hans (Figur 4A). Interessant, WT Hif utstilt redusert overlevelse i VDS, og påfyll av Vn økt bakteriell overlevelse. Imidlertid Hif M10Δlph belastningen ikke svare på Vn uttømming fordi det ikke kunne rekruttere Vn til celleoverflaten (Figur 4B). Disse resultatene viser tydelig at Vn er en viktig vert faktor som beskytter bakterier fra komplement-mediert killing (Figur 4A-B).
Figur 1 : Haemophilus influenzae serotype f binder Vn via overflaten-uttrykt pH (A) flyt cytometri resultater viser binding av Vn celler av Hif kliniske isolater. Hver kliniske isolere (5 x 106 CFU) ble inkubert med 250 nM human Vn. bundet ligand ble oppdaget ved hjelp av en sau anti-Vn pAbs og FITC-konjugerte esel anti-sauer sekundære antistoffer. Escherichia coli BL21 (DE3) ble inkludert som en negativ kontroll. Dataene presenteres som mener fluorescens intensiteten fra tre eksemplarer analyser i tre separate forsøk og feilfelt representerer SD. (B) flyt cytometri histogrammer demonstrere binding av Vn på overflaten av WT Hif M10 og PH-sletting Hif M10Δ lph mutant. Representant data fra en av tre separate forsøk er vist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Rekombinant PH binder til Vn. (A) ELISA resultater viser binding av rekombinant PH Vn, FH og C4BP. FH ble brukt som en positiv, mens C4BP ble brukt som en negativ kontroll. Analysere protein-protein interaksjoner, Vn, FH og C4BP var belagt i ekvimolare (50 nM) konsentrasjoner på brønnene på microtiter plater. Deretter 50 nM rekombinant PH-His6x ble lagt til. Bundet PH ble oppdaget bruker et HRP-konjugerte antistoffer mot hans pAbs. Dataene som vises er av tre eksemplarer analyser fra tre uavhengige eksperimenter, og feilfelt angir SD. ***, P≤0.001. (B) BLIanalysis av PH binding til Vn: rekombinant Vn var immobilisert AR2G sensorer og bindende kinetics av PH (0,25-4 µM) til Vn ble registrert bruker BLI instrumentet. Likevekt affinitet konstant ble beregnet med signalene oppnådd for hver konsentrasjon på likevekt, og datatypen var utstyrt etter stabil kinetics. Forsøket ble gjentatt tre ganger, og en representant datasett vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Samspillet mellom PH og Vn forbedrer bakterielle overholdelse glassflater og epitelceller. (A) lys mikroskopiske bilder viser overholdelse av Hif Vn-belagt glass lysbilder. Bakterier var visualisert ved Gram flekker. Representant bilder fra en av tre uavhengige eksperimenter vises. Dette panelet ble tidligere publisert i Journal for immunologi7 og er gjengitt her med tillatelse fra den amerikanske foreningen Immunologists. (B) etterlevelse av WT Hif M10 celler til A549 epitelceller i tilstedeværelse og fravær av Vn betyr tre eksemplarer analyser fra tre uavhengige eksperimenter tegnes og feilfelt representerer SD. *, p ≤0.05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Vn rekruttert til celleoverflaten Hif beskytter bakterier fra serum-mediert killing. (A) WT Hif M10 og mutant Hif M10Δlph var ruges i 15 min i 5% NHS eller hans. (B) motstand av Hif M10 og Hif M10Δlph til bakteriedrepende effekter på 5% VDS og VDS supplert med 250 nM renset Vn. Data representerer betyr tre eksemplarer analyser fra tre uavhengige eksperimenter, og feilfelt viser SD. ***, p ≤0.001; NS, ikke signifikant. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakteriell patogener rekruttere Vn til celleoverflaten og benytte dette supplement regulator for å hindre avsetning supplement faktorer og ferdigstillelse av membran angrep komplekse2. Vn fungerer også som en bro molekyl mellom bakteriell overflaten proteiner og vert celleoverflaten reseptorer, dermed muliggjør patogener å holde seg til overflaten av epitelceller og senere megle internalisering. I denne studien beskrive vi protokoller som kan brukes til å beregne i) binding av Vn overflaten av bakterielle celler, ii) protein-protein interaksjoner og affinitet konstanter og iii) Vn funksjonelle rolle i å gi serum motstand og forbedring av tilslutning til overflaten av verten cellene.
Flowcytometri er en kvantitativ teknikk som vanligvis brukes til å bekrefte at bakterier binde Vn. Imidlertid må Vn konsentrasjonen optimaliseres, som Vn-innbindingen behandlingskapasitet (og ulike reseptorer) kan variere avhengig av bakterie-art. I analysen beskrevet her, ble 1-100 µg/mL Vn brukt til å beregne lineær bindende og metning parametere. Sammenligning av bindende mønstre av WT Hif, Hif M10Δlph mutant og negativ kontroll E. coli celler viste en klar forskjell på en Vn konsentrasjon på 20 µg/mL (250 nM). Derfor ble denne konsentrasjonen brukt i alle flyt cytometri eksperimenter. Bruk av Vn på konsentrasjoner over metningspunkt kunne produsere falske positive signaler. Fortynning av primære og sekundære antistoffer må også separat optimaliseres for hver patogen. Maksimal fortynning av antistoffer viser et godt signal bør velges. I denne studien brukt vi 2,5% BSA som blokkerer agent. BSA er imidlertid ikke en universell blokkerer reagens egnet for alle patogener. I tilfeller der BSA ikke blokkerer uspesifikke antistoff interaksjoner kan andre blokkerer reagenser brukes som fisk gelatin. Binding av Vn på overflaten av bakteriell patogen celler er ofte formidlet av flere reseptorer21,22. Noen reseptorer har høy Vn-forpliktende tilhørighet, mens andre kan ha lav forpliktende tilhørighet. Dermed kan slettes bare genet koding en overflate protein ikke resultere i en reduksjon i Vn interaksjoner vurdert av flowcytometri. Som et alternativ til flowcytometri, kan protein bindende for bakteriell celleoverflaten undersøkes ved hjelp av en immunofluorescence analysen (IFA) eller overføring elektronmikroskop (TEM). Selv om photobleaching av fluororeagent-konjugerte antistoffer kan være problematisk i både flowcytometri og IFAs, innebærer TEM tungvint eksempel forberedelse, med betydelig risiko for introdusere gjenstander23,24. Flyt cytometri analyse er faktisk å foretrekke IFA og TEM enklere eksempel forberedelse protokoller og muligheten for testing av mange prøver innen kort tid.
Protein-protein interaksjoner i en celle gratis systemet ble analysert av ELISA (figur 2A) og BLI (figur 2B). I begge disse teknikkene var en av bindende immobilisert, en biosensor (for BLI) eller en microtiter plate (ELISA). Fordelen med å BLI og ELISA er at de aktiverer analyse av protein-protein interaksjoner i sin opprinnelige tilstand, forebygge uspesifikke interaksjoner aktive bindende område. Nytten av BLI, men kan være begrenset avhengig av immobilisering teknikken brukes. Amin kopling brukes her tilfeldig danner en amid bånd mellom alle overflate-eksponerte Amin gruppen av protein og overflaten av biosensor. Dette resulterer i immobilisering av protein molekyler på overflaten av sensoren i ulike retninger. Dette kan resultere i heterogene binding som ikke passer en 1:1 bindende kinetics modell. Dette potensielle problemet kan løses ved å velge biotin sensorer og legge til en streptavidin kode i rekombinant protein å bli immobilisert. Påliteligheten av BLI er lik som overflaten plasmon resonans (SPR). Foreningen og av molekyler kan måles i sanntid ved hjelp av enten teknikk. Imidlertid BLI enheten bruker ikke microfluidics, og er derfor lett å vedlikeholde. I tillegg kan 96 interaksjoner testes samtidig i BLI, mens bare fire eksempler på et tidspunkt kan testes ved hjelp av SPR. Det er et viktig skritt i BLI som må optimaliseres. Hvis sensorer brukes på nytt, bør gjenfødelse forhold også være optimalisert, som kan variere for hver protein-protein kompleks. I denne studien funnet 10 mM ethylenediaminetetraacetic syre egnet for sensoren gjenfødelse.
Vn rollen i bakteriell tilslutning ble testet direkte med glassflater belagt med Vn. Denne fremgangsmåten kan brukes til å analysere bindende for alle bakteriell patogen, inkludert både Gram-negative og -positive bakterier. Dette er en semiquantitative teknikk som gir rask vurdering av en patogen kapasitet for binding til Vn. For å oppnå rimelig resultat, må Vn belegg optimaliseres. I analysen beskrevet her, belegg med Vn på 1, 2 og 5 µg/mL ble undersøkt og 2 µg/mL ble funnet for å være mest egnet konsentrasjonen for eksperimenter utført i denne studien (Figur 3A). Overflødig Vn belagt på overflaten kan opprette et tykt lag som kan enkelt strippet i løpet av prøven fikse og flekker. Videre bør bakteriell kultur ikke ha store klumper av celler. Dette kan unngås ved vortexing kulturen før du legger til en aliquot på lysbildene.
Bakteriell tilslutning til overflaten av epitelceller ble undersøkt ved hjelp av en plate-count teknikk (Figur 3A). Denne analysen må også være nøye optimalisert aktivere observasjon av rollen Vn i bakteriell etterlevelse. Vn har forskjellige bindende områder for bakterier (på C-terminus) og overflate integrin reseptorer (på N-terminal RGD bindende område). Binding av Vn til integrins induserer signalisering og opptak av integrin-Vn komplekse1. Hvis slike oppfatninger er internalisert uten bakterier, vil resultatene være vanskelige å tolke. Derfor må Vn legges til i tarmepitelet monolayer på 4 ° C. Når Vn har mettet integrin reseptorer på epithelial celleoverflaten, må overflødig Vn vaskes, som gratis Vn kan blokkere bakteriell Vn-avhengige integrin bindende. I denne analysen, beregnet vi totalt bakteriell teller knyttet til epitelceller (dvs., lese-out består både overflaten-vedlagt og internalisert bakterier). Denne analysen kan utvides for å skille mellom eksterne og intracellulær bakteriell bestander av behandling med gentamicin4.
Serum bakteriedrepende analysen brukes i protokollen beskrevet her ble delvis endret fra den publisert tidligere prosedyren12,22. I analysen beskrevet her, 1,5 x 103 CFUs av Hif ble inkubert med 5% NHS i 15 min, 5 min lenger enn i tidligere beskrevet analysen (Figur 4A). Forskjellen mellom WT Hif og isogenic mutant blottet for PH ble mer tydelig på 15 min enn 10 minutter. Derfor valgte vi 15 min inkubasjonstiden for denne bestemte eksperimentet. Den bakteriedrepende effekten av serum, avhenger av serum konsentrasjonen, inkubering, og antall bakterier. Alle patogener viser en bemerkelsesverdig kapasitet for å unngå bakteriedrepende aktiviteten av serum; noen patogener kan være helt motstandsdyktig mot serum, mens andre kan være moderat motstandsdyktig eller sensitiv. Serum konsentrasjonen må derfor være optimalisert for hver bestemt patogen undersøkt. Likevel er serum drepe analysen beskrevet her begrenset til studiet av gram-negative bakterier, siden serum har ingen betydelig bakteriedrepende effekt på gram-positive celler1,5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen økonomiske interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra stiftelsen av Anna og Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. og Edla Johansson Foundation, den svenske Medical Research Council (gi nummer K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), Cancer Foundation ved Universitetet Sykehus i Malmø, Physiographical Society (Forssman's Foundation), og Skåne County Council's forskning og utvikling Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
References
- Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
- Hallstrom, T., et al. Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif. PloS one. 11 (1), 0147709 (2016).
- Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation. Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).
- Singh, B., et al. A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells. Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).
- Kohler, S., et al. Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3. Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).
- Onelli, E., Citterio, S., O'Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips. Planta. 202 (2), 188-195 (1997).
- Al-Jubair, T., et al. Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells. J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).
- Martinez-Martin, N. Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions. J. Immunol. Res. 2017, 2197615 (2017).
- Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions. Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry. Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity. Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).
- Ronander, E., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity. J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Fleury, C., et al. Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance. J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
- McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Microscopy and image analysis. Current protoc. Hum. Genet. , Chapter 4 Unit 4 4 (2005).
- Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).
- Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism. Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance. J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).
- Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors. Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).
- Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii. New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).
- Pinne, M., Haake, D. Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins. J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).
