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Immunology and Infection

बैक्टीरियल आसंजन और सीरम प्रतिरोध में Vitronectin की भूमिका का अध्ययन करने के लिए परख

Published: October 16, 2018 doi: 10.3791/54653
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Clinical Microbiology, Department of Translational Medicine, Lund University, 2Department of Molecular Biology, Umea University

Summary

इस रिपोर्ट में बैक्टीरिया बाहरी झिल्ली प्रोटीन और मानव पूरक नियामक vitronectin के बीच निस्र्पक बातचीत के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है । प्रोटोकॉल vitronectin के किसी भी जीवाणु प्रजातियों में बाध्यकारी प्रतिक्रियाओं और जैविक समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

बैक्टीरिया मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से बचने का एक साधन के रूप में पूरक नियामकों का उपयोग । यहां, हम जीवाणु कोशिका सतह पर भूमिका vitronectin अधिग्रहण के मूल्यांकन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली के विरोध में खेलता है । प्रवाह cytometry प्रयोगों की पहचान मानव प्लाज्मा vitronectin के लिए एक ligand के रूप में बैक्टीरियल रिसेप्टर बाहरी झिल्ली प्रोटीन एच के Haemophilus इंफ्लूएंजा प्रकार एफ एक एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख के लिए प्रोटीन-शुद्ध रिकॉमबिनेंट प्रोटीन एच और vitronectin, और बाध्यकारी अपनत्व के बीच प्रोटीन बातचीत विशेषताएं कार्यरत था जैव परत interferometry का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया । प्रोटीन एच करने के लिए vitronectin की बाइंडिंग के जैविक महत्व बैक्टीरियल कोशिका सतह पर मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के चोरी में की पुष्टि की थी सामांय और vitronectin-समाप्त मानव सीरम के साथ एक सीरम प्रतिरोध परख का उपयोग कर । बैक्टीरियल पालन में vitronectin के महत्व के साथ और vitronectin कोटिंग के बिना कांच स्लाइड का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था, चना धुंधला के बाद । अंत में, मानव वायुकोशीय उपकला कोशिका monolayers के लिए बैक्टीरियल आसंजन की जांच की थी. यहां वर्णित प्रोटोकॉल आसानी से रुचि के किसी भी जीवाणु प्रजातियों के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Introduction

Vitronectin (Vn) fibrinolytic प्रणाली के विनियमन के माध्यम homeostasis को बनाए रखने में शामिल एक महत्वपूर्ण मानव ग्लाइकोप्रोटीन है । Vn भी C5b6-7 परिसर गठन और C9 बहुलकीकरण के दौरान मार्ग पूरक टर्मिनल बाधा से एक पूरक नियामक के रूप में कार्य करता है. कई जीवाणु रोगजनकों के लिए Vn की भर्ती करने के लिए दिखाया गया है कोशिका की सतह के लिए विरोध का एक साधन के रूप में1,2,3पूरक । इसके अलावा, बैक्टीरिया और मेजबान उपकला कोशिका रिसेप्टर्स के बीच एक "सैंडविच" अणु के रूप में Vn कार्य करता है, जिससे पालन को बढ़ावा देने और रोगजनकों के internalization2,4,5. बैक्टीरियल कोशिका सतह के लिए Vn के बंधन अन्य वर्तमान में अज्ञात प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता है. पूरी तरह से Vn की कार्यात्मक भूमिका elucidating नली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अपवंचन में बाध्यकारी इसलिए Vn की पहचान-प्रोटीन की भर्ती की आवश्यकता होगी ।

Vn-बाइंडिंग प्रोटीन की पहचान करने में प्रारंभिक कदम परीक्षण करने के लिए है कि क्या एक रोगज़नक़ के ब्याज शुद्ध Vn बांध कर सकते हैं । cytometry प्रवाह एक सुविधाजनक और सरल करने के लिए निर्धारित है कि क्या Vn रोगज़नक़ कोशिकाओं से बंधे है विधि है । इस अध्ययन में, हम विभिंन Haemophilus इंफ्लूएंजा प्रकार एफ (Hif) नैदानिक6अलग करने के लिए Vn के बंधन का आकलन किया । यहां वर्णित विधि मात्रात्मक है और बैक्टीरिया उपभेदों की एक विस्तृत विविधता की बाध्यकारी क्षमता भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । पिछले एक अध्ययन में, हम एक Vn-बाध्यकारी प्रोटीन7के रूप में Hif के प्रोटीन एच (पीएच) की विशेषता । इसलिए वर्तमान अध्ययन में वाइल्ड-टाइप (WT) Hif और Hif M10Δ lph म्यूटेंट की Vn-बाइंडिंग क्षमता वर्णित प्रोटोकॉलों के उपयोग से तुलना की गई ।

एक बार यह निर्धारित किया जाता है कि एक रोगज़नक़ Vn बांधता है, दूसरे कदम के लिए सतह proteome की विशेषता है ताकि संभावित Vn बंधन प्रोटीन की पहचान । दृष्टिकोण की एक किस्म इस प्रयोजन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है8,9, लेकिन इन तरीकों इस रिपोर्ट में वर्णित नहीं हैं । विधि प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत की जांच के लिए सबसे उपयुक्त recombinantly एक्सप्रेस चयनित बैक्टीरिया की सतह प्रोटीन ई. कोलाई में और अपनत्व क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध करने के लिए है । यहां, हम पीएच और Vn के साथ अपनी आणविक बातचीत का उपयोग करने के लिए विधि वर्णन । रिकॉमबिनेंट पीएच और Vn के बीच बातचीत एक एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा)7 और एक हाल ही में विकसित लेबल मुक्त जैव परत interferometry (BLI)10,11के रूप में जाना जाता तकनीक का उपयोग विशेषता थे । जबकि एलिसा प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, BLI विस्तृत बातचीत के काइनेटिक मापदंडों के बारे में डेटा प्रदान करता है ।

बैक्टीरियल पालन में Vn की कार्यात्मक भूमिका का अध्ययन करने के लिए, दो अलग परख उपयोग किया जा सकता है । पहली परख यहां वर्णित Vn-लेपित गिलास सतहों के लिए बैक्टीरियल पालन के प्रत्यक्ष माप है, जबकि दूसरी परख उपकला कोशिकाओं की सतह के पालन की जांच करता है । पहली परख के लिए, कांच स्लाइड Vn के साथ लेपित थे, और WT या उत्परिवर्ती Hif उपभेदों के बंधन चना-दाग और माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया गया था । इस तकनीक को आसानी से बांध Vn12की क्षमता के आधार पर बैक्टीरिया को अलग । स्तनधारी कोशिकाओं को बैक्टीरियल आसंजन तो प्रकार द्वितीय वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं के एक monolayer पर संस्कृतिपूर्ण बैक्टीरिया को जोड़ने के द्वारा विश्लेषण किया गया था; कालोनी बनाने वाली इकाइयों (CFUs) की संख्या की गिनती करके बैक्टीरियल लगाव का आकलन किया गया । पालन और आंतरिक बैक्टीरिया उपस्थिति या Vn4,13की अनुपस्थिति में प्रतिष्ठित किया जा सकता है ।

बैक्टीरियल सीरम प्रतिरोध में Vn अधिग्रहण की भूमिका एक सीरम हत्या की परख (यानी, सीरम जीवाणुनाशक गतिविधि) का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था । सीरम प्रतिरोध में Vn अधिग्रहण के महत्व का आकलन करने के लिए, Vn समाप्त सीरम (VDS) की जीवाणुनाशक गतिविधि सामान्य मानव सीरम (एन एच एस) की तुलना में था. विधि आसानी से इस्तेमाल किया Vn-बंधन बनाम गैर बाध्यकारी बैक्टीरिया सीरम प्रतिरोध के आधार पर अलग । हम कई जीवाणु रोगजनकों के सीरम प्रतिरोध में Vn की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया4,12.

कई तरीकों होस्ट रोगज़नक़ बातचीत के अध्ययन के लिए सूचित किया गया है । यहां, हम प्रोटोकॉल का एक सेट है कि आसानी से किसी भी रोगज़नक़ के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है क्रम में रोगजनन में Vn की भूमिका का आकलन का वर्णन । हम विभिंन रोगजनकों का उपयोग कर इन प्रोटोकॉल का परीक्षण किया, और Hif इस रिपोर्ट के लिए एक उदाहरण के रूप में चुना गया था ।

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Protocol

1. एक जीवाणु सतह प्रोटीन के रूप में Vn का विश्लेषण Ligand

  1. Vn का पता लगाने-बैक्टीरियल सतह cytometry प्रवाह का उपयोग कर पर बाध्यकारी
    नोट: प्रवाह cytometry में, हम साइड स्कैटर का इस्तेमाल किया और गेट सकारात्मक घटनाओं के लिए आगे तितर बितर । Vn के साथ बातचीत की जांच करने के लिए, Hif नैदानिक अलग (एन = 10)7 एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में ई. कोलाई BL21 (DE3) के साथ एक साथ चयन किया गया (चित्रा 1ए).
    1. संस्कृति Hif नैदानिक मस्तिष्क में अलग-हार्ट इन्फ्यूश़न (BHI) मध्यम २०० rpm पर मिलाते के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 µ जी/एमएल णड और हेमीन के साथ पूरक । संस्कृति ई. कोलाई14के लिए Luria-Bertani माध्यम का प्रयोग करें । मिड-लॉग चरण में हार्वेस्ट Hif (आयुध डिपो६०० = ०.३)15, और फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) में बैक्टीरिया resuspend, पीएच ७.२, जिसमें 1% (डब्ल्यू/वी) गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) (अवरुद्ध बफर; पंजाब-BSA). 109 CFU/एमएल के निलंबन को समायोजित करें ।
    2. 5 मिलीलीटर polystyrene गोल-नीचे ट्यूबों (12 x ७५ mm2) और अवरुद्ध बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए aliquots युक्त ५ एक्स 106 CFU स्थानांतरण । कमरे के तापमान पर ३,५०० × जी में निलंबन केंद्रापसारक (आरटी)16 5 मिनट के लिए जीवाणु गोली, तो ध्यान से गोली परेशान बिना supernatant हटाने के लिए महाप्राण ।
    3. ५० μL के साथ बैक्टीरियल छर्रों resuspend २५० एनएम Vn बफर युक्त अवरुद्ध और 1 के लिए आरटी पर एच मिलाते बिना नमूनों की मशीन । मशीन के बाद, 5 मिनट के लिए ३,५०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा बैक्टीरिया गोली, तो छर्रों तीन बार पंजाब और इसी तरह के केंद्रापसारक कदम का उपयोग कर धो लो ।
    4. बैक्टीरियल गोली करने के लिए, ५० μL के प्राथमिक भेड़ विरोधी मानव Vn polyclonal एंटीबॉडी (पबों) में 1:100 कमजोर पड़ने पर पंजाब-BSA जोड़ें । आरटी में 1 ज के लिए निलंबन की मशीन है, तो पंजाब के साथ बैक्टीरिया तीन बार धोने के लिए असीम एंटीबॉडी को दूर (जैसा कि 1.1.3 कदम में वर्णित है) ।
    5. अगले, पंजाब के ५० μL जोड़ें-fluorescein isothiocyanate युक्त BSA (FITC)-संयुग्मित गधा विरोधी भेड़ पबों (1:100 कमजोर पड़ने) और आर टी पर अंधेरे में 1 एच के लिए मशीन ।
    6. केवल अवरुद्ध बफर और Vn के बिना पबों के साथ बैक्टीरिया मशीन द्वारा एक खाली नियंत्रण तैयार करते हैं ।
    7. धोने बैक्टीरिया तीन बार अवरुद्ध बफर के 1 मिलीलीटर के साथ और केंद्रापसारक द्वारा निलंबन गोली, के रूप में 1.1.2 अनुभाग में वर्णित है । अंत में, पंजाब के ३०० µ एल के साथ बैक्टीरियल गोली resuspend और प्रवाह cytometry7द्वारा विश्लेषण ।
  2. एलिसा रिकॉमबिनेंट पीएच और Vn के बीच बातचीत का विश्लेषण
    नोट: विशिष्ट बाइंडिंग को छोड़ने के लिए नियंत्रणों को शामिल करने की आवश्यकता है । मानव कारक एच (एफ एच) या C4b-बाध्यकारी प्रोटीन (C4BP) क्रमशः सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है ।
    1. Tris में ५० एनएम के लिए अलग से मानव प्रोटीन (Vn, एफ एच, और C4BP) के प्रत्येक पतला-एचसीएल, पीएच ९.० (कोटिंग बफर) । एक Polysorp microtiter प्लेट के प्रत्येक कुआं में प्रोटीन समाधान के १०० µ एल तिरस्कृत । ढक्कन के साथ प्लेटें बंद करें और 4 ° c रात भर में स्टोर (16 एच) microtiter प्लेट कुओं पर प्रोटीन के स्थिरीकरण की सुविधा के लिए ।
    2. सिंक के ऊपर उल्टा झुकाकर microtiter प्लेट से घोल को त्यागें और कुएँ को तीन बार धोकर ३०० µ के साथ पंजाब के एल/ २.५% (डब्ल्यू/वी) BSA (पंजाब-BSA) युक्त पंजाब के साथ आरटी पर 1 एच के लिए लेपित कुओं ब्लॉक ।
    3. ब्लॉकिंग समाधान निकालने के बाद, कुओं को तीन बार धोकर ३०० µ एल के साथ पंजाब के ०.०५% (वी/वी) 20 के बीच (PBST) प्रति अच्छी तरह से युक्त । जोड़ें १०० µ ५० एनएम रिकॉमबिनेंट के एल अपने-टैग प्रत्येक नमूना अच्छी तरह से पीएच और आरटी में 1 एच के लिए मशीन । नियंत्रण कुओं में, पंजाबियों के केवल १०० µ एल जोड़ें-BSA ।
      नोट: lph जीन एंकोडिंग Hif से पीएच पीसीआर द्वारा परिलक्षित किया गया था और pET26b अभिव्यक्ति वेक्टर में क्लोन है कि एक 6 × अपनी सी पर टैग-व्यक्त प्रोटीन की टर्मिनस कहते हैं । रिकॉमबिनेंट वेक्टर ई. कोलाई BL21 (DE3) में अभिव्यक्ति के लिए बदल गया था । Ni-ंत् राल रिकॉमबिनेंट प्रोटीन15शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।
    4. प्रोटीन सॉल्यूशन को त्यागें और PBST के प्रति कुआं के ३०० µ एल के साथ तीन बार कुएँ धोने से असीम प्रोटीन को दूर करें. पंजाब के १०० µ एल जोड़ें-BSA युक्त सहिजन peroxidase (एचआरपी)-संयुग्मित विरोधी अपने पबों (1:10000 कमजोर पड़ने) और आरटी में 1 एच के लिए मशीन ।
    5. 5% एसीटोन और ४५% मेथनॉल के समाधान में tetramethylbenzidine भंग करके 20 मिमी घोल तैयार करें । समाधान बी तैयार करने के लिए, एच2ओ के १,००० मिलीलीटर में साइट्रिक एसिड की १९.२ जी भंग, KOH जोड़ने के द्वारा ४.२५ के लिए पीएच समायोजित करें, तो 30% एच2ओ2के २३० µ एल जोड़ें । आरटी पर अंधेरे में दोनों समाधान की दुकान । बस का उपयोग करने से पहले, समाधान बी के ५०० µ एल हल के ९.५ मिलीलीटर के साथ एक एलिसा जांच एजेंट तैयार करने के लिए ।
    6. अच्छी तरह से PBST के ३०० µ एल के साथ कुओं तीन बार धो और एक अच्छी तरह से एलिसा पता लगाने के एजेंट के १०० µ एल जोड़कर प्रतिजन-एंटीबॉडी परिसरों का पता लगाने ।
    7. Add ५० µ l के 1 M ज2तो4/well के रिएक्शन को रोकने के लिए. एक microplate रीडर का उपयोग ४५० एनएम पर कुओं के ऑप्टिकल घनत्व को मापने ।
  3. BLI का उपयोग करते हुए रिकॉमबिनेंट पीएच और Vn के जनसंवाद कैनेटीक्स का अध्ययन
    1. अमीन पर मानव Vn-प्रतिक्रियाशील सेंसर अमीन युग्मन विधि का उपयोग कर, निर्माता के दिशा निर्देशों के अनुसार11.
    2. पंजाबियों का उपयोग करना, प्रश्नपत्र को ligand (रिकॉमबिनेंट PH) को 0 से 4 µ मीटर तक पतला करना और परिणामी समाधानों को ९६-अच्छी तरह से काला, सपाट-निचला microtiter प्लेट में स्थानांतरित करना । एक BLI साधन17का उपयोग कर 30 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोग चलाएँ.
    3. BLI डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में डेटा फ़ोल्डर लोड । ' सेंसर चयन ' विकल्प का चयन करें । फिर, घटाव के लिए ' अच्छी तरह से संदर्भ ' (Vn-पंजाब में लेपित सेंसर) का चयन करें ।
    4. ' आधारभूत में Y-अक्ष संरेखित करें ' चुनें और ' चरण सुधार और संबद्धता के लिए संरेखितकरें ' चुनें । प्रेस ' प्रक्रिया डेटा ' है कि स्वचालित रूप से विश्लेषण टैब खुल जाएगा ।
    5. विश्लेषण टैब में, वक्र फिटिंग के अंतर्गत ' संबद्धता और पृथक्करण ' विकल्प का चयन करें. मॉडल ' 1:1 बाध्यकारी और वैश्विक फिटिंग ' का चयन करें । प्रेस ' फ़िट वक्र ' और निर्यात फिटिंग डेटा17।

2. बैक्टीरियल पालन में Vn की भूमिका का लक्षण वर्णन

  1. Vn-लेपित कांच सतहों के लिए बैक्टीरियल पालन का अध्ययन
    1. एक 2 µ जी/Vn के पंजाब और प्लास्टिक में 10 µ एल समाधान एक बूंद के रूप में एक गिलास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर इस समाधान के लिए तैयार करें । ड्रॉप करने के लिए आरटी. कोट पर 30 मिनट के लिए स्लाइड पर सूखी मानव सीरम एल्ब्युमिन (HSA) के साथ एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक स्लाइड की अनुमति दें ।
    2. अतिरिक्त अनकोट प्रोटीन को दूर करने के लिए पंजाब के एक यूरिन में दो सेकंड के लिए स्लाइड की सूई देकर तीन बार प्रोटीन कोटेड ग्लास स्लाइड्स को धो लें । ताजा Hif संस्कृति के 20 मिलीलीटर जोड़ें (1.1.1 चरण में वर्णित) एक बाँझ प्लास्टिक पेट्री पकवान में और Vn-/HSA-coated ग्लास स्लाइड संस्कृति माध्यम में जलमग्न । 20 rpm पर मिलाते के साथ 1 एच के लिए ३७ ° c पर व्यंजन मशीन ।
      नोट: Hif M10 और Hif M10Δlph लिक्विड BHI मीडियम में या चॉकलेट आगर प्लेट्स पर उगाया जाता था । lph उत्परिवर्ती के लिए मध्यम 10 µ g/एमएल कनमीसिन15के साथ पूरक था ।
    3. मशीनीकरण के बाद, पंजाबियों से भरे एक चोंच में तीन बार स्लाइड को मर्ज करके किसी भी अनबाउंड बैक्टीरिया को निकालें । चना धुंधला से बैक्टीरिया की कल्पना, के रूप में वर्णित है ।
      1. प्रत्येक स्लाइड से अतिरिक्त पंजाबियों यह झुकाव और टिशू पेपर पर बढ़त को छूने से निकालें । एयर-RT पर 3-5 मिनट के लिए स्लाइड सूखी, और एक लौ पर तीन बार प्रत्येक स्लाइड गुजर द्वारा पालन बैक्टीरिया को ठीक.
      2. एक धुंधला ट्रे पर दो उंगलियों के साथ किनारों से स्लाइड पकड़ो, तो जोड़ें 3-4 बूंदें (200-300 µ एल) २.३% क्रिस्टल वायलेट समाधान की । रुको ६० एस, तो नल के पानी की एक सौंय धारा के तहत 3 के लिए स्लाइड धो-4 एस ।
      3. स्लाइड पर ०.३३% आयोडीन समाधान की 3-4 बूंदें जोड़ें । 1 मिनट रुको, तो नल का पानी की एक सौंय धारा के तहत स्लाइड कुल्ला । सोख्ता पेपर द्वारा स्लाइड्स को ध्यान से सुखाएं ।
      4. स्लाइड पर ७५% isopropyl अल्कोहल और 25% एसीटोन युक्त decolorizing समाधान के 3 – 4 बूंदें जोड़ें । 5-10 एस के बाद, नल का पानी की एक सौंय धारा के तहत स्लाइड धो लो ।
      5. मूल carbolfuchsin समाधान के 3 – 4 बूंदें (200 – 300 µ l) जोड़ें । 1 मिनट रुको, तो नल का पानी की एक सौंय धारा के तहत स्लाइड कुल्ला । सोख्ता पेपर का प्रयोग करके स्लाइड्स को सुखाएं ।
      6. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत बैक्टीरिया कल्पना, 100X आवर्धन18पर एक तेल विसर्जन उद्देश्य लेंस का चयन । Vn-और HSA-लेपित कांच सतहों पर Hif WT और उत्परिवर्ती बैक्टीरिया के पालन की तुलना करें ।
  2. उपकला कोशिकाओं को बैक्टीरिया के Vn निर्भर पालन का अध्ययन
    नोट: यह कुशल पालन परख हमारे पिछले4अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था,7।
    1. संस्कृति A549 कोशिकाओं (प्रकार द्वितीय वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं) में एक ७५-सेमी2 ऊतक संस्कृति कुप्पी माध्यम से पूरक 10% (vol/भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) (पूरा माध्यम) और 5 µ g/एमएल gentamicin 3 दिनों के लिए ३७ ° c पर 5% CO2 के साथ एक मशीन में कुप्पी मशीन ८०% तक धाराप्रवाह (प्रभावित औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं द्वारा सतह कवरेज visualizing द्वारा अनुमान लगाया जा सकता है) । निंन चार चरणों का वर्णन कैसे परख19,20के लिए उपकला कोशिकाओं को तैयार करने के लिए ।
      1. सेल monolayer को दो बार कुप्पी में कोमल घूमता हुआ पंजाब के 20 मिलीलीटर से धो लें । कुप्पी सतह से कोशिकाओं को अलग करने के लिए, सेल टुकड़ी एंजाइम समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ने और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए कुप्पी की मशीन । प्लास्टिक की सतह से कोशिकाओं के सभी अलग करने के लिए अपनी हथेली के साथ कुप्पी ठोकर. सेल के झुरमुट को फैलाने के लिए कई बार ऊपर और नीचे पिपेट ।
      2. एक ५०-मिलीलीटर बाँझ फाल्कन ट्यूब करने के लिए पूरी तरह से F12 के 18 मिलीलीटर की कुप्पी और पूरे सेल निलंबन के लिए स्थानांतरण जोड़ें । 5 मिनट के लिए आरटी पर २०० x जी में सेल निलंबन केंद्रापसारक और supernatant त्यागें । F12 पूर्ण माध्यम के 10 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend ।
      3. सेल निलंबन के 10 µ एल निकालें और यह एक Eppendorf ट्यूब में जगह है, तो Trypan ब्लू समाधान के ९० µ एल जोड़ें । नमूना एक hemocytometer में लोड (०.१ mm गहराई) coverslip रखने के बाद ।
      4. क्षेत्रों में सभी व्यवहार्य कोशिकाओं गिनती A, B, C, और D (प्रत्येक फ़ील्ड में 16 चौकोर होते हैं, और प्रत्येक वर्ग में ०.००२५ mm2का एक क्षेत्र है), फिर कक्षों की औसत संख्या ([A + B + C + D]/4) की गणना करें । निंन समीकरण का उपयोग करके प्रति milliliter कक्षों की संख्या परिकलित करें:
        व्यवहार्य कोशिकाओं/एमएल = औसत सेल गणना × 104 × कमजोर पड़ने फैक्टर20।
        नोट: यहां, कमजोर पड़ने का कारक है 10 ।
      5. सेल सस्पेंशन को पतला करने के लिए ५.० x 103 कोशिकाओं/मिलीलीटर का उपयोग कर पूरा मध्यम जिसमें 5 µ g/ml gentamicin है । एक 24-well सेल कल्चर प्लेट के प्रत्येक कुआं में ५०० μL सेल सस्पेंशन का वितरण । 5% सह2 में ३७ ° c पर थाली मशीन जब तक कोशिकाओं ९०% धाराप्रवाह हैं ।
    2. जीवाणु संक्रमण से पहले, कुओं से मध्यम निकालें और F12 मध्यम जोड़ें (FCS के बिना), तो ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
    3. आरटी पर पंजाब के ५०० µ एल के साथ सेल monolayer तीन बार धो लें । बर्फ पर प्लेट प्लेस और जोड़ें १०० µ एल पूर्व ठंडा F12 मध्यम के 10 µ g/4 ° c पर 1 एच के लिए Vn. मशीन प्लेट युक्त । नियंत्रण कुओं के लिए, केवल F12 मध्यम जोड़ें ।
    4. मशीन के बाद, pipetting द्वारा समाधान त्यागें और आरटी पर पंजाबियों की 1 मिलीलीटर के साथ दो बार सेल परत धो । नए सिरे से Hif M10 (1.1.1 कदम) F12 मध्यम (2 × 108 CFU/ इस जीवाणु निलंबन के १०० µ एल जोड़ें प्रत्येक अच्छी तरह से और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए थाली मशीन ।
      नोट: प्रत्येक अच्छी तरह से लगभग शामिल है 2 x 105 A549 कोशिकाओं. संक्रमण के लिए, 2 x 107 बैक्टीरियल CFU, १०० के संक्रमण की बहुलता के अनुरूप जोड़े गए थे ।
    5. pipetting द्वारा मध्यम निकालें और A549 उपकला कोशिकाओं को तीन बार पंजाबियों के साथ धो लें । सेल टुकड़ी समाधान के ५० µ l/अच्छी तरह जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए थाली मशीन ।
    6. अगला, एंजाइमी प्रतिक्रिया को रोकने के लिए अच्छी तरह से प्रति F12 पूरा माध्यम के ५० µ एल जोड़ें । उपकला कोशिकाओं (≈ १०० μL [यानी, पूरे मात्रा]) प्रत्येक अच्छी तरह से एक 6 मिलीलीटर गिलास चार गिलास मोतियों से युक्त ट्यूब के लिए स्थानांतरण । लाइसे 2 मिनट के लिए भंवर द्वारा आर टी पर कोशिकाओं ।
    7. पतला सेल के 10 µ l को lysate १००-गुना करके lysate के 10 µ l को जोड़कर F12 मीडियम की ९९० µ l प्लेट 10 एक चॉकलेट आगर प्लेट पर पतला नमूना के µ एल ।
    8. रात भर ३७ डिग्री सेल्सियस पर चॉकलेट आगर प्लेट की मशीन, तो कालोनियों गिनती । प्रत्येक कॉलोनी एक CFU का प्रतिनिधित्व करती है ।

3. मानव सीरम के जीवाणुनाशक गतिविधि के लिए Vn-निर्भर प्रतिरोध का विश्लेषण

  1. एक वाणिज्यिक स्रोत से एन एस खरीद । पहले वर्णित12के रूप में VDS तैयार करें । १८० एनएम Vn कि एन एच एस में मौजूद Vn के बराबर है के साथ VDS भरपाई ।
  2. गर्मी निष्क्रिय सीरम (अपने) ५६ ° c में 30 मिनट के लिए हीटिंग एन एस के लिए पूरक प्रोटीन को निष्क्रिय करके तैयार करते हैं ।
    नोट: इष्टतम सीरम एकाग्रता (5%) और गर्मी के समय (15 min) परख के लिए कदम में वर्णित 3.3 – 3.7 Hif15के लिए empirically निर्धारित किया गया; ये पैरामीटर अन्य जीवाणु रोगजनकों के लिए भिन्न हो सकते हैं.
  3. संस्कृति बैक्टीरिया (इस मामले में, Hif M10 और उत्परिवर्ती Hif M10Δlph) मध्य लॉग चरण के लिए (आयुध डिपो६०० = ०.३) । 10 मिनट के लिए ३,५०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा गोली बैक्टीरिया ।
  4. डेक्सट्रोज जिलेटिन वेरोनल बफर की 1 मात्रा के साथ बैक्टीरियल गोली resuspend (DGVB+ +, पीएच ७.३) २.५% युक्त (डब्ल्यू/वी) ग्लूकोज, 2 मिमी MgCl2, ०.१५ मिमी CaCl2, और ०.१% (wt/
  5. जोड़ें १.५ x 10 बैक्टीरिया के3 CFU के लिए १०० µ l के DGVB+ युक्त 5% सीरम (एन एच एस, अपने, VDS, या VDS + 180 एनएम Vn). ३०० rpm पर मिलाते के साथ 15 मिनट के लिए ३७ ° c पर नमूना मशीन ।
  6. 0 मिनट (t0 नमूना) और 15 मिनट (टीटी नमूना) और चॉकलेट पर प्लेट आगर पर प्रतिक्रिया मिश्रण से एक 10 µ एल aliquot निकालें । रात भर ३७ डिग्री सेल्सियस पर थाली मशीन ।
  7. मशीन के बाद, प्लेट पर दिखाई दे कालोनियों गिनती । बैक्टीरिया के प्रतिशत की गणना12 निंनलिखित समीकरण का उपयोग कर: (टी टी परCFU)/(टी0पर CFU) × १०० ।

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Representative Results

Vn-बैक्टीरिया की सतह के लिए बाध्यकारी प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित किया गया था । इस अध् ययन में परीक्षण किए गए सभी Hif नैदानिक पृथक कक्ष सतह पर Vn भर्ती किए गए हैं । सेल की सतह के साथ Vn की कोई बातचीत ई. कोलाई नकारात्मक नियंत्रण तनाव (चित्रा 1ए) के लिए मनाया गया । चित्रा 1बीमें दिखाया गया है, पीएच Hif कोशिकाओं की सतह पर एक प्रमुख Vn-बाध्यकारी प्रोटीन है । WT Hif तनाव M10 द्वारा Vn के बंधन आबादी में एक बदलाव का कारण बना है, जबकि Hif M10Δ lph बांध नहीं Vn और नियंत्रण के समान दिखाई दिया ।

पीएच और Vn के बीच प्रोटीन प्रोटीन बातचीत एलिसा और BLI द्वारा अनुमानित थे । रिकॉमबिनेंट पीएच मानव कारक एच, Vn, और C4BP (नकारात्मक नियंत्रण) microtiter एलिसा प्लेटों के कुओं पर लेपित के साथ बांध करने की अनुमति दी थी । असीम पीएच एक विरोधी अपने पबों का उपयोग कर अनुमान लगाया गया था । परिणाम स्पष्ट रूप से पीएच और Vn और फैक्टर एच, C4BP की तुलना में (चित्रा 2ए) के बीच एक महत्वपूर्ण बातचीत का संकेत दिया । पीएच और Vn के बीच बातचीत BLI का उपयोग कर वास्तविक समय में अनुमान लगाया गया । चित्रा 2 बी Vn लेपित संवेदक सतह के लिए पीएच बाध्यकारी प्रतिक्रिया curves दिखाता है । बाध्यकारी संबध (इस मामले में, केडी = २.२ µ m) को स्थिर करने के लिए डेटा फिटिंग द्वारा अनुमान था-राज्य बाध्यकारी कैनेटीक्स ।

सेल सतह पर पीएच की अभिव्यक्ति की कमी बैक्टीरिया (Hif M10Δlph) Vn के लिए कम पालन का प्रदर्शन किया-लेपित ग्लास WT कोशिकाओं की तुलना में सतहों (चित्रा 3ए) । इसके अलावा, उपकला कोशिकाओं की सतह पर Vn की उपस्थिति काफी Hif (चित्रा 3बी) के पालन को बढ़ाया. इन परिणामों से संकेत मिलता है कि पीएच-Vn बातचीत बैक्टीरियल पालन करने के लिए महत्वपूर्ण योगदान दिया ।

Vn एक प्रसिद्ध पूरक अवरोधक है । पूरक बाधा गतिविधि का अनुमान लगाने के लिए, सीरम मध्यस्थता हत्या की उपस्थिति और Vn. WT Hif कोशिकाओं की अनुपस्थिति में जांच की थी M10Δlph उत्परिवर्ती कोशिकाओं की तुलना में उच्च सीरम प्रतिरोध का प्रदर्शन किया । उनकी (चित्रा 4ए) की मौजूदगी में कोई बैक्टीरिया नहीं मारा गया । दिलचस्प है, WT Hif VDS में कम अस्तित्व का प्रदर्शन किया, और Vn की भरपाई बैक्टीरियल अस्तित्व में वृद्धि हुई । हालांकि, Hif M10Δlph तनाव Vn कमी का जवाब नहीं था क्योंकि यह सेल सतह (चित्रा 4बी) के लिए Vn भर्ती नहीं कर सका । इन परिणामों को स्पष्ट रूप से प्रदर्शित करता है कि Vn एक महत्वपूर्ण मेजबान कारक है कि पूरक मध्यस्थता हत्या से बैक्टीरिया की रक्षा करता है (चित्रा 4ए-बी).

Figure 1
चित्रा 1 : Haemophilus इंफ्लूएंजा सीरोटाइप f बाँध Vn वाया भूतले-व्यक्ती पीएच. (क) Hif नैदानिक अलग से कोशिकाओं को Vn के बंधन दिखा प्रवाह cytometry परिणाम. प्रत्येक नैदानिक अलग (5 x 106 CFU) २५० एनएम मानव Vn. Bound ligand एक भेड़ विरोधी Vn पबों और FITC-संयुग्मित गधा विरोधी भेड़ माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग कर पाया गया था के साथ मशीन था । ई कोलाई BL21 (DE3) नकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल किया गया था । डेटा तीन अलग प्रयोगों में तपसिल विश्लेषण से मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं, और त्रुटि सलाखों एसडी प्रतिनिधित्व करते हैं. (ख) WT Hif M10 और पीएच-विलोपन Hif M10Δ की सतह के लिए Vn की बाइंडिंग का प्रदर्शन हिस्टोग्राम cytometry प्रवाह. lph उत्परिवर्ती । तीन पृथक प्रयोगों में से एक से प्रतिनिधि डेटा दिखाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : रिकॉमबिनेंट पीएच Vn को बांधता है । (क) एलिसा Vn, एफ एच, और C4BP को रिकॉमबिनेंट पीएच के बंधन का प्रदर्शन परिणाम । एफ एच एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था, जबकि C4BP एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए प्रोटीन बातचीत, Vn, एफ एच, और C4BP equimolar (५० एनएम) microtiter प्लेटों के कुओं पर सांद्रता में लेपित थे । अगले, ५० एनएम रिकॉमबिनेंट पीएच-His6x जोड़ा गया था । असीम पीएच एक एचआरपी-संयुग्मित विरोधी अपने पबों का उपयोग कर पाया गया था । दिखाया डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों से तपसिल विश्लेषण का मतलब है, और त्रुटि पट्टियां एसडी. * * *, P≤ ०.००१ संकेत मिलता है । (ख) Vn को पीएच बाइंडिंग का BLIanalysis: रिकॉमबिनेंट Vn को AR2G सेंसर्स पर मैटीरियल लगाया गया था, और कैनेटीक्स के लिए ph (0.25-4 µ m) के बाइंडिंग Vn का प्रयोग दर्ज किया गया । संतुलन संबंध लगातार संतुलन में प्रत्येक एकाग्रता के लिए प्राप्त संकेतों का उपयोग कर की गणना की थी, और डेटा स्थिर राज्य कैनेटीक्स के अनुसार लगे थे । प्रयोग तीन बार दोहराया गया, और एक प्रतिनिधि डेटासेट दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : पीएच और Vn के बीच बातचीत कांच सतहों और उपकला कोशिकाओं के लिए बैक्टीरियल पालन को बढ़ाता है । (क) प्रकाश सूक्ष्म Vn-लेपित कांच स्लाइड को Hif का पालन दिखा छवियां । बैक्टीरिया ग्राम धुंधला द्वारा visualized थे । तीन स्वतंत्र प्रयोगों में से एक से प्रतिनिधि छवियों को दिखाया जाता है । यह पैनल पहले इम्यूनोलॉजी7 के जर्नलमें प्रकाशित किया गया था और यहां Immunologists के अमेरिकन एसोसिएशन से अनुमति के साथ reproduced है । (ख) WT Hif M10 कोशिकाओं के पालन की उपस्थिति और Vn की अनुपस्थिति में उपकला कोशिकाओं A549, तीन स्वतंत्र प्रयोगों से तपसिल विश्लेषण के साधन की साजिश रची है, और त्रुटि सलाखों एसडी. *, पी ≤ ०.०५ का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : Vn Hif सेल सतह के लिए भर्ती सीरम से बैक्टीरिया की मध्यस्थता की हत्या की रक्षा । (क) WT Hif M10 और उत्परिवर्ती Hif M10Δlph 5% एन एच एस या अपने में 15 मिनट के लिए मशीन थे । (ख) Hif M10 और Hif M10Δlph के प्रतिरोध को 5% जीवाणुनाशक में VDS प्रभाव और VDS २५० एनएम के साथ पूरक शुद्ध Vn । डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों से तपसिल विश्लेषण के साधन का प्रतिनिधित्व करते हैं, और त्रुटि सलाखों एसडी का संकेत. * * *, पी ≤ ०.००१; एनएस, महत्वपूर्ण नहीं है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

बैक्टीरियल रोगजनकों सेल सतह के लिए भर्ती Vn और पूरक कारकों और झिल्ली हमले परिसर2के पूरा होने की स्थिति को रोकने के लिए इस नियामक का उपयोग । Vn भी बैक्टीरिया की सतह प्रोटीन और मेजबान सेल सतह रिसेप्टर्स के बीच एक पुल अणु के रूप में कार्य करता है, इस प्रकार रोगज़नक़ों को सक्षम करने के लिए उपकला कोशिकाओं की सतह का पालन करें और बाद में मध्यस्थता internalization. इस अध्ययन में, हम प्रोटोकॉल है कि मैं अनुमान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का वर्णन) बैक्टीरियल कोशिकाओं की सतह के लिए Vn के बंधन, द्वितीय) प्रोटीन प्रोटीन बातचीत और समानता स्थिरांक, और iii) सीरम प्रतिरोध और की वृद्धि प्रदान करने में Vn की कार्यात्मक भूमिका मेजबान कोशिकाओं की सतह के लिए पालन ।

प्रवाह cytometry एक मात्रात्मक तकनीक सामांयतः सत्यापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि बैक्टीरिया बांध Vn । हालांकि, Vn एकाग्रता अनुकूलित किया जाना चाहिए, के रूप में Vn-बाध्यकारी क्षमता (और विभिंन रिसेप्टर्स) जीवाणु प्रजातियों के आधार पर अलग कर सकते हैं । यहां वर्णित परख में, 1 – 100 µ g/Vn के एमएल रैखिक बाध्यकारी और संतृप्ति मापदंडों का अनुमान करने के लिए इस्तेमाल किया गया । WT Hif, Hif M10Δlph उत्परिवर्ती, और नकारात्मक नियंत्रण ई. कोलाई कोशिकाओं के बाध्यकारी पैटर्न की तुलना 20 Vn g/एमएल (२५० एनएम) के एक µ एकाग्रता में एक स्पष्ट अंतर दिखाई । इसलिए, यह एकाग्रता सभी प्रवाह cytometry प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया था । संतृप्ति बिंदु से ऊपर सांद्रता पर Vn का उपयोग झूठी-सकारात्मक संकेतों का उत्पादन कर सकता है । प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने भी अलग से प्रत्येक रोगज़नक़ के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । एक अच्छा संकेत दिखा एंटीबॉडी के अधिकतम कमजोर पड़ने चुना जाना चाहिए । इस अध्ययन में, हम एक अवरुद्ध एजेंट के रूप में २.५% BSA का इस्तेमाल किया । हालांकि, BSA सभी रोगजनकों के लिए उपयुक्त एक सार्वभौमिक अवरुद्ध एजेंट नहीं है । उन मामलों में जिनमें BSA विशिष्ट एंटीबॉडी इंटरैक्शन को अवरोधित नहीं करता, अन्य ब्लॉकिंग रिएजेंट का उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि मछली जिलेटिन. बैक्टीरियल रोगज़नक़ कोशिकाओं की सतह के लिए Vn के बंधन अक्सर कई रिसेप्टर्स द्वारा मध्यस्थता है21,22. कुछ रिसेप्टर्स उच्च Vn बंधन संबंध है, जबकि दूसरों को कम बाध्यकारी संबध प्रदर्शन कर सकते हैं. इस प्रकार, केवल एक जीन एक सतह प्रोटीन एंकोडिंग के विलोपन Vn प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन बातचीत में कमी में परिणाम नहीं हो सकता है । cytometry प्रवाह के लिए एक विकल्प के रूप में, जीवाणु कोशिका सतह पर प्रोटीन बाध्यकारी एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख (आइएफए) या संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) का उपयोग कर जांच की जा सकती है । हालांकि fluororeagent के photobleaching-संयुग्मित एंटीबॉडी दोनों प्रवाह cytometry और IFAs में समस्याग्रस्त किया जा सकता है, उनि23,24कलाकृतियों शुरू करने का पर्याप्त जोखिम के साथ, बोझिल नमूना तैयारी शामिल है । प्रवाह cytometry विश्लेषण वास्तव में सरल नमूना तैयारी प्रोटोकॉल और एक छोटी समय सीमा के भीतर कई नमूनों के परीक्षण की संभावना के कारण आइएफए और उनि के लिए बेहतर है ।

एक सेल मुफ्त प्रणाली में प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत एलिसा (चित्रा 2ए) और BLI (चित्रा 2बी) द्वारा विश्लेषण किया गया । इन दोनों तकनीकों में से एक, बाध्यकारी भागीदारों में से एक, या तो एक BLI (के लिए) या एक microtiter प्लेट (एलिसा) पर स्थिर था । BLI और एलिसा का लाभ यह है कि वे अपने पैतृक राज्य में प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत के विश्लेषण को सक्षम, सक्रिय बाध्यकारी साइट के बाहर गैर विशिष्ट बातचीत को रोकने । BLI की उपयोगिता, तथापि, उपयोग स्थिरीकरण तकनीक के आधार पर सीमित किया जा सकता है । अमीन युग्मन प्रक्रिया यहां इस्तेमाल किया बेतरतीब ढंग से किसी भी सतह उजागर प्रोटीन के अमीन समूह और के बीच एक बीच बंधन के बीच संबंध है । विभिंन झुकाव में सेंसर की सतह पर प्रोटीन अणुओं के स्थिरीकरण में यह परिणाम है । यह विषम बाइंडिंग जो एक 1:1 बाइंडिंग कैनेटीक्स मॉडल फ़िट नहीं में परिणाम कर सकते हैं । इस संभावित समस्या का समाधान बायोटिन सेंसरों का चयन करके और रिकॉमबिनेंट प्रोटीन में एक streptavidin टैग को जोड़ने के लिए किया जा सकता है । BLI की विश्वसनीयता सतह plasmon अनुनाद (SPR) के समान है । संघ और अणुओं की पृथक्करण वास्तविक समय में या तो तकनीक का उपयोग कर मापा जा सकता है । हालांकि, BLI डिवाइस microfluidics का उपयोग नहीं करता, और इसलिए बनाए रखने के लिए आसान है । इसके अलावा, ९६ बातचीत BLI में एक साथ परीक्षण किया जा सकता है, जबकि एक समय में केवल चार नमूने SPR का उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता है. वहां BLI में एक और महत्वपूर्ण कदम है कि अनुकूलित किया जाना चाहिए है । यदि सेंसर पुनः उपयोग किया जाता है, पुनर्जनन शर्तों भी अनुकूलित किया जाना चाहिए, के रूप में है कि प्रत्येक प्रोटीन-प्रोटीन परिसर के लिए भिंन हो सकता है । इस अध्ययन में 10 एमएम ethylenediaminetetraacetic एसिड सेंसर पुनर्जनन के लिए उपयुक्त पाया गया ।

बैक्टीरियल पालन में Vn की भूमिका सीधे कांच Vn के साथ लेपित सतहों का उपयोग कर परीक्षण किया गया । यह दृष्टिकोण दोनों ग्राम नकारात्मक और सकारात्मक बैक्टीरिया सहित किसी भी जीवाणु रोगज़नक़ के लिए बाध्यकारी विश्लेषण करने के लिए नियोजित किया जा सकता है । यह एक semiquantitative तकनीक है कि Vn के लिए बाध्यकारी के लिए एक रोगज़नक़ की क्षमता का तेजी से आकलन प्रदान करता है । उचित परिणाम प्राप्त करने के लिए, Vn कोटिंग अनुकूलित किया जाना चाहिए । यहां वर्णित परख में, Vn के साथ कोटिंग पर 1, 2, और 5 µ g/एमएल की जांच की थी, और 2 µ g/एमएल पाया गया था इस अध्ययन में किए गए प्रयोगों के लिए सबसे उपयुक्त एकाग्रता (चित्रा 3ए) । अतिरिक्त Vn सतह पर लेपित एक मोटी परत है कि आसानी से बंद नमूना फिक्सिंग और धुंधला के दौरान छीन सकता है बना सकते हैं । इसके अलावा, बैक्टीरियल संस्कृति कोशिकाओं के बड़े झुरमुट नहीं होना चाहिए; इस aliquot को स्लाइड में जोड़ने से पहले संस्कृति को भंवरित करके टाला जा सकता है ।

उपकला कोशिकाओं की सतह के लिए बैक्टीरियल पालन एक थाली गिनती तकनीक (चित्रा 3ए) का उपयोग कर जांच की थी. इस परख भी सावधानी से बैक्टीरियल पालन में Vn की भूमिका का अवलोकन सक्षम अनुकूलित किया जाना चाहिए । Vn बैक्टीरिया के लिए अलग बाध्यकारी साइटों (सी पर टर्मिनस) और सेल सतह integrin रिसेप्टर्स (एन-टर्मिनल RGD बंधन साइट पर) है । integrins के लिए Vn के बंधन संकेतन और integrin-Vn परिसर1के ऊपर ले लाती है । यदि इस तरह के परिसरों बैक्टीरिया के बिना आंतरिक रहे हैं, परिणाम की व्याख्या करने के लिए मुश्किल हो जाएगा । इसलिए, Vn 4 डिग्री सेल्सियस पर उपकला कोशिका monolayer में जोड़ा जाना चाहिए. एक बार Vn उपकला कोशिका सतह पर integrin रिसेप्टर्स संतृप्त है, अतिरिक्त Vn बंद धोया जाना चाहिए, के रूप में मुक्त Vn जीवाणु Vn-निर्भर integrin बंधन ब्लॉक कर सकते हैं. इस परख में, हम कुल जीवाणु गिनती उपकला कोशिकाओं के साथ जुड़े (यानी, पढ़ने के बाहर दोनों सतह संलग्न और आंतरिक बैक्टीरिया शामिल) का अनुमान है । इस परख के लिए gentamicin4के साथ इलाज के द्वारा बाहरी और intracellular बैक्टीरियल आबादी के बीच अंतर बढ़ाया जा सकता है ।

सीरम जीवाणुनाशक परख यहां वर्णित प्रोटोकॉल में इस्तेमाल आंशिक रूप से पहले से प्रकाशित प्रक्रिया12,22से संशोधित किया गया था । परख में यहां वर्णित है, १.५ x 10 Hif के3 CFUs 15 मिनट के लिए 5% एन एच एस के साथ, 5 मिनट पहले वर्णित परख (चित्रा 4ए) में अब से मशीन थे । WT Hif और पीएच के isogenic उत्परिवर्ती रहित के बीच अंतर 10 मिनट की तुलना में 15 मिनट में अधिक स्पष्ट था । इसलिए, हम इस विशेष प्रयोग के लिए 15 मिनट की गर्मी की अवधि का चयन किया । सीरम के जीवाणुनाशक प्रभाव सीरम एकाग्रता, मशीन के समय, और बैक्टीरिया की संख्या पर निर्भर करते हैं । सभी रोगजनकों सीरम के जीवाणुनाशक गतिविधि से बचने के लिए एक उल्लेखनीय क्षमता का प्रदर्शन; कुछ रोगजनकों सीरम के लिए पूरी तरह से प्रतिरोधी हो सकता है, जबकि दूसरों को मामूली प्रतिरोधी या संवेदनशील हो सकता है । सीरम एकाग्रता इसलिए प्रत्येक विशिष्ट रोगज़नक़ के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए की जांच की । फिर भी, सीरम हत्या परख यहां वर्णित ग्राम नकारात्मक जीवाणुओं के अध्ययन तक ही सीमित है, के बाद से सीरम ग्राम पर कोई महत्वपूर्ण जीवाणुनाशक प्रभाव-सकारात्मक कोशिकाओं1,5है ।

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Disclosures

लेखकों के हित का कोई वित्तीय संघर्ष नहीं है.

Acknowledgments

यह काम अन्ना और एडविन बर्जर, लार्स Hierta, O.E. और एदला जोहानसन फाउंडेशन, स्वीडिश चिकित्सा अनुसंधान परिषद (अनुदान संख्या K2015-57X-03163-43-4, www.vr.se), विश्वविद्यालय में कैंसर फाउंडेशन की नींव से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया माल्मो में अस्पताल, Physiographical सोसायटी (Forssman फाउंडेशन), और स्केन काउंटी परिषद के अनुसंधान और विकास फाउंडेशन ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL thermomixter Eppendorf 5355 dry block heating and cooling shaker
5 mL polystyrene round-bottom tube  BD Falcon 60819-138 12 × 75 mm style
5% CO2 supplied incubator  Thermo Scientific  BBD6220
6 mL polystyrene round-bottom tube  VWR 89000-478 12 × 75 mm style with cap
24-well plates BD Falcon 08-772-1H Cell culture grade
30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution Sigma-Aldrich H1009-100ML Laboratory analysis grade
75 cm2 tissue culture flask BD Falcon BD353136 Vented
96 well black flat bottom plate Greiner Bio-One 655090 Tissue culture treated µClear black plates
A549 Cell Line human Sigma-Aldrich 86012804-1VL
Cell detachment enzyme (Accutase)  Sigma-Aldrich A6964-500ML Cell Culture Grade
AR2G sensors Pall Life Science 18-5095 Sensor to immobilized protein by amino coupling 
Acetone VWR 97064-786 Analysis grade
Bovine Serum Albumins (BSA) Sigma-Aldrich A2058 Suitable for cell culture
Bibulous paper  VWR 28511-007
Bio-layer interferometer Pall Life Science FB-50258 Bilayer interferometry measuring equipment
Crystal violet solution Sigma-Aldrich HT90132-1L
C4BP (C4b binding protein) Complement Technology, Inc. A109 Bought as Frozen liquid form
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670-500G
Carbol-fuchsin solution Sigma-Aldrich HT8018-250ML
Citric acid Sigma-Aldrich 251275-500G American Chemical Society (ACS) grade
Decolorizing solution Sigma-Aldrich 75482-250ML-F
E. coli host (E. coli BL21) Novagen 69450-3 Protein expression host
F12 medium Sigma-Aldrich D6421 Cell Culture Grade
Flow cytometer  BD Biosciences 651154 Cell analysis grade for research applications 
Fetal Calf Serum (FCS) Sigma-Aldrich 12003C Suitable for cell culture
Normal human serum (NHS) Complement Technology, Inc. NHS Pooled human serum
FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies  AbD Serotec STAR88F Polyclonal
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397 Cell culture grade
Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 Suitable for cell culture
Hemocytometer Marienfeld 640210
HRP-conjugated anti-His tag antibodies Abcam ab1269 Polyclonal
Human factor H Complement Technology, Inc. A137 Bought as Frozen liquid form
C4BP Complement Technology, Inc. A109 Frozen solution
Human serum albumin Sigma-Aldrich A1653-10G lyophilized powder
Histidine affinity resin column (HisTrap HP) GE Health Care Life Science 17-5247-01 Columns prepacked with Ni Sepharose
His-tagged PH Recombinantly expressed and purified in our lab
Iodine solution Sigma-Aldrich HT902-8FOZ
Methanol VWR BDH1135-1LP Analysis grade
 Microscope Olympus IX73 Inverted microscope
Microscope slides Sigma-Aldrich S8902 plain, size 25 mm × 75 mm 
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266-1KG
Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) Novagen 69862-3 DNA vector
Polysorb microtitre plates  Sigma-Aldrich M9410 For ELISA
Potassium hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich 6009 American Chemical Society (ACS) grade
Sheep anti-human Vn antibodies AbD Serotec AHP396 Polyclonal
Shaker  Stuart Scientific STR6 Platform shaker
Tissue culture flask BD Falcon 3175167 75 cm2
 Thermomixer  Sigma-Aldrich T3317 Dry block heating and cooling shaker
Tetramethylbenzidine Sigma-Aldrich 860336-100MG ELISA grade
Vitronectin (Vn) from human plasma Sigma-Aldrich V8379-50UG cell culture grade

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References

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