Summary
Denna rapport beskriver protokoll för kännetecknar interaktioner mellan bakteriell yttre membranproteiner och den mänskliga komplement regulator Aktiebolaget Trav & galopp. Protokollen kan användas för att studera de bindande reaktioner och biologiska funktionen av Aktiebolaget Trav & galopp i någon bakteriearter.
Abstract
Bakterier utnyttjar komplement regulatorer som ett sätt att kringgå värd immunsvaret. Här beskriver vi protokoll för att utvärdera roll Aktiebolaget Trav & galopp förvärvet på bakteriell cell surface lekarna i motstånd mot värd immunsystemet. Flöde flödescytometri experiment som humanplasma Aktiebolaget Trav & galopp en ligand för bakteriell receptor yttre membranprotein H av Haemophilus influenzae typ f. En enzymkopplad immunosorbentanalys var anställd för att karakterisera de protein-protein interaktioner mellan renat rekombinant protein H och Aktiebolaget Trav & galopp och bindande affinitet bedömdes med hjälp av bio-lager interferometri. Den biologiska betydelsen av bindningen av Aktiebolaget Trav & galopp till protein H på bakteriella cellens yta i skatteflykt av värd immunsvar bekräftades med ett serum motstånd i råtthud med normal och Aktiebolaget Trav & galopp-utarmat humanserum. Vikten av Aktiebolaget Trav & galopp i bakteriell vidhäftning analyserades med glasskivor med och utan Aktiebolaget Trav & galopp beläggning, följt av Gramfärgning. Slutligen, bakteriell vidhäftning till mänskliga alveolära epitelceller enskiktslager undersöktes. De protokoll som beskrivs här kan lätt anpassas till studiet av alla bakteriearter sevärdheter.
Introduction
Aktiebolaget Trav & Galopp (Vn) är en viktig mänsklig glykoprotein involverade i att upprätthålla homeostas via reglering av det fibrinolytiska systemet. VN fungerar även som en komplement-regulator genom att hämma den terminal komplementbanan under C5b6-7 komplexa bildande och C9 polymerisation. Flera bakteriella patogener har visat att rekrytera Vn till cellytan som ett sätt att motstå komplement nedfall1,2,3. Dessutom fungerar Vn som en ”smörgås” molekyl mellan bakterier och värd epitelial cellreceptorer, därmed främja följsamhet och internalisering av patogener2,4,5. Bindningen av Vn till bakteriella cellens yta medieras av andra för närvarande oidentifierade proteiner. Fullständigt belysa den funktionella rollen för Vn-bindning i skatteflykt av slang immunsvar kommer därför kräva identifiering av Vn-rekrytera proteiner.
Det första steget i att identifiera Vn-bindande proteiner är att testa om en patogen sevärdheter kan binda renat Vn. flödescytometri är en bekväm och okomplicerad metod för att bestämma huruvida Vn är bunden till patogen celler. I denna studie bedömde vi bindningen av Vn till olika Haemophilus influenzae typ f (Hif) kliniska isolat6. Den metod som beskrivs häri är kvantitativ och kan användas för att skilja den bindande kapaciteten av en mängd olika bakteriestammar. I en tidigare studie karakteriserade vi protein H (PH) i Hif som en Vn-bindande protein7. Därför, i den aktuella studien, Vn-bindande potential av vildtyp (WT) Hif och Hif M10Δlph mutanter jämfördes med protokollen beskrivs.
När det bestäms att en patogen binder Vn, är det andra steget att karakterisera det ytan proteomet för att identifiera potentiella Vn-bindande proteiner. En mängd metoder kan användas för detta ändamål8,9, men dessa metoder beskrivs inte i denna rapport. Metoden som är mest lämpade för att undersöka protein-protein interaktioner är att recombinantly uttrycka valda bakteriella ytproteiner i E. coli och rena genom affinitetskromatografi. Vi använder här, PH och dess molekylär interaktion med Vn för att illustrera metoden. Interaktioner mellan rekombinant PH och Vn präglades med en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)7 och en nyligen utvecklad etikett-fri teknik som kallas bio-lager interferometry (BLI)10,11. Elisa-test kan användas för att bekräfta protein-protein interaktioner, finns BLI detaljerade uppgifter angående de kinetiska parametrarna av interaktioner.
För att studera den funktionella rollen för Vn i bakteriell vidhäftning, kan två olika analyser utnyttjas. Den första analysen som beskrivs här är direkt mätning av bakteriell adherencen till Vn-belagda glasytor, medan den andra analysen undersöker adherencen till ytan av epitelceller. För första analysen, objektglas var belagda med Vn, och bindningen av WT eller muterade Hif stammar bedömdes genom Gramfärgning och mikroskopi. Denna teknik skiljer lätt bakterier utifrån förmågan att binda Vn12. Bakteriell vidhäftning till däggdjursceller analyserades sedan genom att lägga till odlade bakterier på en enskiktslager av typ II-alveolära epitelceller; bakteriella fastsättning bedömdes genom att räkna antalet kolonibildande enheter (CFUs). Följas och internaliserad bakterier kan urskiljas i närvaro eller frånvaro av Vn4,13.
Rollen av Vn förvärv i bakteriell serum resistens utvärderades med ett serum dödande analys (dvs, serum bakteriedödande aktivitet). För att bedöma betydelsen av Vn förvärv i serum motstånd, var den antibakteriella effekten av Vn-utarmat serum (VDS) jämfört med normala humant serum (NHS). Metoden används lätt skiljer Vn-bindande kontra icke-bindande bakterier baserat på serum motstånd. Vi använde denna metod för att studera rollen som Vn i serum motståndet av flera bakteriella patogener4,12.
Många metoder har rapporterats för att studera värd-patogen interaktioner. Här, beskriver vi en uppsättning protokoll som enkelt kan anpassas till studiet av eventuella patogener för att bedöma Vn roll i patogenesen. Vi testade dessa protokoll som använder olika patogener, och Hif valdes som ett exempel för detta betänkande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. analys av Vn som en bakteriella Surface Protein Ligand
-
Påvisande av Vn-bindande vid bakteriell ytan med hjälp av flödescytometri
Obs: I flödescytometri, vi brukade side scatter och framåt scatter gate positiva händelser. För att undersöka interaktionen med Vn, Hif kliniska isolat (n = 10)7 valdes tillsammans med E. coli BL21 (DE3) som en negativ kontroll (figur 1A).- Kultur Hif kliniska isolat i hjärnan-hjärta infusion (BHI) medium kompletteras med 10 µg/mL NAD och hemin vid 37 ° C under skakning på 200 rpm. Använd Luria-Bertani medel till kultur E. coli14. Skörda Hif på mitten av stocken fas (OD600 = 0,3)15, och resuspendera bakterierna i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,2, som innehåller 1% (w/v) bovint serumalbumin (BSA) (blockerande buffert; PBS-BSA). Justera fjädringen till 109 CFU/mL.
- Överför alikvoter som innehåller 5 x 106 CFU 5 mL polystyren runda-botten rör (12 x 75 mm2) och tillsätt 1 mL blockerande buffert. Centrifugera suspensionen vid 3.500 × g vid rumstemperatur (RT)16 för 5 min för att pellets bakterier, sedan noggrant aspirera för att avlägsna supernatanten utan att störa pelleten.
- Återsuspendera bakteriell pellets med 50 μl blockerande buffert innehållande 250 nM Vn och inkubera proverna för 1 h på RT utan att skaka. Efter inkubation, pellet bakterierna genom centrifugering vid 3 500 x g i 5 min, sedan tvätta pellets tre gånger med PBS och liknande centrifugering steg.
- Till bakteriell pelleten, tillsätt 50 μL av primära får anti-humant Vn polyklonala antikroppar (pAbs) på 1: 100 utspädning i PBS-BSA. Inkubera suspensionen för 1 h på RT och sedan tvätta bakterierna tre gånger med PBS ta bort obundna antikroppar (enligt beskrivningen i steg 1.1.3).
- Nästa, tillsätt 50 μL av PBS-BSA innehållande fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC)-konjugerat åsna anti får pAbs (spädning 1: 100) och inkubera vid RT för 1 h i mörkret.
- Förbereda ett blankprov genom ruvning bakterier med blockerande buffert endast och pAbs utan Vn.
- Tvätta bakterier tre gånger med 1 mL blockerande buffert och pellet suspensionen genom centrifugering, som beskrivs i avsnitt 1.1.2. Slutligen Återsuspendera bakteriell pelleten med 300 µL av PBS och analysera genom flödet flödescytometri7.
-
ELISA analys av samspelet mellan rekombinant PH och Vn
Obs: Kontroller måste ingå för att utesluta ospecifik bindning. Mänsklig faktor H (FH) eller C4b-bindande protein (C4BP) används som positiva och negativa kontroller, respektive.- Späd ut var och en av de mänskliga proteinerna (Vn, FH och C4BP) separat till 50 nM i Tris-HCl, pH 9,0 (beläggning buffert). Dispensera 100 µL av protein lösning till varje brunn på mikrotiterplattan en Polysorp. Stäng plattorna med locket och förvaras vid 4 ° C över natten (16 h) att underlätta immobilisering av protein på tallriken mikrotiterbrunnarna.
- Kassera lösningen från mikrotiterplattan genom att vinkla upp och ner över diskbänken och Tvätta brunnarna tre gånger med 300 µL av PBS per brunn. Blockera de belagda brunnarna för 1 h på RT med PBS som innehåller 2,5% (w/v) BSA (PBS-BSA).
- Efter bort blockerande lösningen, Tvätta brunnarna tre gånger med 300 µL av PBS som innehåller 0,05% (v/v) Tween 20 (PBST) per brunn. Tillsätt 100 µL av 50 nM rekombinant hans-taggade PH till varje prov väl och inkubera i 1 h på RT. I kontrollbrunnarna, tillsätt bara 100 µL av PBS-BSA.
Obs: Den lph -gen som kodar PH från Hif var förökas med PCR och klonade in pET26b uttryck vektorn som lägger tillför en 6 × hans-tagg på C-terminus av proteinet uttrycks. Den rekombinant vektorn förvandlades till E. coli BL21(DE3) för uttryck. Ni-NTA kåda användes att rena de rekombinanta protein15. - Kassera den protein lösningen och avlägsna de obundna proteinerna genom att Tvätta brunnarna tre gånger med PBST 300 µL per brunn. Tillsätt 100 µL av PBS-BSA som innehåller pepparrotsperoxidas (HRP)-konjugerat anti hans pAbs (1:10, 000 utspädning) och inkubera i 1 h på RT.
- Förbereda 20 mM lösning A genom upplösning tetrametylbensidin i en lösning av 5% aceton och 45% metanol. För att förbereda lösning B, lös 19,2 g citronsyra i 1 000 mL H2O, justera pH till 4,25 genom att lägga till KOH och sedan lägga till 230 µL av 30% H2O2. Lagra båda lösningarna i mörker vid RT. Precis innan användning, blanda 500 µL av lösning B med 9,5 mL av lösning A att förbereda ELISA upptäckt reagensen.
- Tvätta brunnarna tre gånger med PBST 300 µL per brunn och upptäcka antigen-antikropp komplex genom att lägga till 100 µL av ELISA upptäckt reagensmedel till varje brunn.
- Tillsätt 50 µL av 1 M H2så4/well att stoppa reaktionen. Mät den optiska densiteten av brunnar vid 450 nm med en microplate reader.
-
Studien av interaktion kineticsen av rekombinant PH och Vn använder BLI
- Immobilisera mänskliga Vn på amine-reaktivt sensorer använder den aminen koppling metod, enligt tillverkarens riktlinjer11.
- Använda PBS, seriellt späd liganden (rekombinant PH) från 0 till 4 µM och överföra de resulterande lösningarna till en svart 96 brunnar, platt botten mikrotiterplattan. Köra experimentet vid 30 ° C med en BLI instrumentet17.
- Ladda data-mappen i programvaran BLI data analys. Välj alternativet 'sensor markering' . Sedan, Välj 'referens väl' (Vn-belagd sensor i PBS) för subtraktion.
- Välj ”Justera y-axeln till baslinjen' och 'interstep korrigering och justera till association'. Tryck på 'processdata' som öppnas automatiskt fliken analys.
- Välj alternativet 'association och dissociation' under kurva montering i fliken analys. Välj modell ' 1:1 bindande och globala passande '. Tryck på 'anpassa kurva' och export passande data17.
2. karakterisering av Vn i bakteriell vidhäftning roll
-
Studie av bakteriell adherencen till Vn-belagda glasytor
- Bered en 2 µg/mL för Vn i PBS och Pipettera 10 µL av denna lösning på ett glas Mikroskop glida som en enda droppe. Tillåt den nedrullningsbara torka i bilden i 30 min på RT. Coat en bild med humant serumalbumin (HSA) som en negativ kontroll.
- Tvätta protein-belagda glas glasen tre gånger genom att doppa glasen i två sekunder i en bägare som innehåller PBS för att ta bort överflödigt obestruket protein. Tillsätt 20 mL färsk Hif kultur (som beskrivs i steg 1.1.1) i en steril plast petriskål och dränka den Vn- / HSA-belagda glas glider i odlingssubstratet. Inkubera vid 37 ° C för 1 h rätter med skakningar vid 20 rpm.
Obs: Hif M10 och Hif M10Δlph odlades i flytande BHI medium eller på Chokladagar tallrikar. Medium för lph mutant kompletterades med 10 µg/mL kanamycin15. - Efter inkubation, ta bort alla obundna bakterier genom att dränka bilder tre gånger i en bägare fylld med PBS. Visualisera bakterier genom Gramfärgning, som beskrivs.
- Ta bort överflödigt PBS från varje bild genom att luta den och röra kanten på mjukpapper. Lufttorka glasen för 3-5 min på RT och fixa klibbade bakterier genom passerar varje bild tre gånger över en låga.
- Håll bilden i kanterna med två fingrar på en färgning bricka, Lägg 3-4 droppar (200 – 300 µL) 2,3% kristallviolett lösning sedan. Vänta 60 s och sedan tvätta bilderna under en svag luftström tryck vatten för 3 – 4 s.
- Tillsätt 3-4 droppar 0,33% jodlösning på bilderna. Vänta 1 minut, och skölj sedan bilden under en svag luftström kranvatten. Försiktigt torka bilderna av läskpapper.
- Tillsätt 3-4 droppar decolorizing lösning innehållande 75% isopropylalkohol och 25% aceton in i bilden. Efter 5 – 10 s, tvätta i bilden under en svag luftström kranvatten.
- Tillsätt 3-4 droppar (200 – 300 µL) grundläggande carbolfuchsin lösning. Vänta 1 minut, och skölj sedan bilderna under en svag luftström kranvatten. Torka de diabilder med läskpapper.
- Visualisera bakterierna under ett ljusmikroskop, välja en Oljeimmer objektiv på 100 X förstoring18. Jämföra adherencen till Hif WT och muterade bakterier på Vn - och HSA-belagda glasytor.
-
Studie av Vn-beroende av bakterier till epitelceller
Obs: Denna effektiva följsamhet analys användes i våra tidigare studier4,7.- Kultur A549 celler (typ II alveolära epitelceller) i en 75 cm2 vävnadsodling kolv med F12 medium kompletteras med 10% (vol/vol) fetalt kalvserum (FCS) (komplett medium) och 5 µg/mL gentamicin. Inkubera kolven i en inkubator med 5% CO2 vid 37 ° C i 3 dagar tills 80% konfluenta (konfluens kan beräknas genom att visualisera yttäckning av celler med inverterade Mikroskop). Följande fyra steg beskriver hur du förbereder epitelceller för assay19,20.
- Tvätta den cell enskiktslager i kolven två gånger med 20 mL PBS genom försiktig omskakning. För att lossa cellerna från kolven ytan, tillsätt 2 mL av cell avlossning enzym lösning och inkubera kolven för 5 min vid 37 ° C. Tryck på kolven med handflatan att lossa alla celler från plastytan. Pipettera upp och ner några gånger att skingra cell klumpar.
- Lägg till 18 mL F12 komplett medium till kolven och överföra hela cellsuspensionen till en 50 mL sterilt falconrör. Centrifugera cellsuspensionen för 5 min vid 200 x g vid RT och kasta bort supernatanten. Återsuspendera cellpelleten i 10 mL av F12 komplett medium.
- Ta bort 10 µL cellsuspension och placera den i ett Eppendorf-rör, Lägg sedan 90 µL Trypan blå lösning. Läsa in provet i en hemocytometer (djup 0,1 mm) efter att placera täckglaset.
- Räkna alla livskraftiga celler i områden A, B, C och D (varje fält består av 16 rutor, och varje ruta har en yta på 0,0025 mm2), sedan beräkna Genomsnittligt antal celler ([A + B + C + D] / 4). Beräkna antalet celler per milliliter med hjälp av följande ekvation:
Livskraftiga celler/mL = genomsnittlig cell count × 104 × utspädning faktor20.
Obs: Här utspädningsfaktorn är 10. - Späd cellsuspensionen till 5,0 x 103 celler/mL med hjälp av komplett medium innehållande 5 µg/mL gentamicin. Fördela 500 μL av cellsuspensionen i varje brunn 24-väl cell kultur platta. Inkubera plattan vid 37 ° C i 5% CO2 tills cellerna är 90% konfluenta.
- Innan bakteriell infektion, ta bort mediet från brunnarna och lägga till F12 medium (utan FCS), sedan Inkubera över natten vid 37 ° C.
- Tvätta den cell enskiktslager tre gånger med 500 µL av PBS på RT. Place is plattan och tillsätt 100 µL av pre kylda F12 medium som innehåller 10 µg/mL Vn. Inkubera plattan vid 4 ° C för 1 h. För kontrollbrunnar, lägga till bara F12 medium.
- Efter inkubation, kassera lösningen av pipettering och tvätta det cell-lagret två gånger med 1 mL PBS på RT. Omsuspendera en kultur av färska odlade Hif M10 (steg 1.1.1) i F12 medium (2 × 108 CFU/mL). Tillsätt 100 µL av denna bakteriesuspension i varje brunn och inkubera plattan för 2 h vid 37 ° C.
Obs: Varje innehåller väl ungefär 2 x 105 A549 celler. För infektion, 2 x 107 bakteriell CFU tillfogades, vilket motsvarar en multiplicity av infektion av 100. - Ta bort mediet genom pipettering och tvätta A549 epitelceller tre gånger med PBS. Tillsätt 50 µL per brunn av cell avlossning lösning och inkubera plattan för 5 min vid 37 ° C.
- Nästa, tillsätt 50 µL av F12 komplett medium per brunn för att stoppa den enzymatiska reaktionen. Överföra epitelceller (≈100 μL [dvs, hela volymen]) från varje brunn till ett 6 mL glasrör innehållande fyra glaspärlor. Lysera celler på RT av vortexa i 2 min.
- Späd 10 µL av cellen lysate 100-fold genom att lägga till 10 µL av lysat 990 µL av F12 medium. Platta 10 µL av det utspädda provet på Chokladagar plåt.
- Inkubera Chokladagar plattan vid 37 ° C över natten och sedan räkna kolonierna. Varje koloni representerar en CFU.
- Kultur A549 celler (typ II alveolära epitelceller) i en 75 cm2 vävnadsodling kolv med F12 medium kompletteras med 10% (vol/vol) fetalt kalvserum (FCS) (komplett medium) och 5 µg/mL gentamicin. Inkubera kolven i en inkubator med 5% CO2 vid 37 ° C i 3 dagar tills 80% konfluenta (konfluens kan beräknas genom att visualisera yttäckning av celler med inverterade Mikroskop). Följande fyra steg beskriver hur du förbereder epitelceller för assay19,20.
3. analys av Vn-beroende motstånd mot den antibakteriella effekten av humant Serum
- Köp NHS från en kommersiell källa. Förbereda VDS som tidigare beskrivits12. Fylla på VDS med 180 nM Vn som motsvarar Vn i NHS.
- Förbereda Värmeinaktiverade serum (HIS) genom upphettning NHS vid 56 ° C i 30 min för att inaktivera komplement proteiner.
Obs: Den optimala serumkoncentration (5%) och inkubationstiden (15 min) för den analysmetod som beskrivs i steg 3.3 – 3,7 bestämdes empiriskt för Hif15; dessa parametrar kan variera för andra bakteriella patogener. - Kultur bakterier (i detta fall, Hif M10 och den mutant Hif M10Δlph) till mitten av log fas (OD600 = 0,3). Pellet bakterier genom centrifugering vid 3 500 x g i 10 min.
- Återsuspendera bakteriell pelleten med 1 volymdel dextros gelatin Veronal buffert (DGVB++; pH 7,3) som innehåller 2,5% (w/v) glukos, 2 mM MgCl2, 0,15 mM CaCl2och 0,1% (wt/vol) gelatin.
- Lägg till 1,5 x 103 CFU av bakterier till 100 µL av DGVB++ med 5% serum (NHS, hans, VDS, eller VDS + 180 nM Vn). Inkubera provet vid 37 ° C under 15 minuter med skakningar vid 300 rpm.
- Ta bort en 10 µL alikvotens från reaktionsblandningen vid 0 min (T0 prov) och 15 min (Tt prov) och plattan på Chokladagar. Inkubera plattan vid 37 ° C över natten.
- Efter inkubation, räkna kolonierna som förekommer på plattan. Beräkna procentandelen av bakterier dödade12 med hjälp av följande ekvation: (CFU på Tt) / (CFU på T0) × 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
VN-bindning till bakteriens yta bestämdes av flödescytometri. Alla Hif kliniska isolat testas i denna studie rekryterade Vn till cellytan. Ingen interaktion VN med cellytan observerades för E. coli negativ kontroll stammen (figur 1A). Som visas i figur 1B, är PH en större Vn-bindande protein på ytan av Hif celler. Bindning av Vn av WT Hif stammen orsakade M10 en förskjutning i befolkningen, medan Hif M10Δlph inte binda Vn och verkade liknar kontrollen.
Protein-protein interaktioner mellan PH och Vn uppskattades av ELISA och BLI. Rekombinant PH var tillåtet att binda med mänskliga faktorn H, Vn och C4BP (negativ kontroll) Mikrobrunnarnas brunnarna av mikrotiter ELISA-plattorna. Bundna PH uppskattades med hjälp av en anti hans pAbs. Resultaten anges tydligt en signifikant interaktion mellan PH och Vn och faktor H, jämfört med C4BP (figur 2A). Samspelet mellan PH och Vn uppskattades i realtid med hjälp BLI. Figur 2 B visar PH bindande svar kurvor för Vn-belagd sensorn ytan. Bindande affinitet (i detta fall, Kd = 2,2 µM) uppskattades av passande data till steady state bindande kinetik.
Bakterier saknar uttryck för PH på cellytan (Hif M10Δlph) uppvisade minskad följsamhet till Vn-belagda glasytor jämfört med WT celler (figur 3A). Dessutom, förbättrade närvaron av Vn på ytan av epitelceller markant adherencen av Hif (figur 3B). Dessa resultat visade att PH-Vn interaktionen bidragit avsevärt till bakteriell vidhäftning.
VN är en välkänd komplement-hämmare. För att uppskatta den komplement-hämmande aktiviteten, serum-medierad dödande undersöktes i närvaro och frånvaro av Vn. WT Hif celler uppvisade högre serum motstånd än M10Δlph mutanta celler. Inga bakterier dödades i närvaro av hans (figur 4A). Intressant, WT Hif uppvisade minskad överlevnad i VDS, och påfyllnad av Vn ökade bakteriella överlevnad. Hif M10Δlph stammen svarade dock inte på Vn utarmning eftersom det inte kunde rekrytera Vn till cellytan (figur 4B). Dessa resultat visar tydligt att Vn är en viktig värd faktor som skyddar bakterierna från komplement-medierad dödande (figur 4A-B).
Figur 1 : Haemophilus influenzae serotyp f binder Vn via yta-uttryckta PH. (A) flöde flödescytometri resultat visar bindningen av Vn till cellerna i Hif kliniska isolat. Varje kliniska isolat (5 x 106 CFU) var inkuberas med 250 nM mänskliga Vn. bundna ligand upptäcktes med hjälp av en får anti-Vn pAbs och FITC-konjugerad åsna anti får sekundära antikroppar. Escherichia coli BL21 (DE3) ingick som en negativ kontroll. Data presenteras som genomsnittlig fluorescensintensiteten från tre exemplar analyser i tre separata experiment och felstaplar representera SD. (B) flöde flödescytometri histogram visar bindningen av Vn till ytan av WT Hif M10 och PH-strykningen Hif M10Δ LPH mutant. Representativa uppgifter från en av tre separata experiment visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Rekombinant PH binder till Vn. (A), ELISA resultat visar bindningen av rekombinant PH till Vn, FH och C4BP. FH användes som en positiv kontroll, medan C4BP användes som en negativ kontroll. För att analysera protein-protein interaktioner, Vn, FH och C4BP var belagda i equimolar (50 nM) koncentrationer på brunnarna av mikrotiter plattor. Nästa, 50 nM rekombinant PH-His6x lades till. Bundna PH upptäcktes med hjälp av en HRP-konjugerad anti hans pAbs. Data som visas är de tre exemplar analyser från tre oberoende experiment och felstaplar visar SD. ***, P≤0.001. (B) BLIanalysis av PH bindningen till Vn: rekombinant Vn var orörlig på AR2G sensorer och bindande kineticsen av PH (0,25-4 µM) till Vn spelades BLI instrumentet. Equilibriumkonstant affinitet beräknades med hjälp av signaler som erhålls för varje koncentration vid jämvikt, och data var utrustade enligt steady-state kinetiken. Experimentet upprepades tre gånger, och en representativ datamängd visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Samspelet mellan PH och Vn förbättrar bakteriell adherencen till glasytor och epitelceller. (A) ljus mikroskopiska bilder visar följsamhet i Hif till Vn-belagd glasskivor. Bakterier var visualiserat genom Gramfärgning. Representativa bilder från en av tre oberoende experiment visas. Panelen har tidigare publicerats i Tidskriften Journal of Immunology7 och återges här med tillstånd från den amerikanska Association av Immunologer. (B) efterlevnad av WT Hif M10 celler till A549 epitelceller i närvaro och frånvaro av Vn, medel för tre exemplar analyser från tre oberoende experiment är ritade och felstaplar representera SD. *, p ≤0.05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Vn rekryteras till Hif cellens yta skyddar bakterier från serum-medierad dödande. (A) WT Hif M10 och mutant Hif M10Δlph inkuberades i 15 min i 5% NHS eller hans. (B) motstånd av Hif M10 och Hif M10Δlph till bakteriedödande effekter i 5% VDS och VDS kompletteras med 250 nM renat Vn. Data representerar tre exemplar analyser från tre oberoende experiment och felstaplar visar SD. ***, p ≤0.001; NS, ej signifikant. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakteriella patogener rekrytera Vn till cellytan och utnyttja detta komplement regulator för att hindra nedfall av komplementfaktorer och slutförandet av membran attack complex2. VN fungerar även som en bro molekyl mellan bakteriella ytproteiner och värd cellreceptorer yta, vilket gör att patogener att följa ytan av epitelceller och därefter medla internalisering. I denna studie beskriver vi protokoll som kan användas för att uppskatta i) bindningen av Vn till ytan av bakterieceller, ii) protein-protein interaktioner och affinitet konstanter, och iii) den funktionella rollen för Vn att tillhandahålla serum motstånd och förbättring av följsamhet till ytan av värdceller.
Flödescytometri är en kvantitativ teknik som vanligen används för att verifiera att bakterier binda Vn. Dock måste Vn koncentrationen optimeras, som Vn-bindande kapacitet (och olika receptorer) kan variera beroende på bakteriearter. I analysen beskrivs här, användes 1 – 100 µg/mL Vn för att beräkna linjär bindande och mättnad parametrar. Jämförelse av de bindande mönster av WT Hif, Hif M10Δlph mutant och negativ kontroll E. coli celler visade en tydlig skillnad med en Vn koncentration på 20 µg/mL (250 nM). Därför användes denna koncentration i alla flöde flödescytometri experiment. Användningen av Vn i halter över mättnad kan ge falskt positiva signaler. Utspädning av primära och sekundära antikroppar måste också optimeras separat för varje patogen. Maximal utspädning av antikroppar visar en bra signal bör väljas. I denna studie använde vi 2,5% BSA som en blockerande medel. BSA är dock inte en universell blockerande reagens passar alla patogener. I fall där BSA inte blockerar ospecifik antikropp interaktioner, kan andra blockerande reagenser användas, till exempel fisk gelatin. Bindningen av Vn till ytan av bakteriella patogener celler är ofta medieras av flera receptorer21,22. Vissa receptorer har hög Vn-affinitet, medan andra kan uppvisa låg affinitet. Radering av endast en gen som kodar för ett protein som surface kan således inte resultera i en minskning av Vn interaktioner bedömas av flödescytometri. Som ett alternativ till flödescytometri, kan proteinbindning på bakteriella cellens yta undersökas med hjälp av ett immunofluorescens assay (IFA) eller transmissionselektronmikroskopi (TEM). Även om fotoblekning fluororeagent-konjugerade antikroppar kan vara problematiska i både flödescytometri och IFAs, innebär TEM besvärliga provberedning, med betydande risk för att införa artefakter23,24. Flödescytometri Flödesanalys är faktiskt bättre att IFA och TEM på grund av enklare prov förberedelse protokoll och möjlighet att testa många prover inom en kort tidsram.
Protein-protein interaktioner i en cell gratis system analyserades av ELISA (figur 2A) och BLI (figur 2B). I båda dessa tekniker var en av de bindande partnerna immobiliserade, antingen på en biosensor (för BLI) eller en mikrotiterplattan (ELISA). Fördelen med BLI och ELISA är att de analys av protein-protein interaktioner i sitt ursprungliga tillstånd, förhindrar ospecifik interaktioner utanför det aktiva bindningsstället. Nyttan av BLI, kan dock begränsas beroende på immobilisering tekniken används. Den aminen koppling förfarande används här slumpmässigt bildar ett amide band mellan alla surface-exponerade amingrupp av protein och ytan av biosensor. Detta resulterar i immobilisering av proteinmolekyler på ytan av sensorn i olika inriktningar. Detta kan resultera i heterogena bindning som inte passar en 1:1 bindande kinetik modell. Detta potentiella problem kan lösas genom att välja biotin sensorer och lägga till en streptividin-tagg i rekombinanta proteinet att immobiliseras. Tillförlitligheten i BLI är liknande till det av ytan plasmon resonans (SPR). Föreningen och dissociation av molekyler kan mätas i realtid med hjälp av antingen teknik. Dock BLI enheten använder inte mikrofluidik, och är därför lätt att underhålla. Dessutom kan 96 interaktioner provas samtidigt i BLI, medan endast fyra prover på en gång kan testas med hjälp av SPR. Det finns en annan kritiska steg i BLI som måste optimeras. Om sensorer återanvänds, bör regenerering villkor också vara optimerad, som kan variera för varje protein-protein komplex. I denna studie var 10 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt funnit lämpliga för sensor regenerering.
Rollen som Vn i bakteriell vidhäftning testades direkt med glasytor belagda med Vn. Detta tillvägagångssätt kan användas för att analysera bindande för någon bakterie patogen, inklusive både gramnegativa och -positiva bakterier. Detta är en semikvantitativa teknik som ger snabb bedömning av en patogen kapacitet för bindning till Vn. För att få rimliga resultat, måste Vn beläggning optimeras. Beläggning med Vn på 1, 2 och 5 µg/mL undersöktes i analysen beskrivs här, och 2 µg/mL befanns vara den mest lämpliga koncentrationen för experiment utfördes i denna studie (figur 3A). Överskjutande Vn belagd på ytan kunde skapa ett tjockt lager som kan enkelt demonteras under provet fastställande och färgning. Dessutom bör den bakteriella kulturen inte ha stora klumpar av celler; Detta kan undvikas genom vortexa kulturen innan du lägger till en alikvot till bilderna.
Bakteriell vidhäftning till ytan av epitelceller undersöktes med hjälp av en tallrik-räkna teknik (figur 3A). Också måste denna analys vara noggrant optimerad för att möjliggöra observation av Vn roll i bakteriell vidhäftning. Vn har olika bindningsställen för bakterier (på C-terminus) och cell surface integrin receptorer (på N-terminala RGD bindande platsen). Bindningen av Vn till integriner inducerar upptag av integrin-Vn komplexa1och signalering. Om sådana komplex är internaliserat utan bakterier, blir resultatet svåra att tolka. Därför måste Vn läggas till de epitelceller enskiktslager vid 4 ° C. När Vn har mättat integrin receptorer på epitelial cellytan, måste överskott Vn tvättas bort, som gratis Vn kan blockera bakteriell Vn-beroende integrin bindande. I denna analys, uppskattade vi totalt bakteriell räknar associerade med epitelceller (dvsden avläsningssystem som omfattade både surface-anslutna och internaliserat bakterier). Denna analys kan förlängas för att skilja mellan externa och intracellulära bakteriella populationer genom behandling med gentamicin4.
Den bakteriedödande analysmetod i serum används i protokollet beskrivs här ändrades delvis från de tidigare publicerade förfarande12,22. I analysen beskrivs här, 1,5 x 103 CFUs av Hif inkuberades med 5% NHS för 15 min, 5 min längre än i den tidigare beskrivna assay (figur 4A). Skillnaden mellan WT Hif och syngena mutant saknar PH var mer uppenbart på 15 min än vid 10 min. Därför valt vi 15 min inkubationstiden för detta särskilda experiment. Bakteriedödande effekterna av serum beror på koncentrationen i serum, tid för inkubation och antalet bakterier. Alla patogener uppvisar en anmärkningsvärd kapacitet för att undvika den antibakteriella effekten av serum; vissa patogener kan vara helt resistent mot serum, medan andra kan vara måttligt resistenta eller känslig. Serumkoncentration måste därför optimeras för varje specifik patogen undersökt. Serumet döda analys beskrivs här är dock begränsat till studiet av gramnegativa bakterier, eftersom serum har ingen signifikant bakteriedödande effekt på grampositiva celler1,5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga ekonomiska intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av bidrag från den Foundation i Anna och Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. och Edla Johansson stiftelse, den medicinska forskningsrådet (bevilja nummer K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), Stiftelsen Cancer vid universitetet Sjukhuset i Malmö, Fysiografiska samhället (Forssman's Foundation), och Skåne landstingets forskning och Development Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
References
- Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
- Hallstrom, T., et al. Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif. PloS one. 11 (1), 0147709 (2016).
- Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation. Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).
- Singh, B., et al. A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells. Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).
- Kohler, S., et al. Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3. Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).
- Onelli, E., Citterio, S., O'Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips. Planta. 202 (2), 188-195 (1997).
- Al-Jubair, T., et al. Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells. J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).
- Martinez-Martin, N. Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions. J. Immunol. Res. 2017, 2197615 (2017).
- Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions. Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry. Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity. Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).
- Ronander, E., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity. J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Fleury, C., et al. Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance. J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
- McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Microscopy and image analysis. Current protoc. Hum. Genet. , Chapter 4 Unit 4 4 (2005).
- Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).
- Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism. Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance. J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).
- Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors. Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).
- Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii. New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).
- Pinne, M., Haake, D. Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins. J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).
