Summary
Denne rapport beskriver protokoller for kendetegner interaktioner mellem bakteriel ydre Membranproteiner og menneskelige supplement regulator vitronectin. Protokollerne kan bruges til at studere den bindende reaktioner og biologiske funktion af vitronectin i enhver bakteriearter.
Abstract
Bakterier udnytte supplement regulerende myndigheder som et middel til at unddrage sig vært immunresponset. Her beskriver vi protokoller for at vurdere den rolle vitronectin erhvervelse på bakteriel celle overflade spiller i modstand på vært immunsystemet. Flow flowcytometri eksperimenter identificeret humant plasma vitronectin som en ligand for bakteriel receptor ydre membran protein H af Haemophilus influenzae type f. En enzym-forbundet immunosorbent assay var ansat til at karakterisere protein-protein interaktioner mellem renset rekombinante protein H og vitronectin, og bindende affinitet blev vurderet ved hjælp af bio-lag interferometri. Den biologiske betydning af bindingen af vitronectin til protein H på bakteriel celleoverfladen i unddragelse af immunrespons vært blev bekræftet ved hjælp af en serum modstand assay med normale og vitronectin-forarmet humant serum. Betydningen af vitronectin i bakteriel tilslutning blev analyseret ved hjælp af glas lysbilleder, med og uden vitronectin belægning, efterfulgt af Gram farvning. Endelig, bakteriel adhæsion til menneskelige alveolær epitelcelle encellelag blev undersøgt. De protokoller er beskrevet her kan tilpasses nemt til studiet af enhver bakteriel arter af interesse.
Introduction
Vitronectin (Vn) er en vigtig menneskelige glycoprotein involveret i at opretholde homeostase via regulering af det fibrinolytiske system. VN også fungerer som et supplement regulator ved at hæmme terminal komplement pathway under C5b6-7 kompleks dannelse og C9 polymerisering. Flere bakterielle patogener har vist at rekruttere Vn til cellens overflade som et middel til at modstå supplement deposition1,2,3. Derudover fungerer Vn som en "sandwich" molekyle mellem bakterier og vært epitelcelle receptorer, dermed fremme overholdelse og internalisering af patogener2,4,5. Bindingen af Vn til bakteriel cellens overflade er medieret af andre i øjeblikket uidentificerede proteiner. Fuldt belyse Vn-bindingen i unddragelse af immunrespons slange funktionelle rolle vil derfor kræve identifikation af Vn-rekruttering proteiner.
Det første skridt i at identificere Vn-bindende proteiner er at teste, om en patogen interesse kan binde renset Vn. flowcytometri er en praktisk og enkel metode til at afgøre, om Vn er bundet til patogen celler. I denne undersøgelse vurderet vi bindingen af Vn til forskellige Haemophilus influenzae type f (Hif) kliniske isolater6. Den metode beskrevet heri er kvantitative og kan bruges til at skelne den bindende kapacitet af en bred vifte af bakterielle stammer. I en tidligere undersøgelse karakteriseret vi protein H (PH) i Hif som en Vn-bindende protein7. Derfor, i den nuværende undersøgelse, Vn-bindende potentialet i wild-type (WT) Hif og Hif M10Δlph mutanter blev sammenlignet ved hjælp af protokollerne beskrevet.
Når det er fastslået, at en patogen binder Vn, er det andet skridt at karakterisere overflade proteomet for at identificere potentielle Vn-bindende proteiner. En lang række metoder kan bruges til dette formål8,9, men disse metoder er ikke beskrevet i denne betænkning. Den metode, der er mest velegnet til at undersøge protein-protein interaktioner er recombinantly express udvalgte bakteriel overflade proteiner i E. coli og rense af affinitet kromatografi. Her bruger vi PH og dens molekylære interaktion med Vn for at illustrere metoden. Interaktioner mellem rekombinant PH og Vn var karakteriseret ved hjælp af en enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA)7 og en nyligt udviklede etiket-gratis teknik kendt som bio-lag interferometri (BLI)10,11. Mens ringprøver kan bruges til at bekræfte protein-protein interaktioner, indeholder BLI detaljerede data om de kinetiske parametre af interaktioner.
For at studere Vn funktionelle rolle i bakteriel tilslutning, kan to forskellige assays udnyttes. Den første assay beskrevet her er direkte måling af bakteriel tilslutning til Vn-belagt glasoverflader, mens den anden analyse undersøger tilslutning til overfladen af epitelceller. For det første assay, glas dias var belagt med Vn, og bindingen af WT eller Hif mutantstammen blev vurderet af Gram-pletten og mikroskopi. Denne teknik adskiller let bakterier baseret på evnen til at binde Vn12. Bakteriel adhæsion til pattedyrceller blev derefter analyseret ved at tilføje kulturperler bakterier på en éncellelag af type II alveolær epitelceller; bakteriel vedhæftet fil blev vurderet ved at tælle antallet af kolonidannende enheder (CFUs). Overholdt og internaliseret bakterier kan skelnes i tilstedeværelse eller fravær af Vn4,13.
Rollen af Vn erhvervelse i bakteriel serum modstand blev evalueret ved hjælp af en serum drab assay (dvs., serum bakteriedræbende aktivitet). For at vurdere betydningen af Vn erhvervelse i serum modstand, var det bakteriedræbende aktivitet af Vn-forarmet serum (VDS) sammenlignet med normale humant serum (NHS). Metoden anvendes let adskiller Vn-bindende versus ikke-bindende bakterier baseret på serum modstand. Vi brugte denne metode til at studere Vn rolle i serum modstand på flere bakterielle patogener4,12.
Talrige metoder er blevet rapporteret til at studere vært-patogen interaktioner. Her, beskriver vi et sæt af protokoller, der kan tilpasses nemt til studiet af enhver patogen for at vurdere Vn rolle i patogenesen. Vi har testet disse protokoller ved hjælp af forskellige patogener, og Hif blev valgt som et eksempel for denne betænkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. analyse af Vn som en bakteriel overflade Protein Ligand
-
Påvisning af Vn-bindende på bakteriel overfladen ved hjælp af flowcytometri
Bemærk: I flowcytometri, vi brugte side scatter og forward scatter til gate positive begivenheder. For at undersøge interaktioner med Vn, Hif kliniske isolater (n = 10)7 blev valgt sammen med E. coli BL21 (DE3) som en negativ kontrol (fig. 1A).- Kultur Hif kliniske isolater i hjernen-hjerte infusion (BHI) medium suppleret med 10 µg/mL NAD og Pia på 37 ° C under omrystning på 200 rpm. Bruge Luria-Bertani medium til kultur, E. coli14. Høste Hif på midten log fase (OD600 = 0,3)15, og pelleten bakterier i fosfatbufferet saltopløsning (PBS), pH 7,2, der indeholder 1% (w/v) bovint serumalbumin (BSA) (blokerende buffer; PBS-BSA). Justere suspension til 109 CFU/mL.
- Overføre de delprøver, der indeholder 5 x 106 CFU til 5 mL polystyren runde-nederste rør (12 x 75 mm2) og tilsættes 1 mL blokerende buffer. Der centrifugeres suspension på 3.500 × g ved stuetemperatur (RT)16 for 5 min for at pellet bakterier, så omhyggeligt Aspirér for at fjerne supernatanten uden at forstyrre pelleten.
- Resuspend bakteriel pellets med 50 μL blokerende buffer der indeholder 250 nM Vn og inkuberes prøver for 1 h i RT uden rystelser. Efter inkubationen pellet bakterier ved centrifugering ved 3.500 x g i 5 min, så vask pellets, tre gange med PBS og lignende centrifugering trin.
- Den bakterielle pellet, tilføje 50 μL af primære får antihumant Vn polyklonale antistoffer (Sasja) på 1: 100 fortynding i PBS-BSA. Inkuber suspension for 1 h i RT og derefter vaske bakterierne tre gange med PBS fjerne ubundne antistoffer (som beskrevet i trin 1.1.3).
- Dernæst tilsættes 50 μL af PBS-BSA indeholdende fluorescein isothiocyanat (FITC)-konjugeret æsel anti-får Sasja (1: 100 fortynding) og inkuberes ved RT i 1 h i mørke.
- Forbered et tomt kontrolelement ved at inkubere bakterier med blokerende buffer kun og Sasja uden Vn.
- Vaske bakterier tre gange med 1 mL blokerende buffer og pellet suspensionen ved centrifugering, som beskrevet i afsnit 1.1.2. Endelig, bakteriel resuspenderes med 300 µL af PBS og analysere ved flow flowcytometri7.
-
ELISA analyse af samspillet mellem rekombinant PH og Vn
Bemærk: Kontroller skal medtages for at udelukke uspecifik bindende. Menneskelige faktor H (FH) eller C4b-bindende protein (C4BP) bruges som positive og negative kontroller, henholdsvis.- Fortynd hver af de humane proteiner (Vn, FH og C4BP) separat til 50 nM i Tris-HCl, pH 9,0 (coatingbuffer). Der afpipetteres 100 µL af protein løsning i hver brønd med en Polysorp mikrotiter plade. Lukkes pladerne med låg og opbevares ved 4 ° C natten over (16 h) at lette immobilisering af proteiner til mikrotiterbrøndene plade.
- Kassér løsningen fra mikrotiter pladen ved at vippe hovedet over vasken og brøndene vaskes tre gange med 300 µL af PBS/godt. Blokere de coatede brønde for 1 h i RT med PBS, som indeholder 2,5% (w/v) BSA (PBS-BSA).
- Efter fjerner den blokerende løsning, brøndene vaskes tre gange med 300 µL af PBS, som indeholder 0,05% (v/v) Tween 20 (PBST) pr. brønd. Tilsæt 100 µL af 50 nM rekombinant hans markeret PH til hver prøve godt og Inkuber i 1 time på RT. Tilføj kun 100 µL af PBS-BSA i kontrolhullerne.
Bemærk: Lph genet kodning PH fra Hif var forstærkes ved PCR og klonet i de pET26b udtryk vektor, der tilføjer en 6 × hans-tag på C-terminus udtrykt protein. Den rekombinante vektor blev omdannet til E. coli BL21(DE3) for udtryk. Ni-NTA harpiks blev brugt til at rense rekombinante protein15. - Kassér protein løsningen og fjerne de ubundne proteiner ved at vaske wells tre gange med PBST 300 µL pr. brønd. Tilsæt 100 µL af PBS-BSA indeholder peberrodsperoxidase (HRP)-konjugeret anti-hans Sasja (1:10, 000 fortynding) og Inkuber i 1 time på RT.
- Forberede 20 mM opløsning A ved at opløse tetramethylbenzidine i en opløsning på 5% acetone og 45% methanol. For at forberede løsning B, 19.2 g citronsyre i 1.000 mL H2O opløses, ph indstilles til 4,25 ved at tilføje KOH, derefter tilføje 230 µL 30% H2O2. Gemme begge løsninger i mørke ved RT. Lige før brug, mix 500 µL af løsning B med 9,5 mL af opløsning A at forberede ELISA påvisning reagens.
- Brøndene vaskes tre gange med PBST 300 µL pr. brønd og opdage antigen-antistof-komplekser ved at tilføje 100 µL af ELISA påvisning reagens til hver brønd.
- Tilsæt 50 µL 1 M H2så4/well at stoppe reaktionen. Måling af Ekstinktionen af brøndene ved 450 nm med en mikrotiterplade læser.
-
Undersøgelse af interaktion kinetik af rekombinant PH og Vn ved hjælp af BLI
- Immobilisere menneskelige Vn Amin-reaktiv sensorer ved hjælp af amin kobling metode, ifølge producentens retningslinjer11.
- Ved hjælp af PBS, seriefremstillede fortyndes ligand (rekombinant PH) fra 0 til 4 µM og overføre de fremkomne løsninger til en 96-brønd sort, flad bund mikrotiter plade. Eksperiment ved 30 ° C ved hjælp af en BLI instrument17.
- Indlæse datamappe i BLI data analyse software. Vælg indstillingen 'sensor udvalg' . Derefter skal du vælge 'reference godt' (Vn-belagt sensor i PBS) for subtraktion.
- Vælg 'Juster y-aksen til baseline' og vælg "interstep rettelse og Juster til foreningen". Tryk på procesdata, der automatisk åbner fanen analyse.
- Vælg indstillingen "association og dissociation" under kurven montering i fanen analyse. Vælg modellen ' 1:1 bindende og globale montering '. Tryk på 'fit kurve' og eksport montering data17.
2. karakterisering af Vn i bakteriel tilslutning rolle
-
Undersøgelse af bakteriel tilslutning til Vn-belagt glasoverflader
- Forbered en 2 µg/mL opløsning af Vn i PBS og afpipetteres 10 µL af denne løsning på et glas mikroskop slide som en enkelt dråbe. Give slip til tørre på diaset i 30 min på RT. frakke et dias med human serum albumin (HSA) som negativ kontrol.
- Vask protein-coated glas dias tre gange ved at dyppe dias i to sekunder i et bægerglas, der indeholder PBS for at fjerne overskydende ubestrøget protein. Der tilsættes 20 mL af frisk Hif kultur (beskrevet taktfast 1.1.1) i et sterilt plastik petriskål og dykke Vn- / HSA-belagt glas lysbilleder i dyrkningsmediet. Inkuber retter ved 37 ° C i 1 time med rysten på 20 rpm.
Bemærk: Hif M10 og Hif M10Δlph blev dyrket i BHI lage eller på chokolade agar plader. Medium for lph mutant blev suppleret med 10 µg/mL kanamycin15. - Efter inkubation, skal du fjerne eventuelle ubundne bakterier ved nedsænkning dias tre gange i et bægerglas, fyldt med PBS. Visualiser bakterier ved Gram farvning, som beskrevet.
- Fjerne overskydende PBS fra hvert dias ved at vippe det og røre kant på silkepapir. Lufttørre dias for 3-5 min på RT, og fastsætte overholdt bakterier af passerer hver slide tre gange over en flamme.
- Hold dias ved kanterne med to fingre på en farvning bakke, hvorefter der tilsættes 3-4 dråber (200 – 300 µL) 2,3% krystalviolet-opløsning. Vente 60 s, så vask dias under en svag luftstrøm fra tap vand til 3 – 4 s.
- Tilsæt 3-4 dråber 0,33% jodoploesning på diasene. Vente 1 min og derefter skylle diasset under en blide strøm af vand fra hanen. Forsigtigt tørre dias af trækpapir.
- Tilsæt 3-4 dråber decolorizing løsning indeholdende 75% isopropylalkohol og 25% acetone i diaset. Efter 5-10 s, skal du vaske diasset under en blide strøm af vand fra hanen.
- Tilsæt 3-4 dråber (200 – 300 µL) af grundlæggende carbolfuchsin løsning. Vent 1 min, så skyl dias under en blide strøm af vand fra hanen. Tørre dias ved hjælp af trækpapir.
- Visualisere bakterier under et lysmikroskop, at vælge en oliebestan mål linse på 100 X forstørrelse18. Sammenlign overholdelse af Hif WT og mutant bakterier på Vn - og HSA-belagt glasoverflader.
-
Undersøgelse af Vn-afhængige overholdelse af bakterier epitelceller
Bemærk: Denne effektive overholdelse assay blev brugt i vores tidligere undersøgelser4,7.- Kultur A549 celler (type II alveolær epitelceller) i en 75-cm2 vævskultur kolbe med F12 medium suppleret med 10% (vol/vol) føtalt kalveserum (FCS) (komplet medium) og 5 µg/mL gentamicin. Inkuber kolbe i en inkubator med 5% CO2 ved 37 ° C i 3 dage indtil 80% sammenflydende (confluency kan estimeres ved at visualisere overfladedækning af celler ved hjælp af inverteret mikroskop). De følgende fire trin beskriver, hvordan du forberede assay19,20epitelceller.
- Vask celle éncellelag i kolben to gange med 20 mL PBS af blid hvirvlende. For at frigøre celler fra kolben overflade, tilsættes 2 mL celle detachement enzym opløsning og inkuberes kolbe i 5 min ved 37 ° C. Tryk på kolben med håndfladen at løsrive alle celler fra plastik overflade. Pipetteres op og ned et par gange at sprede celle klumper.
- Kolben tilsaettes 18 mL af F12 komplet medium og overføre den hele cellesuspension til en 50 mL sterilt Falcon tube. Centrifugeres cellesuspension i 5 min på 200 x g på RT og supernatanten. Celle resuspenderes i 10 mL af F12 komplet medium.
- Fjern 10 µL af cellesuspension og placere det i en Eppendorf-rør, derefter tilføje 90 µL af Trypan blå løsning. Læg prøven i en hemocytometer (dybde 0,1 mm) efter at placere coverslip.
- Tælle alle levedygtige celler i område A, B, C og D (hvert felt består af 16 pladser, og hvert kvadrat har et areal på 0.0025 mm2), derefter beregne det gennemsnitlige antal celler ([A + B + C + D] / 4). Beregne antallet af celler pr. milliliter ved hjælp af følgende ligning:
Levedygtige celler/mL = gennemsnitlig celle count × 104 × fortynding faktor20.
Bemærk: Her fortyndingsfaktoren er 10. - Fortyndet cellesuspension til 5,0 x 103 celler/mL ved hjælp af komplette mellemstore indeholdende 5 µg/mL gentamicin. Undvære 500 μL af cellesuspension til hver brønd med en 24-godt celle kultur plade. Inkuber plade ved 37 ° C i 5% CO2 , indtil cellerne er 90% sammenflydende.
- Forud for bakteriel infektion, fjerne medium fra brøndene og tilføje F12 medium (uden FCS), derefter inkuberes natten over ved 37 ° C.
- Vaske den celle éncellelag tre gange med 500 µL af PBS på RT. sted plade på is og tilsæt 100 µL af pre kølet F12 medium indeholdende 10 µg/mL af Vn. Incubate plade ved 4 ° C i 1 time. Kontrolhullerne, tilføje kun F12 medium.
- Efter inkubationen kassere løsningen af pipettering og vaske cellelag to gange med 1 mL PBS på RT. Resuspend en kultur af frisk dyrket Hif M10 (trin 1.1.1) i F12 medium (2 × 108 CFU/mL). Tilsæt 100 µL af denne bakteriel suspension til hver brønd og Inkuber plade i 2 timer ved 37 ° C.
Bemærk: Hver godt indeholder ca 2 x 105 A549 celler. For infektion, 2 x 107 bakteriel CFU blev tilføjet, svarende til en mangfoldighed af infektion af 100. - Fjern mediet af pipettering og A549 epitelial cellerne vaskes tre gange med PBS. Tilsættes 50 µL/brønd af celle detachement løsning og der inkuberes plade i 5 min ved 37 ° C.
- Dernæst tilsættes 50 µL af F12 komplet medium pr. brønd til at stoppe den enzymatiske reaktion. Overføre epitelceller (≈100 μL [dvs, hele diskenheden]) fra hver brønd til et 6-mL glasrør indeholdende fire glasperler. Lyse celler på RT af vortexing for 2 min.
- Fortyndet 10 µL af cellen lysate 100 ved at føje 10 µL af lysate til 990 µL af F12 medium. Plade 10 µL af de fortyndede prøve på en chokolade agar plade.
- Inkuber chokolade agar plade ved 37 ° C natten over, så kolonierne. Hver koloni repræsenterer én CFU.
- Kultur A549 celler (type II alveolær epitelceller) i en 75-cm2 vævskultur kolbe med F12 medium suppleret med 10% (vol/vol) føtalt kalveserum (FCS) (komplet medium) og 5 µg/mL gentamicin. Inkuber kolbe i en inkubator med 5% CO2 ved 37 ° C i 3 dage indtil 80% sammenflydende (confluency kan estimeres ved at visualisere overfladedækning af celler ved hjælp af inverteret mikroskop). De følgende fire trin beskriver, hvordan du forberede assay19,20epitelceller.
3. analyse af Vn-afhængige modstand mod den bakteriedræbende aktivitet i humant Serum
- Køb NHS fra en kommerciel kilde. Forberede VDS som tidligere beskrevet12. Genopbygge VDS med 180 nM Vn, der svarer til Vn findes i NHS.
- Forberede varme-inaktiverede serum (HIS) ved opvarmning NHS ved 56 ° C i 30 min for at inaktivere supplement proteiner.
Bemærk: Den optimale serum koncentration (5%) og Inkubationstiden (15 min) til analysen beskrives i trin 3.3-3.7 blev bestemt empirisk for Hif15; disse parametre kan variere for andre bakterielle patogener. - Kultur bakterier (i dette tilfælde, Hif M10 og mutant Hif M10Δlph) til midten log fase (OD600 = 0,3). Pellet bakterier ved centrifugering ved 3.500 x g i 10 min.
- Bakteriel resuspenderes med 1 volumen af dextrose gelatine Veronal buffer (største++, pH 7.3) indeholdende 2,5% (w/v) glukose, 2 mM MgCl2, 0,15 mM CaCl2og 0,1% (wt/vol) gelatine.
- Tilføj 1,5 x 103 CFU af bakterier til 100 µL af største++ som indeholder 5% serum (NHS, hans, VDS, eller VDS + 180 nM Vn). Inkuber prøve ved 37 ° C i 15 min med rysten på 300 rpm.
- Fjerne en 10 µL alikvot fra reaktionsmiljøet på 0 min (T0 prøve) og 15 min (Tt prøve) og plade på chokolade agar. Inkuber plade ved 37 ° C natten over.
- Efter inkubationen kolonierne optræder på pladen. Beregne procentdelen af bakterier dræbt12 ved hjælp af følgende ligning: (CFU på Tt) / (CFU på T0) × 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
VN-binding til overfladen af bakterier blev bestemt ved flowcytometri. Alle Hif kliniske isolater testet i denne undersøgelse rekrutteret Vn til cellens overflade. Ingen interaktion af Vn med cellens overflade blev observeret for E. coli negativ kontrol stamme (fig. 1A). Som vist i figur 1B, er PH en store Vn-bindende protein på overfladen af Hif celler. Binding af Vn ved WT Hif stamme forårsaget M10 et skift i befolkningen, mens Hif M10Δlph ikke binde Vn og syntes svarer til kontrolelementet.
Protein-protein interaktioner mellem PH og Vn blev anslået ved ELISA og BLI. Rekombinant PH fik lov til at binde med menneskelige faktor H, Vn og C4BP (negativ kontrol) belagt på wells af mikrotiter ELISA-plader. Bundet PH blev anslået ved hjælp af en anti-hans Sasja. Resultaterne angives tydeligt en betydelig interaktion mellem PH og Vn og faktor H, i forhold til C4BP (fig. 2A). Interaktion mellem PH og Vn blev anslået i realtid ved hjælp af BLI. Figur 2 B viser PH bindende respons-kurver for Vn-belagt sensoren overfladen. Bindende affinitet (i dette tilfælde, Kd = 2,2 µM) blev anslået ved montering data til steady-state bindende kinetik.
Bakterier mangler udtryk for PH på cellens overflade (Hif M10Δlph) udstillet reduceret overholdelse af Vn-belagt glasoverflader i forhold til WT celler (fig. 3A). Derudover forbedret tilstedeværelsen af Vn på overfladen af epitelceller betydeligt overholdelse af Hif (fig. 3B). Disse resultater viste, at PH-Vn samspil bidrog væsentligt til bakteriel tilslutning.
VN er en velkendt supplement hæmmer. Du skal vurdere den supplement-hæmmende aktivitet, serum-medieret drab blev undersøgt i tilstedeværelse og fravær af Vn. WT Hif celler udstillet højere serum modstand end M10Δlph muterede celler. Ingen bakterier blev dræbt i nærværelse af hans (figur 4A). Interessant, WT Hif udstillet nedsat overlevelse i VDS, og opfyldning af Vn øget bakteriel overlevelse. Hif M10Δlph stamme reagerede dog ikke på Vn udtynding, fordi det ikke kunne ansætte Vn til cellens overflade (fig. 4B). Disse resultater viser tydeligt, at Vn er en vigtig vært faktor, der beskytter bakterier fra komplement-medieret drab (figur 4A-B).
Figur 1 : Haemophilus influenzae serotype f binder Vn via overflade-udtrykt PH. (A) Flow flowcytometri resultater viser binding af Vn til cellerne i Hif kliniske isolater. Hver klinisk isolere (5 x 106 CFU) blev inkuberet med 250 nM menneskelige Vn. bundet ligand blev fundet ved hjælp af en får anti-Vn Sasja og FITC-konjugeret æsel anti-får sekundær antistoffer. Escherichia coli BL21 (DE3) blev inkluderet som en negativ kontrol. Data er præsenteret som den gennemsnitlige fluorescens intensitet fra tredobbelt analyser i tre separate eksperimenter og fejllinjer repræsenterer SD. (B) Flow flowcytometri histogrammer demonstrerer bindingen af Vn til overfladen af WT Hif M10 og PH-sletning Hif M10Δ LPH mutant. Repræsentative data fra en af tre separate eksperimenter er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Rekombinant PH binder til Vn. (A) ELISA resultater demonstrerer bindingen af rekombinant PH Vn, FH og C4BP. FH blev anvendt som positiv kontrol, mens C4BP blev brugt som en negativ kontrol. For at analysere protein-protein interaktioner, Vn, FH, og C4BP var belagt med equimolar (50 nM) koncentrationer på brøndene mikrotiter plader. Næste, 50 nM rekombinant PH-His6x blev tilføjet. Bundet PH blev fundet ved hjælp af en HRP-konjugerede anti-hans Sasja. Data, der vises er middel til tredobbelt analyser fra tre uafhængige eksperimenter, og fejllinjer angive SD. ***, P≤0.001. (B) BLIanalysis af PH binding til Vn: rekombinant Vn var usejldygtigt på AR2G sensorer, og bindende kinetik af PH (0,25-4 µM) til Vn blev registreret ved hjælp af BLI instrument. Ligevægt affinitet konstant blev beregnet ved hjælp af signaler opnået for hver koncentration ved ligevægt, og dataene blev monteret efter steady-state kinetik. Eksperimentet blev gentaget tre gange, og ét repræsentative datasæt er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Samspil mellem PH og Vn forbedrer bakteriel tilslutning til glasoverflader og epitelceller. (A) lys mikroskopiske billeder viser overholdelse af Hif Vn-belagt glas lysbilleder. Bakterier blev visualiseret ved Gram farvning. Repræsentative billeder fra en af tre uafhængige forsøg er vist. Dette panel blev tidligere offentliggjort i Journal af immunologi7 og er gengivet her med tilladelse fra den amerikanske sammenslutning af Immunologists. (B) overholdelse af WT Hif M10 celler til A549 epitelceller i tilstedeværelse og fravær af Vn, middel til tredobbelt analyser fra tre uafhængige eksperimenter er afbildet og fejllinjer repræsenterer SD. *, p ≤0.05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Vn rekrutteret til Hif cellens overflade beskytter bakterier fra serum-medieret drab. (A) WT Hif M10 og mutant Hif M10Δlph blev udruget i 15 min i 5% NHS eller hans. (B) modstand af Hif M10 og Hif M10Δlph til bakteriedræbende effekt i 5% VDS og VDS suppleret med 250 nM renset Vn. Data repræsenterer middel til tredobbelt analyser fra tre uafhængige eksperimenter, og fejllinjer angive SD. ***, p ≤0.001; NS, ikke betydelig. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakterielle patogener rekruttere Vn til cellens overflade og udnytte dette supplement regulator for at undgå aflejring af supplement faktorer og færdiggørelse af membran angreb komplekse2. VN også fungerer som en bro molekyle mellem bakteriel overflade proteiner og vært celle overfladen receptorer, således at patogener til at holde sig til overfladen af epitelceller og efterfølgende formidle internalisering. I denne undersøgelse beskriver vi protokoller, der kan bruges til at anslå i) binding af Vn til overfladen af bakterieceller, ii) protein-protein interaktioner og affinitet konstanter, og iii) Vn funktionelle rolle i at give serum modstand og forbedring af overholdelse af overfladen af værtsceller.
Flowcytometri er en kvantitativ teknik, der almindeligvis anvendes til at kontrollere, at bakterier binde Vn. Dog skal Vn koncentrationen optimeret, som Vn-bindende kapacitet (og forskellige receptorer) kan variere afhængigt af de bakteriearter. I analysen beskrives her, blev 1-100 µg/mL af Vn brugt til at beregne lineær bindende og mætning parametre. Sammenligning af de bindende mønstre af WT Hif, Hif M10Δlph mutant og negativ kontrol E. coli celler viste en tydelig forskel på en Vn koncentration på 20 µg/mL (250 nM). Derfor, denne koncentration blev brugt i alle flow flowcytometri eksperimenter. Brug af Vn ved koncentrationer over mætningspunktet kunne producere falsk-positive signaler. Fortynding af de primære og sekundære antistoffer skal også optimeres separat for hver patogen. Den maksimale fortynding af antistoffer viser et godt signal bør vælges. I denne undersøgelse brugte vi 2,5% BSA som en blokerende agent. BSA er imidlertid ikke en universel blokerende reagens egnet til alle patogener. I tilfælde hvor BSA ikke blokere uspecifik antistof interaktioner, kan andre blokerende reagenser anvendes, såsom fisk gelatine. Bindingen af Vn til overfladen af bakteriel patogen celler er ofte medieret af flere receptorer21,22. Nogle receptorer har høj Vn-bindingsaffinitet, mens andre kan udstille lav bindingsaffinitet. Sletning af kun ét gen kodning en overflade protein kunne således ikke resultere i en nedgang i Vn interaktioner vurderet ved flowcytometri. Som et alternativ til flowcytometri, kan protein binding på bakteriel cellens overflade undersøges ved hjælp af en immunofluorescens assay (IFA) eller transmissions elektronmikroskopi (TEM). Selv om photobleaching af fluororeagent-konjugerede antistoffer kan være problematisk i både flowcytometri og IFAs, involverer TEM besværlige prøveforberedelse, med betydelig risiko for at indføre artefakter23,24. Analyse af handelsstrømmen flowcytometri er faktisk at foretrække til IFA og TEM enklere prøve forberedelse protokoller og mulighed for at teste mange prøver inden for en kort tidshorisont.
Protein-protein interaktioner i en celle gratis system blev analyseret ved hjælp af ELISA (fig. 2A) og BLI (figur 2B). I begge disse teknikker var en af de bindende partnere immobiliseret, enten på en biosensor (for BLI) eller en mikrotiter plade (ELISA). Fordelen ved BLI og ELISA er, at de aktiverer analyse af protein-protein interaktioner i deres hjemstat, forhindrer uspecifik interaktioner uden for den aktive bindingssted. Nytte af BLI, dog kan være begrænset afhængigt af immobilisering teknik, der anvendes. Amin kobling procedure, der anvendes her tilfældigt danner et AMID bånd mellem enhver overflade-eksponerede Amin gruppe af protein og overfladen af biosensor. Dette resulterer i immobilisering af proteinmolekyler på overfladen af sensoren i forskellige retninger. Dette kan resultere i heterogene bindende, der ikke er plads til en 1:1 bindende kinetik model. Dette potentielle problem kan løses ved at vælge biotin sensorer og tilføje en streptavidin tag i den rekombinante proteiner til at blive immobiliseret. Pålideligheden af BLI der ligner overfladen plasmon resonans (SPR). Association og dissociation af molekyler kan måles i realtid ved hjælp af enten teknik. Men BLI enheden bruger ikke mikrofluidik, og er derfor nemme at vedligeholde. Derudover kan 96 interaktioner testes samtidigt i BLI, der henviser til, at kun fire prøver på et tidspunkt kan testes ved hjælp af SPR. Der er en anden afgørende skridt i BLI der skal optimeres. Hvis sensorer der genbruges, bør regenerering betingelser også optimeres, så der kan variere for hvert protein-protein kompleks. I denne undersøgelse, var 10 mM ethylendiamintetra syre fundet egnet til sensor regenerering.
Vn rolle i bakteriel tilslutning blev testet direkte ved hjælp af glasoverflader belagt med Vn. Denne fremgangsmåde kan anvendes til at analysere bindende for enhver bakteriel patogen, herunder både Gram-negative og -positive bakterier. Dette er en semikvantitativ teknik, der giver hurtig vurdering af et patogen kapacitet for binding til Vn. For at opnå rimelige resultater, skal Vn belægning optimeres. I analysen beskrives her, belægning med Vn på 1, 2 og 5 µg/mL blev undersøgt, og 2 µg/mL blev fundet for at være den mest passende koncentration for forsøgene gennemført i denne undersøgelse (fig. 3A). Overskydende Vn belagt på overfladen kunne oprette et tykt lag, der kan fjernes nemt under prøven fastsættelse og farvning. Derudover bør bakteriekulturen ikke have store klumper af celler; Dette kan være undgået ved vortexing kultur før du tilføjer en alikvot til dias.
Bakteriel tilslutning til overfladen af epitelceller blev undersøgt ved hjælp af et kimtal teknik (fig. 3A). Denne analyse skal også omhyggeligt optimeret for at aktivere observation af Vn rolle i bakteriel tilslutning. VN har forskellige bindingssteder for bakterier (på C-terminus) og celle langlinefartøjer integrin receptorer (på den N-terminale M.H.T. bindingssted). Bindingen af Vn til integriner inducerer signalering og optagelsen af integrin-Vn komplekse1. Hvis disse komplekser er internaliseret uden bakterier, vil resultaterne være vanskelige at fortolke. Derfor, Vn skal føjes til epitelcelle éncellelag ved 4 ° C. Når Vn har mættet integrin receptorer på epitelcelle overfladen, skal overskydende Vn vaskes af, som gratis Vn kan blokere bakteriel Vn-afhængige integrin bindende. I denne analyse, vi skønnet samlet bakteriel tæller forbundet med epitelceller (dvs., at læse-out består både overflade-attached og internaliseret bakterier). Denne analyse kan udvides til at skelne mellem eksterne og intracellulære bakteriel populationer af behandling med gentamicin4.
Serum bakteriedræbende analysen bruges i protokollen beskrevet her blev delvis ændret fra tidligere udgivne procedure12,22. I analysen beskrives her, 1,5 x 103 CFUs af Hif var inkuberes med 5% NHS for 15 min, 5 min længere end i de tidligere beskrevne analyse (figur 4A). Forskellen mellem WT Hif og de isogene mutant blottet for PH var tydeligere på 15 min end på 10 min. Derfor valgte vi 15 min inkubationstiden for denne særlige eksperiment. Bakteriedræbende virkningerne af serum afhænger den serum koncentration, inkubation, og antallet af bakterier. Alle patogener udviser en bemærkelsesværdig evne til at undgå den bakteriedræbende aktivitet af serum; nogle patogener kan være helt resistente over for serum, mens andre kan være moderat resistente eller følsomme. Serumkoncentrationen må derfor optimeres for hver specifikke patogen undersøgt. Serum dræbe assay beskrevet her er dog begrænset til undersøgelse af gram-negative bakterier, da serum har ingen betydelig bakteriedræbende effekt på gram-positive celler1,5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen finansielle interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra fonden Anna og Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. og Edla Johansson Foundation, den svenske Medical Research Council (give nummer K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), Cancer Foundation ved universitetet Hospital i Malmø, Physiographical samfund (Forssman's Foundation), og Skåne County Council Research og Development Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
References
- Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
- Hallstrom, T., et al. Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif. PloS one. 11 (1), 0147709 (2016).
- Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation. Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).
- Singh, B., et al. A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells. Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).
- Kohler, S., et al. Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3. Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).
- Onelli, E., Citterio, S., O'Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips. Planta. 202 (2), 188-195 (1997).
- Al-Jubair, T., et al. Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells. J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).
- Martinez-Martin, N. Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions. J. Immunol. Res. 2017, 2197615 (2017).
- Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions. Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry. Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity. Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).
- Ronander, E., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity. J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Fleury, C., et al. Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance. J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
- McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Microscopy and image analysis. Current protoc. Hum. Genet. , Chapter 4 Unit 4 4 (2005).
- Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).
- Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism. Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance. J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).
- Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors. Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).
- Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii. New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).
- Pinne, M., Haake, D. Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins. J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).
