Summary
Este informe describe los protocolos para la caracterización de las interacciones entre proteínas de membrana externa bacteriana y la vitronectina de regulador del complemento humano. Los protocolos pueden utilizarse para estudiar las reacciones de enlace y función biológica de vitronectina en cualquier especie bacteriana.
Abstract
Las bacterias utilizan reguladores del complemento como un medio de evadir la respuesta inmune del huésped. Aquí, describimos protocolos para la evaluación de la adquisición de vitronectina de papel en los juegos de célula bacteriana superficial en la resistencia al sistema inmune anfitrión. Experimentos de citometría de flujo identifican vitronectina de plasma humano como un ligando de la proteína de membrana externa bacteriana del receptor H de Haemophilus influenzae tipo f. Un análisis enzima-ligado del inmunosorbente era empleado para caracterizar las interacciones proteína-proteína entre proteínas recombinantes purificadas H y vitronectina y atar afinidad se evaluó mediante interferometría de la bio-capa. La importancia biológica de la Unión de la vitronectina a H la proteína en la superficie de la célula bacteriana en evasión de la respuesta inmune del huésped fue confirmada usando una prueba de resistencia de suero con suero humano normal y vitronectina-agotado. La importancia de la vitronectina en la adhesión bacteriana se analizó utilizando portaobjetos de vidrio con y sin recubrimiento de vitronectina, seguido de la tinción de Gram. Por último, se investigó la adherencia bacteriana a las monocapas de células epiteliales alveolares humanas. Los protocolos descritos aquí pueden adaptarse fácilmente al estudio de cualquier especies bacterianas de interés.
Introduction
Vitronectina (Vn) es una importante glucoproteína humana implicados en el mantenimiento de la homeostasis a través de la regulación del sistema fibrinolítico. VN también funciona como un regulador del complemento mediante la inhibición de la vía del complemento terminal durante la formación de complejos de C5b6-7 y la polimerización de C9. Varios patógenos bacterianos se han demostrado para reclutar Vn a la superficie celular como medio de resistencia complemento deposición1,2,3. Además, Vn funciona como una molécula "sandwich" entre bacterias y receptores de las células epiteliales host, tal modo de promover la adhesión y la internalización de patógenos2,4,5. Unión de Vn a la superficie de la célula bacteriana está mediada por otras proteínas actualmente no identificados. Elucidar completamente el papel funcional de Vn-enlace de evasión de la respuesta inmune de la manguera por lo tanto requerirá identificación de proteínas Vn-reclutamiento.
El paso inicial en la identificación de proteínas de unión a Vn es probar si un patógeno de interés puede enlazar purificada Vn. flujo cytometry es un método conveniente y sencillo para determinar si Vn está limitado a las células del patógeno. En este estudio, se evaluó el atascamiento de Vn a varios Haemophilus influenzae tipo f (Hif) aislamientos clínicos6. El método descrito en este documento es cuantitativo y puede utilizarse para distinguir la capacidad de unión de una gran variedad de cepas bacterianas. En un estudio anterior hemos caracterizado proteína H (PH) de Hif como Vn vinculante proteínas7. Por lo tanto, en el presente estudio, el potencial de unión a Vn de los mutantes de tipo salvaje (WT) Hif y Hif M10Δlph se compararon utilizando los protocolos descritos.
Una vez que determine que un patógeno une Vn, el segundo paso es caracterizar el proteoma superficial con el fin de identificar potenciales proteínas Vn. Una variedad de enfoques se puede utilizar para este propósito8,9, pero estas metodologías no se describen en este informe. El método más adecuado para examinar las interacciones proteína-proteína es expresar las proteínas de la superficie bacterianas de e. coli por vía recombinante y purificar por cromatografía de afinidad. Aquí, utilizamos el PH y su interacción molecular con Vn para ilustrar el método. Interacciones entre recombinante PH y Vn se caracterizaron usando una enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) de ensayo7 y una técnica recientemente desarrollada etiqueta-libre conocido como bio-capa interferometría (BLI)10,11. Mientras que Elisa puede utilizarse para confirmar las interacciones proteína-proteína, BLI proporciona datos detallados sobre los parámetros cinéticos de la interacción.
Para estudiar el papel funcional de Vn en la adhesión bacteriana, se pueden utilizar dos diferentes ensayos. El primer ensayo que se describe aquí es la medición directa de la adherencia bacteriana a las superficies de vidrio recubierto de Vn, mientras que el segundo ensayo examina adhesión a la superficie de las células epiteliales. Para el primer ensayo, portaobjetos fueron recubiertos con Vn y el atascamiento de WT o estirpes mutantes de Hif se evaluó por tinción de Gram y microscopía. Esta técnica distingue fácilmente las bacterias basadas en la capacidad de atar Vn12. Luego se analizó la adherencia bacteriana a las células de mamífero mediante la adición de bacterias cultivadas sobre una monocapa de células epiteliales alveolares de tipo II; fijación bacteriana se evaluó contando el número de la Colonia formando unidades (UFC). Bacterias adheridas e interiorizadas se pueden diferenciar en la presencia o ausencia de Vn4,13.
El papel de la adquisición de Vn en la resistencia bacteriana del suero fue evaluado usando un análisis de muerte de suero (es decir, la actividad bactericida del suero). Para evaluar la importancia de la adquisición de Vn en resistencia de suero, la actividad bactericida del suero Vn-agotado (VDS) se comparó con la del suero humano normal (NHS). El método utilizado fácilmente distingue Vn vinculante frente a bacterias no vinculante basadas en resistencia de suero. Utilizamos este método para estudiar el papel de Vn en la resistencia de suero de varios patógenos bacterianos4,12.
Se han reportado numerosos métodos para el estudio de las interacciones huésped-patógeno. Aquí, describimos un conjunto de protocolos que se pueden adaptar fácilmente al estudio de cualquier agente patógeno con el fin de evaluar el papel de Vn en patogenesia. Hemos probado estos protocolos utilizando diversos agentes patógenos, y Hif fue elegido como un ejemplo para este informe.
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Protocol
1. Análisis de Vn como un ligando de la proteína bacteriana de la superficie
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Detección de Vn-atascamiento en la superficie bacteriana mediante citometría de flujo
Nota: En citometría de flujo, utilizamos lado dispersión y dispersión hacia delante para puerta de sucesos positivos. Para examinar las interacciones con Vn, Hif clínico aislados (n = 10) fueron seleccionados7 junto con e. coli BL21 (DE3) como control negativo (figura 1A).- Cultura Hif clínico aislados de cerebro corazón infusión (BHI) suplementado con 10 μg/mL NAD y hemina a 37 ° C con agitación a 200 rpm. Uso medio de Luria-Bertani a la cultura de e. coli14. Cosecha de Hif en fase logarítmica media (OD600 = 0.3)15y resuspender las bacterias en tampón fosfato salino (PBS), pH 7,2, que contiene 1% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA) (solución amortiguadora de bloqueo; PBS-BSA). Ajustar la suspensión a 109 UFC/mL.
- Transferencia las alícuotas que contienen 5 x 106 UFC para tubos de fondo redondo poliestireno de 5 mL (12 x 75 mm2) y añadir 1 mL de solución amortiguadora de bloqueo. Centrifugar la suspensión a 3.500 × g a temperatura ambiente (RT)16 durante 5 minutos para las bacterias de la pelotilla, y luego aspirar con cuidado para retirar el sobrenadante sin perturbar el pellet.
- Vuelva a suspender los pellets bacterianos con 50 μL de solución amortiguadora de bloqueo que contiene 250 nM Vn e incubar las muestras durante 1 hora a temperatura ambiente sin agitar. Después de la incubación de la pelotilla de las bacterias por centrifugación a 3.500 x g durante 5 min, luego lavar los gránulos tres veces con PBS y pasos de centrifugación similares.
- Para el pellet bacteriano, añada 50 μL de ovejas primaria contra Vn policlonales (pAbs) en dilución 1: 100 en PBS-BSA. Incubar la suspensión durante 1 h a temperatura ambiente, luego lavar las bacterias tres veces con PBS para eliminar los anticuerpos no Unidos (como se describe en el paso 1.1.3).
- A continuación, añada 50 μL de PBS-BSA con isotiocianato de fluoresceína (FITC)-conjugados burro anti-oveja PAB (dilución 1: 100) e incube a temperatura ambiente durante 1 h en la oscuridad.
- Preparar un control en blanco incubando las bacterias con el bloqueo solamente de buffer y PAB sin Vn.
- Lave las bacterias tres veces con 1 mL de solución amortiguadora de bloqueo y la suspensión de pellets por centrifugación, como se describe en la sección 1.1.2. Finalmente, Resuspender el precipitado bacteriano con 300 μL de PBS y analizar mediante citometría de flujo7.
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Análisis de ELISA de la interacción entre PH recombinante y Vn
Nota: Los controles deben ser incluidos para excluir el atascamiento no específico. Proteína humana del Factor H (FH) o unión a C4b (C4BP) se utilizan como controles positivos y negativos, respectivamente.- Diluir cada una de las proteínas humanas (Vn FH y C4BP) por separado a 50 nM en Tris-HCl, pH 9.0 (tampón de recubrimiento). Añada 100 μl de solución de proteína en cada pocillo de una microplaca Polysorp. Cierre las placas con la tapa y almacenar a 4 ° C durante la noche (16 h) para facilitar la inmovilización de proteínas sobre pocillos de la placa.
- Deseche la solución de la placa de microtitulación inclinando hacia abajo sobre el fregadero y lavar los pocillos 3 veces con 300 μL de PBS/pozo. Bloquear los pocillos recubiertos por 1 h a temperatura ambiente con PBS conteniendo 2,5% (p/v) de BSA (BSA-PBS).
- Después de retirar la solución de bloqueo, lavar los pocillos 3 veces con 300 μL de PBS que contenga 0.05% (v/v) Tween 20 (SAFT) por pozo. Añada 100 μl de recombinante de nM 50 PH su etiquetado a cada muestra así e incubar durante 1 h a TA. En pozos de control, agregar 100 μl de PBS-BSA.
Nota: El PH de Hif la codificación del gene de la lph fue amplificado por PCR y clonado en el vector de expresión pET26b que añade una 6 × su-etiqueta en el c-término de la proteína expresada. El vector recombinante fue transformado en e. coli BL21(DE3) para la expresión. Ni-NTA resina se utiliza para purificar la proteína recombinante15. - Deseche la solución de la proteína y eliminar las proteínas no Unidas por lavar los pocillos 3 veces con 300 μL de SAFT por pozo. Añada 100 μl de PBS-BSA con rábano picante con peroxidasa (HRP)-conjugado anti-su PAB (1:10, 000 dilución) e incubar 1 h a TA.
- Preparar solución de 20 mM A disolviendo Tetrametilbencidina en una solución de 5% de acetona y el 45% de metanol. Para preparar la solución B, disolver 19,2 g de ácido cítrico en 1.000 mL de H2O, ajustar el pH a 4.25 por adición de KOH y luego añadir 230 μl de 30% H2O2. Almacenar ambas soluciones en la oscuridad a TA. Justo antes del uso, mezclar 500 μl de la solución B con 9,5 mL de solución A preparar el reactivo de detección de ELISA.
- Lavar los pozos tres veces con 300 μL de SAFT por pozo y detectar complejos antígeno-anticuerpo mediante la adición de 100 μl de reactivo de detección ELISA a cada pocillo.
- Añadir 50 μl de 1 M H2hasta4/well para detener la reacción. Medir la densidad óptica de los pocillos a 450 nm utilizando un lector de microplacas.
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Estudio de la cinética de interacción de recombinante PH y Vn con BLI
- Inmovilizar Vn humano en sensores reactivos amina amina acoplamiento método, según directrices11 el fabricante.
- En serie con PBS, diluir el ligando (recombinante PH) de 0 a 4 μm y transferir las soluciones resultantes a una microplaca de 96 pozos negros, fondo plano. Ejecutar el experimento a 30 ° C usando un instrumento BLI del17.
- Cargue la carpeta de datos en el software de análisis de datos BLI. Seleccione la opción 'sensor selección' . A continuación, seleccione 'referencia bien' (sensor de Vn-revestida en PBS) para la resta.
- Seleccione 'alinear el eje y a la línea de base' y 'interstep corrección y alinear a la Asociación'. Pulse 'datos de proceso' que se abren automáticamente la ficha de análisis.
- En la ficha de análisis, seleccione la opción 'Asociación y disociación' el ajuste de curvas. Seleccione el modelo de ' Unión 1:1 y conexión global'. Pulse 'ajustar curva' y exportación ajuste datos17.
2. Caracterización del papel de Vn en la adhesión bacteriana
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Estudio de la adherencia bacteriana a las superficies de vidrio recubierto de Vn
- Preparar una solución de 2 μg/mL de Vn en PBS y pipetee 10 μl de esta solución en un microscopio de vidrio Deslice como una sola gota. Permitir que la gota se seque sobre el portaobjetos durante 30 min a TA. capa una diapositiva con albúmina sérica humana (HSA) como control negativo.
- Lavar los portaobjetos de vidrio recubierto de proteína tres veces sumergiendo los portaobjetos durante dos segundos en un vaso de precipitados que contiene PBS para eliminar el exceso proteína sin recubrimiento. Añadir 20 mL de cultivo fresco de Hif (descrito en el paso 1.1.1) en un plato de petri de plástico estéril y sumergir la Vn- / vidrio revestido de HSA se desliza en el medio de cultivo. Incubar los platos a 37 ° C por 1 h con agitación a 20 rpm.
Nota: Hif M10 y Hif M10Δlph fueron cultivadas en medio BHI líquido o en placas de agar chocolate. El medio para el mutante de la lph fue suplementado con 10 μg/mL de kanamicina15. - Después de la incubación, retirar cualquier bacteria sumergiendo los portaobjetos tres veces en un vaso de precipitado con PBS. Visualizar las bacterias por tinción de Gram, como se describe.
- Quitar exceso PBS de cada diapositiva inclinándolo y contacto con el borde en papel de seda. Deje secar al aire los portaobjetos durante 3-5 min a temperatura ambiente y se fijan bacterias adheridas pasando cada diapositiva 3 veces sobre una llama.
- Sujete la corredera por los bordes con dos dedos en una bandeja de tinción, luego agregar 3 – 4 gotas (200 – 300 μL) de solución de violeta cristal de 2.3%. Espera 60 s, después lave el portaobjetos bajo un chorro suave del grifo de agua para 3 – 4 s.
- Añadir 3-4 gotas de solución de yodo de 0,33% en las diapositivas. Espere 1 minuto, luego enjuagar el portaobjetos bajo un chorro suave de agua del grifo. Seque cuidadosamente las diapositivas por papel secante.
- Añadir 3-4 gotas de solución decolorante alcohol isopropílico al 75% y 25% de acetona en la diapositiva. Después de 5 a 10 s, lavar el portaobjetos bajo un chorro suave de agua del grifo.
- Añadir 3-4 gotas (200 – 300 μL) de solución básica carbolfuchsin. Espere 1 minuto, luego enjuague los portaobjetos bajo un chorro suave de agua del grifo. Seque el portaobjetos con papel secante.
- Visualizar las bacterias bajo el microscopio de luz, seleccionar un objetivo de inmersión en aceite a 100 X de aumento18. Comparar la adherencia de la WT de Hif y bacterias mutantes en las superficies de vidrio recubiertas de Vn y HSA.
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Estudio de adherencia Vn-dependientes de las bacterias a las células epiteliales
Nota: Este análisis eficiente adherencia fue utilizado en nuestros estudios anteriores4,7.- Cultura A549 (células tipo II alveolares epiteliales) en un matraz de cultivo de tejidos de 75 cm2 con F12 suplementado con 10% de suero de ternero fetal (vol/vol) (FCS) (medio completo) y 5 μg/mL gentamicina. Incube el frasco en una incubadora con 5% CO2 a 37 ° C por 3 días hasta 80% confluente (confluencia puede estimarse al visualizar la cobertura de la superficie de las células con microscopio invertido). Los cuatro pasos siguientes describen cómo preparar las células epiteliales para el ensayo19,20.
- Lavar la monocapa de células en el frasco dos veces con 20 mL de PBS agitando suave. Para separar las células de la superficie del frasco, agregar 2 mL de solución de enzima de desprendimiento de células e incubar el matraz durante 5 min a 37 ° C. Golpear el frasco con su palma para separar todas las células de la superficie de plástico. Pipetee hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces para dispersar a grupos de células.
- Agregar 18 mL de medio completo F12 al matraz y transferir la suspensión de toda la célula a un tubo estéril de Falcon de 50 mL. Centrifugar la suspensión celular por 5 min a 200 x g a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante. Resuspender el precipitado de células en 10 mL de medio completo F12.
- Extraiga 10 μl de la suspensión de células y colocar en un tubo Eppendorf, luego agregar 90 μl de solución de azul tripán. Cargar la muestra en un hemocitómetro (profundidad de 0,1 mm) después de colocar el cubreobjetos.
- Contar todas las células viables en las zonas A, B, C y D (cada campo consta de 16 cuadrados y cada cuadrado tiene una superficie de 0.0025 mm2), luego calcular el número promedio de células ([A + B + C + D] / 4). Calcular el número de células por mililitro, utilizando la siguiente ecuación:
Células viable/mL = promedio células cuenta × 104 × dilución factor20.
Nota: Aquí, el factor de dilución es 10. - Diluir la suspensión de células a 5.0 x 103 células/mL usando gentamicina de 5 μg/mL con medio completo. Pipetear 500 μL de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pozos. Incubar la placa a 37 ° C en 5% de CO2 hasta que las células son 90% confluente.
- Antes de una infección bacteriana, eliminar el medio de los pozos y añadir medio de F12 (sin FCS), luego incubar durante una noche a 37 ° C.
- Lavar la monocapa celular tres veces con 500 μl de PBS en lugar del RT. la placa de hielo y añadir 100 μl de medio de F12 previamente refrigerado que contiene 10 μg/mL de Vn. Incubar la placa a 4 ° C por 1 h. Para los pozos de control, agregar únicamente medio de F12.
- Después de la incubación, deseche la solución mediante pipeteo y lavar la capa de células dos veces con 1 mL de PBS en RT. resuspender una cultura recién crecido Hif M10 (paso 1.1.1) en medio F12 (2 × 108 UFC/mL). Añadir 100 μl de esta suspensión bacteriana a cada pozo e incubar la placa por 2 h a 37 ° C.
Nota: Cada uno bien contiene aproximadamente 2 x 105 A549 células. Para la infección, 2 x 107 UFC bacteriana fueron agregados, correspondientes a una multiplicidad de infección de 100. - El medio mediante pipeteo Lave y las células epiteliales A549 tres veces con PBS. Añadir 50 μL/pocillo de solución de la separación de células e incubar la placa por 5 min a 37 ° C.
- A continuación, añada 50 μl de medio completo F12 por pozo para detener la reacción enzimática. Transferencia de las células epiteliales (≈100 μL [es decir, el volumen entero]) de cada bien a un tubo de vidrio de 6 mL que contiene cuatro bolas de cristal. Lyse las células en el RT con un vórtex durante 2 minutos.
- Diluir 10 μl de la célula lisada 100-fold añadiendo 10 μl de lisado a 990 μl de medio de F12. Placa 10 μl de la muestra diluida en una placa de agar chocolate.
- Incubar la placa de agar chocolate a 37 ° C durante la noche, y luego contar las colonias. Cada colonia representa una UFC.
- Cultura A549 (células tipo II alveolares epiteliales) en un matraz de cultivo de tejidos de 75 cm2 con F12 suplementado con 10% de suero de ternero fetal (vol/vol) (FCS) (medio completo) y 5 μg/mL gentamicina. Incube el frasco en una incubadora con 5% CO2 a 37 ° C por 3 días hasta 80% confluente (confluencia puede estimarse al visualizar la cobertura de la superficie de las células con microscopio invertido). Los cuatro pasos siguientes describen cómo preparar las células epiteliales para el ensayo19,20.
3. Análisis de la resistencia Vn-dependiente a la actividad bactericida del suero humano
- NHS de la compra de una fuente comercial. Preparar VDS como se describió anteriormente12. Reponer el VDS con 180 nM Vn equivalente a Vn presente de NHS.
- Preparar suero inactivado con calor (HIS) calentando el NHS a 56 ° C por 30 min para inactivar proteínas del complemento.
Nota: La concentración óptima del suero (5%) y tiempo de incubación (15 min) para el ensayo que se describe en pasos 3.3 – 3.7 se determinaron empíricamente por Hif15; estos parámetros podrían variar para otros patógenos bacterianos. - Bacterias (en este caso, Hif M10 y el mutante Hif M10Δlph) de la cultura a la fase de registro medio (OD600 = 0.3). De la pelotilla de las bacterias por centrifugación a 3.500 x g por 10 min.
- Resuspender el precipitado bacteriano con 1 volumen de dextrosa gelatina Veronal búfer (DGVB++; pH 7.3) con 2,5% (p/v) glucosa 2 mM de MgCl2, 0.15 mM CaCl2y 0,1% (peso/vol) gelatina.
- Añadir 1,5 x 103 UFC de bacteria a 100 μl de DGVB++ que contiene 5% de suero (NHS, sus, VDS, o VDS + 180 nM Vn). Incubar la muestra a 37 ° C durante 15 min con agitación a 300 rpm.
- Quitar una alícuota de 10 μl de la mezcla de reacción en el minuto 0 (T0 de muestra) y 15 min (Tt de muestra) y placa de agar chocolate. Incubar la placa a 37 ° C durante la noche.
- Después de la incubación, contar las colonias que aparecen en la placa. Calcular el porcentaje de bacterias mató12 utilizando la siguiente ecuación: (UFC Tt) / (UFC en T0) × 100.
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Representative Results
VN-Unión a la superficie de las bacterias fue determinada por citometría de flujo. Hif todos los aislados clínicos probados en este estudio reclutó a Vn a la superficie de la célula. Se observó ninguna interacción de Vn con la superficie de la célula para la cepa de control negativo e. coli (figura 1A). Como se muestra en la figura 1B, el PH es una importante proteína Vn en la superficie de las células de Hif. Encuadernación de Vn por la cepa WT Hif M10 había causada un cambio en la población, mientras que Hif M10Δlph no vinculan a Vn y parecían similares al control.
Las interacciones proteína-proteína entre PH y Vn se estimaron por ELISA y BLI. PH recombinante fue permitido enlazar con factor humano H, Vn y C4BP (control negativo) recubierto de microtitulación placas ELISA. Límite PH se estimó usando un PAB anti-su. Los resultados indican claramente una interacción significativa entre el PH y Vn y factor H, en comparación con C4BP (figura 2A). Interacción entre el PH y Vn se estimaron en tiempo real utilizando BLI. Figura 2 B muestra curvas de enlace PH de la superficie del sensor recubierto de Vn. Afinidad de unión (en este caso, Kd = 2,2 μm) se estimó ajustando los datos de cinética de estado estacionario obligatorio.
Bacterias falta expresión del PH en la superficie celular (Hif M10Δlph) exhibida reducen adherencia a las superficies de vidrio recubierto de Vn en comparación con células de peso (figura 3A). Además, la presencia de Vn en la superficie de las células epiteliales había mejorado significativamente la adherencia de Hif (figura 3B). Estos resultados indicaron que la interacción PH-Vn contribuyó significativamente a la adherencia bacteriana.
Vn es un inhibidor del complemento bien conocido. Para estimar la actividad inhibidora de complemento, suero mediada por homicidio fue examinado en la presencia y ausencia de células Vn. WT Hif exhibieron resistencia de suero más alta que las células mutantes de M10Δlph . No bacterias fueron asesinadas en presencia de su (elfigura 4A). Curiosamente, Hif WT exhibió una supervivencia reducida en VDS y reposición de Vn aumento de la supervivencia bacteriana. Sin embargo, la cepa de Hif M10Δlph no respondió a Vn agotamiento porque no podría reclutar a Vn a la superficie de la célula (figura 4B). Estos resultados demuestran claramente que Vn es un factor importante del anfitrión que protege las bacterias de la matanza mediada por complemento (figura 4A-B).
Figura 1 : Haemophilus influenzae serotipo f ATA Vn via expresa superficie pH. (A) flujo cytometry resultados mostrando Unión de Vn a las celdas de aislamientos clínicos de Hif. Cada aislamiento clínico (5 x 106 UFC) se incubó con 250 humanos nM Vn. limite ligando fue detectado usando una oveja anti-Vn PAB y burro conjugado con FITC ovejas contra anticuerpos secundarios. Escherichia coli BL21 (DE3) se incluyó como control negativo. Los datos se presentan como la intensidad de fluorescencia media del análisis por triplicado en tres experimentos independientes y barras de error representan SD. (B) flujo cytometry histogramas demostrando Unión de Vn a la superficie de Hif WT M10 y eliminación PH Hif M10Δ mutante de la LPH . Se muestran datos representativos de uno de tres experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : PH recombinante se une al Vn. (A) ELISA resultados demostrando la Unión de PH recombinante y Vn, FH, C4BP. FH se utilizó como control positivo, mientras que C4BP se utilizó como control negativo. Para analizar las interacciones proteína-proteína, Vn, FH y C4BP fueron revestidos de equimolares (50 nM) las concentraciones en los pocillos de las placas de microtitulación. A continuación, recombinante de nM 50 PH-His6x fue agregado. Límite PH fue detectado usando un conjugado con HRP contra su PAB. Datos mostrados son los medios de los análisis por triplicado de tres experimentos independientes, y barras de error indican SD. ***, P≤0.001. (B) BLIanalysis Unión PH a Vn: Vn recombinante fue inmovilizada en sensores de AR2G y la cinética de unión del PH (0.25-4 μm) a Vn se registraron con el instrumento BLI. La constante de afinidad de equilibrio se calculó usando señales obtenidas para cada concentración en el equilibrio, y los datos se ajustaron según la cinética de estado estacionario. El experimento fue repetido tres veces, y se muestra un conjunto de datos representativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Interacción entre PH y Vn mejora la adherencia bacteriana a las superficies de cristal y las células epiteliales. (A) luz imágenes microscópicas que muestran adherencia del Hif a portaobjetos de vidrio recubierto de Vn. Las bacterias fueron visualizadas por tinción de Gram. Se muestran imágenes representativas de uno de tres experimentos independientes. Este panel fue previamente publicado en la Revista de Inmunología7 y se reproduce aquí con permiso de la Asociación Americana de inmunólogos. (B) adherencia de WT Hif M10 células A549 células epiteliales en presencia y ausencia de Vn, se trazan los medios de los análisis por triplicado de tres experimentos independientes y barras de error representan SD. *, p ≤0. 05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Vn reclutada a la superficie de la célula de Hif protege a las bacterias de matanza mediada por suero. (A) peso Hif M10 y mutante Hif M10Δlph se incubaron durante 15 min en 5% NHS o su. (B) resistencia de Hif M10 y Hif M10Δlph a bactericida efectos en 5% VDS y VDS suplementado con 250 nM purificada Vn. datos representan medios de análisis por triplicado de tres experimentos independientes, y barras de error indican SD. ***, p ≤0.001; NS, no significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Patógenos bacterianos reclutan Vn a la superficie de la célula y utilizan este regulador complemento para evitar la deposición de los factores de complemento y completar el complejo de ataque de membrana2. VN también funciona como una molécula puente entre proteínas de la superficie bacterianas y receptores de superficie celular host, permitiendo así que los patógenos se adhieren a la superficie de las células epiteliales y posteriormente median internacionalización. En este estudio, se describen los protocolos que pueden utilizarse para estimar i) Unión de Vn a la superficie de las células bacterianas, interacciones proteína-proteína ii) y las constantes de afinidad y iii) el papel funcional de Vn en el suministro de suero resistencia y mejora de adherencia a la superficie de las células del huésped.
Citometría de flujo es una técnica cuantitativa suele utilizada para comprobar que las bacterias unen Vn. Sin embargo, la concentración de Vn debe optimizarse, como la capacidad de unión de Vn (y varios receptores) pueden variar dependiendo de la especie bacteriana. En el análisis aquí descrito, 1-100 μg/mL de Vn fueron utilizados para estimar parámetros de saturación y Unión lineal. Comparación de los patrones de la Unión de Hif WT, el Hif M10Δlph mutante y control negativo e. coli células mostró una clara diferencia en concentración de 20 μg/mL Vn (250 nM). Por lo tanto, esta concentración fue utilizada en los experimentos de citometría de flujo. El uso de Vn en concentraciones por encima del punto de saturación puede producir señales de falsos positivos. Dilución de los anticuerpos primarios y secundarios también se debe optimizar por separado para cada patógeno. Debe elegirse la máxima dilución de anticuerpos mostrando una buena señal. En este estudio, utilizamos BSA 2.5% como un agente de bloqueo. Sin embargo, la BSA no es un reactivo de bloqueo universal adecuado para todos los patógenos. En los casos en que BSA no bloquea las interacciones de anticuerpos no específicos, pueden utilizarse otros reactivos bloqueo, tal como gelatina de pescado. Unión de Vn a la superficie de las células del patógeno bacteriano está a menudo mediada por múltiples receptores21,22. Algunos receptores tienen alta afinidad Vn, mientras que otros pueden presentar afinidad baja. Por lo tanto, supresión de solamente un gen que codifica una proteína de la superficie no podría producir una disminución en interacciones de Vn determinado por citometría de flujo. Como alternativa a la citometría de flujo, Unión a proteínas en la superficie de la célula bacteriana puede ser examinada mediante un análisis de la inmunofluorescencia (IFA) o la microscopía electrónica de transmisión (TEM). Aunque fotoblanqueo de anticuerpos conjugados con fluororeagent puede ser problemático en citometría de flujo y IFAs, TEM involucra preparación engorrosa, con riesgo significativo de introducción de objetos23,24. Análisis de citometría de flujo es ciertamente preferible a IFA y TEM debido a protocolos de preparación de muestra más simples y la posibilidad de probar muchas muestras en un corto plazo.
Las interacciones de la proteína-proteína en un sistema libre de células se analizaron por ELISA (figura 2A) y BLI (figura 2B). En ambas de estas técnicas, uno de los socios de la Unión fue inmovilizado en un biosensor (para BLI) o en una microplaca (ELISA). La ventaja del BLI y ELISA es que permiten análisis de las interacciones proteína-proteína en su estado natal, prevención de interacciones no específicas fuera del sitio activo de la Unión. La utilidad de BLI, sin embargo, puede ser limitada dependiendo de la técnica de inmovilización utilizada. La amina acoplamiento procedimiento utilizado al azar aquí forma un enlace amida entre cualquier grupo de Amina superficie expuesta de la proteína y la superficie del biosensor. Esto produce inmovilización de moléculas de proteína en la superficie del sensor en varias orientaciones. Esto puede resultar en la Unión heterogénea que no se ajusta a un modelo de cinética de Unión 1:1. Este problema puede resolverse seleccionando sensores de biotina y agregar una etiqueta de estreptavidina en la proteína recombinante para ser inmovilizado. La confiabilidad de BLI es similar a la de resonancia de plasmón superficial (SPR). La asociación y disociación de las moléculas se pueden medir en tiempo real usando cualquier técnica. Sin embargo, el dispositivo BLI no utiliza microfluídica y por lo tanto es fácil de mantener. Además, 96 interacciones pueden analizarse simultáneamente en BLI, mientras que sólo cuatro muestras a la vez pueden ser probadas usando SPR. Hay otro paso crítico en BLI que debe optimizarse. Si se reutilizan los sensores, las condiciones de regeneración deben también optimizar, ya pueden variar para cada complejo de proteínas. En este estudio, ácido etilendiaminotetracético de 10 mM se encontró conveniente para la regeneración del sensor.
El papel de Vn en la adhesión bacteriana fue probado directamente con superficies de vidrio cubiertas con Vn. Este enfoque puede ser empleado para analizar vinculante para cualquier patógeno bacteriano, incluyendo las bacterias tanto Gram-negativas y - positivo. Esta es una técnica semicuantitativa que proporciona una evaluación rápida de la capacidad de un patógeno para el atascamiento a Vn. Para obtener resultados razonables, Vn capa debe ser optimizada. En el análisis aquí descrito, capa con Vn a 1, 2 y 5 μg/mL fue examinada, y 2 μg/mL se encontró que la concentración más conveniente para los experimentos llevados a cabo en este estudio (figura 3A). Exceso Vn revestida en la superficie puede crear una capa gruesa que podría ser fácilmente quitó durante la muestra, fijación y tinción. Por otra parte, la cultura bacteriana no debe tener grumos grandes de células; Esto puede ser evitado con un vórtex la cultura antes de añadir una alícuota a las diapositivas.
Adherencia bacteriana a la superficie de las células epiteliales fue examinada usando una técnica de recuento de mesófilos (figura 3A). Este análisis también deben ser cuidadosamente optimizado para permitir la observación del papel de Vn en la adhesión bacteriana. Vn tiene sitios de Unión diferentes para las bacterias (en el C-terminal) y receptores de integrinas de superficie (en el sitio de Unión RGD N-terminal) de la célula. Unión de Vn a integrinas induce señalización y absorción de los complejos integrina-Vn1. Si estos complejos se internalizan sin bacterias, los resultados serán difíciles de interpretar. Por lo tanto, Vn debe agregarse a la monocapa de células epiteliales a 4 ° C. Una vez que Vn ha saturado los receptores de integrina en la superficie de la célula epitelial, Vn exceso debe lavarse, como Vn libre puede bloquear la Unión de integrinas Vn-dependiente bacteriana. En este ensayo, hemos estimado total bacteriana cuenta asociado con las células epiteliales (es decir, la lectura comprendida tanto conectado a superficie e internalizado las bacterias). Este análisis pueden ampliarse para distinguir entre poblaciones bacterianas intracelulares y externas por el tratamiento con gentamicina4.
El ensayo bactericida de suero utilizado en el protocolo descrito aquí fue modificado parcialmente del procedimiento previamente publicados12,22. En el ensayo descrito aquí, 1.5 x 10que 3 UFC de Hif se incubaron con NHS 5% durante 15 min, 5 min más en el ensayo anteriormente descrito (figura 4A). La diferencia entre peso Hif y el mutante isogénicas desprovista de PH fue más evidente a los 15 min que en 10 minutos. Por lo tanto, seleccionamos el periodo de incubación de 15 minutos para este experimento particular. Los efectos bactericidos del suero dependen de la concentración sérica, tiempo de incubación y el número de bacterias. Todos los patógenos presentan una notable capacidad para evitar la actividad bactericida del suero; algunos patógenos pueden ser completamente resistentes al suero, mientras que otros pueden ser moderadamente sensible o resistente. La concentración del suero por lo tanto debe ser optimizada para cada patógeno específico examinado. Sin embargo, el suero matando ensayo descrito aquí es limitado al estudio de las bacterias Gram-negativas, ya que el suero no tiene ningún efecto bactericida significativo en las células Gram positivas1,5.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses financieros.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Anna y Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. y Edla Johansson Foundation, el Consejo de investigación médica sueco (concesión número K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), la Fundación de cáncer en la Universidad Hospital de Malmö, la sociedad fisiográfica (Fundación de Forssman) y del Consejo de Condado de Skåne investigación y Fundación para el desarrollo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
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