Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

مقاربة سطحية وكفاءة لإنتاج المذيلات عكسية ثاني كبريتيد عبر ربط

Published: December 23, 2016 doi: 10.3791/54722
Automatic Translation
1,2, 1, 3
1Department of Biochemistry & Molecular Medicine, University of California, Davis, 2UC Davis Comprehensive Cancer Center, University of California, Davis, 3Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of California, Davis

Abstract

النانوي هو شكل من اشكال الناشئة من العلاج الذي يسخر خصائص فريدة من نوعها من الجزيئات التي تكون نانومتر في نطاق لتطبيق الطب الحيوي. تحسين تسليم المخدرات لتحقيق أقصى قدر من النتائج العلاجية وللحد من الآثار الجانبية المرتبطة بالمخدرات هي بعض من الأركان الأساسية للالنانوي الوقت الحاضر. وقد وجدت النانوية على وجه الخصوص تطبيق نطاق واسع في علاج السرطان. ومن المتوقع أن تكون أكثر فعالية مع الترجمة السريعة في الممارسة السريرية النانوية التي توفر درجة عالية من المرونة في التصميم، والتطبيق، والإنتاج على أساس المكروية الورم. والبوليمر micellar نانو الناقل هو خيار شعبي للتطبيقات تسليم المخدرات.

في هذه المقالة، نحن تصف بروتوكول بسيطة وفعالة لتوليف، المذيلات عبر ربط ثاني كبريتيد محملة المخدرات على أساس التجميع الذاتي من البوليمرات واضحة المعالم محبة للجهتين الخطية شجيري (telodendrimer، TD). يتكون TD من جي البولي ايثيلينycol (PEG) باعتبارها جزء ماء ومجموعة حمض الكوليك thiolated باسم مسعور شاردة تدريجي المرفقة تشكيل نواة لPEG منتهية أمين باستخدام الحل القائم على الكيمياء الببتيد. أدوية العلاج الكيميائي، مثل باكليتاكسيل (PTX)، يمكن تحميل باستخدام طريقة تبخر المذيبات القياسية. وقد استخدمت أكسدة بوساطة O 2 سابقا لتشكيل داخل micellar ثاني كبريتيد عبر وصلات من جماعات ثيول الحرة على المواد الصلبة الذائبة. ومع ذلك، كان رد فعل بطيئة وغير مجدية للإنتاج على نطاق واسع. مؤخرا، تم استكشاف طريقة أكسدة H 2 O 2 بوساطة كنهج أكثر جدوى وكفاءة، وكان 96 مرات أسرع من الطريقة ذكرت سابقا. باستخدام هذا النهج، وقد تم إنتاج 50 غرام من تحميل PTX، النانوية عبر ربط ثاني كبريتيد بنجاح مع توزيع حجم الجسيمات ضيقة وعالية الكفاءة المخدرات التحميل. وحلل استقرار الحل مذيلة الناتجة باستخدام الظروف تعطيل مثل زملاء الحضانة ثإيث كبريتات دوديسيل المنظفات، والصوديوم، مع أو بدون عامل مختزل. أظهرت، ثاني كبريتيد المذيلات عبر ربط محملة المخدرات قلة النشاط الانحلالي بالمقارنة مع نظرائهم غير عبر ربط.

Introduction

تكنولوجيا النانو هو حقل الناشئة سريعة استفاد عدد من المجالات الحيوية الطبية 1. توفر النانوية الفرص لتصميم وضبط الخصائص التي هي غير مجدية مع أنواع أخرى من العلاجات التقليدية. حاملات نانو تعزيز الاستقرار الأدوية المضادة للتحلل، وإطالة المخدرات وقت التداول، التغلب على القضايا الذوبان المخدرات، ويمكن أن يكون على ما يرام ضبطها لتسليم المخدرات المستهدفة ومقابل تقديم المشارك وكلاء التصوير 1،2. نظم تسليم القائمة على جسيمات متناهية الصغر يبشر في التصوير السرطان وعلاجه. vasculatures الورم هي تتسرب إلى الجزيئات ويمكن أن يؤدي إلى تراكم تفضيلي لتعميم النانوية في مواقع الورم عن طريق نفاذية تعزيز والاستبقاء (EPR) تأثير 3. ومن بين عدة حاملات نانو (على سبيل المثال، الجسيمات الشحمية، الهلاميات المائية، والمذيلات البوليمر) التي يجري العمل بنشاط كحاملات للأدوية المضادة للسرطان، اكتسبت المذيلات البوليمرية شعبية واسعة على مدى عشرالبريد العقد الماضي 4،5.

المذيلات البوليمرية هي نظام الحرارية التي، على الحقن الوريدي، يمكن أن يحتمل أن تضعف تحت تركيز مذيلة الحرج (CMC)، مما يؤدي إلى التفكك بهم إلى unimers. وقد استخدمت استراتيجيات عبر ربط للحد من التفكك micellar إلى unimers. ومع ذلك، المذيلات استقرت بشكل مفرط قد تمنع المخدرات من الإفراج في المواقع المستهدفة، مما يقلل من الكفاءة العلاجية الشاملة. تم استكشاف العديد من الطرق الكيميائية لجعل عبر ربط تحلل ردا على الأكسدة أو للمؤثرات الخارجية، مثل السندات ثاني كبريتيد اختزال 6،7 ودرجة الحموضة شطورة 8 أو استر hydrolysable السندات 9،10.

لقد ذكرت سابقا تصميم وتركيب الجسيمات النانوية micellar تتكون من حمض الكوليك شجيري (CA) كتل وجلايكول خطي البولي ايثيلين (PEG) بوليمرات، ويشار إلى telodendrimers (TD) 11-15 NK -CAy (حيث n = الوزن الجزيئي في kilodaltons (K)، ص = عدد من حامض الكوليك (CA) وحدة). فهي تتميز بصغر حجمها، صلاحية طويلة، وكفاءة عالية في المخدرات التغليف مثل باكليتاكسيل (PTX) ودوكسوروبيسين (DOX) في قلب مسعور. لبنات بناء TD، مثل PEG، ليسين، وكاليفورنيا، وحيويا، وجود الهالة PEG يمكن أن تضفي "الشبح" الطابع جسيمات متناهية الصغر، ومنع امتصاص غير محدد من الجسيمات النانوية micellar من قبل أنظمة شبكية بطانية.

يمكن بسهولة Thiolated البوليمرات الخطية شجيري أن تتولد عن طريق إدخال cysteines في العمود الفقري، بنسبة ضئيلة يسين شجيري من المواد الصلبة الذائبة لدينا معيار. تقدم هذه المقالة بروتوكول سطحي لإنتاج micellar نظام تسليم المخدرات عبر ربط عكسية عن طريق إدخال ثاني كبريتيد الروابط عبر في صلب مسعور من المواد الصلبة الذائبة (الشكل 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

الأخلاق البيان: أنثى athymic الفئران عارية (نيو / نو سلالة)، 6-8 أسابيع من العمر، تم شراؤها ثم يوضع في ظروف خالية من مسببات الأمراض وفقا للمبادئ التوجيهية AAALAC وسمح للتأقلم لمدة 4 أيام على الأقل قبل أي تجارب. وقد أجريت التجارب على الحيوانات فقط في الامتثال للمبادئ التوجيهية المؤسسية وفقا للبروتوكول رقم 07-13119، ورقم 09-15584، التي وافقت عليها استخدام الحيوان واللجنة الاستشارية الإدارية العناية في جامعة كاليفورنيا، ديفيس.

1. توليف TD PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8

  1. في قارورة جولة القاع، ويحل ميو-PEG 5K -NH 2 (2 غرام، 0.4 ملمول) في 10-20 مل من ثنائي ميثيل الفورماميد اللامائية (DMF) والبرد على الجليد.
  2. في كوب زجاجي، ويحل 3 يعادل. 1-هيدروكسي-6-كلورو-benzotriazole (HOBt)، 3 يعادل. من N، N '-diisopropylcarbodiimide (DIC)، و 3 يعادل. من (FMOC) 2 ليز-OH في اللامائية DMF (10-15 مل). يحرك المزيج لمدة 15-20 دقيقة على لوحة تحريك مغناطيسي.
  3. إضافة الخليط إلى قارورة التفاعل التي تحتوي على ميو-PEG 5K -NH 2. إزالة حمام الثلج ويحرك خليط التفاعل بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
  4. تأكيد الانتهاء من رد فعل مع طبقة رقيقة اللوني (TLC) 16 واختبار القيصر 17 (اللون الأصفر يدل على غياب حرية NH 2). ترسيب المنتجات البوليمرية 1 (ميو-PEG 5K -Lys (NH-FMOC) 2) عن طريق إضافة حوالي 200 مل من الأثير الجليد الباردة إلى دورق التفاعل. فصل البوليمر عجلت عن طريق الطرد المركزي (6 دقائق في 6000 x ج و 4 درجات مئوية).
    1. لأداء TLC، بقعة عينات على لوحات TLC المغلفة هلام السيليكا. استخدام ثنائي كلورو ميثان / الميثانول (9: 1)، والطور المتحرك. مراقبة البقع تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية بعد وضع لوحات TLC. يمكن للمرء أيضا استخدام النينهيدرين تلطيخ كاشف لتصور البقع أمين على طبق ساخن.
    2. لكاياختبار سر، ووضع قليلا من العينة في أنبوب زجاجي يحتوي على كاشف القيصر. تسخينها في 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم ابحث عن تغيير اللون (إذا كان لون من الحل لا يزال الأصفر، ثم رد فعل غير كاملة).
  5. إعادة إذابة المنتج في اللامائية DMF (10-20 مل)، وتكرار هطول الأمطار والطرد المركزي (راجع الخطوة 1.4).
  6. كرر الخطوة 1.5، ثم يغسل الراسب البوليمر ثلاث مرات مع الأثير الجليد الباردة.
  7. نقل البوليمر راسب 1 إلى قارورة رد فعل نظيفة وربط قارورة مصدر فراغ عالية لإزالة الأثير المتبقية.
  8. إعداد وإضافة ما يقرب من 20-30 مل من 20٪ (ت / ت) 4-methylpiperidine في DMF إلى البوليمر وسيطة 1. يحرك حتى حل كامل. تشغيل رد فعل لمدة 3 ساعة.
  9. أداء TLC 16 و اختبار كايزر (اللون الأزرق يؤكد وجود حرية NH 2) 17 (انظر الخطوة 1.4) لتأكيد completioن من رد الفعل. إذا كان رد الفعل هو الكامل، انتقل إلى هطول الأثير، كما ذكر للمنتج 1 (الخطوات 1،4-1،6).
  10. تجفيف المنتجات البوليمرية 2 (ميو-PEG 5K -Lys (NH 2) 2) في ظل فراغ.
  11. تنفيذ جولة واحدة أكثر من (FMOC) 2 ليز-OH-اقتران على وسيط 2 (الخطوات 1،1-1،7) لتوليد المنتج 3 (ميو-PEG 5K -Lys (ليز (NH-FMOC) 2) 2). دي حماية (الخطوات 1،8 حتي 1،10) المجموعات FMOC (4، ميو-PEG 5K -Lys (ليز (NH 2) 2) 2) وزوج (الخطوات 1،1-1،7) في (FMOC) اليس (بوك) -OH ل توليد متعدد الليزين شجيري من الجيل الثالث (5، ميو-PEG 5K -Lys-ليز 2 - ((FMOC) اليس (بوك)) 4) إنهاء أربعة بوك وFMOC المجموعات على نهاية واحدة من سلسلة PEG.
  12. نقل البوليمر الناتج المتوسط من 5 إلى قارورة التفاعل. في مثلeparate رد فعل قارورة، وإعداد 1: 1 (ت / ت) وحامض trifluoroacetic (TFA) في ثنائي كلورو ميثان (DCM). إضافة 15-20 مل من 1: مزيج 1 TFA / DCM (ت / ت) للبوليمر المتوسط 5. يحرك الخليط حتى يذوب البوليمر تماما. يقلب لمدة 3 ساعات إضافية.
  13. أداء TLC 16 و اختبار كايزر (اللون الأزرق يؤكد وجود حرية NH 2) 17 (انظر الخطوة 1.4) لتأكيد إتمام التفاعل. إذا كان رد الفعل هو الكامل، تتبخر الخليط البوليمر في وTFA / DCM مع الهواء حتى يتم الحصول على حل لزجة. انتقل إلى هطول الأثير، كما ذكر للمنتج 1 (الخطوات 1،4-1،6). تجفيف المنتجات البوليمرية 6 (ميو-PEG 5K -Lys-ليز 2 - ((FMOC) اليس (NH 2)) 4) في ظل فراغ.
  14. نقل البوليمر وسيطة 6 في قارورة التفاعل. استخدام حوالي 40 مل من DMF اللامائية تحتوي على 8 يعادل. من N، N -diisopropylethylamiشمال شرق (DIEA) حل البوليمر وسيطة 6. في كوب زجاجي، ويحل 12 يعادل. من HOBt، 12 يعادل. من مدينة دبي للإنترنت، و 12 يعادل. من (FMOC) السيستئين (TRT) -OH في 20-25 مل من اللامائية DMF. يهز لمدة 10-15 دقيقة، ثم يضاف خليط رد فعل على القارورة التي تحتوي على رد فعل 6. تشغيل رد الفعل بين عشية وضحاها.
  15. تأكيد الانتهاء من رد فعل مع TLC 16 و اختبار كايزر (راجع الخطوة 1.4، واللون الأصفر يدل على غياب حرية NH 2) 17. إذا كان رد الفعل هو الكامل، انتقل إلى هطول الأثير، كما ذكر للمنتج 1 (الخطوة 1،4-1،6)، لعزل المنتج 7 (ميو-PEG 5K -Lys-ليز 2 - ((FMOC) اليس - ((FMOC) السيستئين (TRT))) 4.
  16. أداء FMOC دي الحماية على 7، كما هو موضح في الخطوة 1.8، للحصول على المنتج 8 (PEG 5K -Lys-ليز 2 - (ليز (NH 2) - (السيستئين (NH 2) (TRT))) 4). زوجان (FMOC) -PEG 2 -Suc-OH ( "Ebes" رابط، 24 يعادل.) على اقتران البوليمر وسيطة باستخدام الإجراء المذكورة أعلاه لHOBt / مدينة دبي للإنترنت بوساطة للحصول على وسيط 9 (ميو-PEG 5K -Lys-ليز 2 -Lys 4 - (السيستئين (TRT) ) 4 (Ebes (NH-FMOC)) 8).
  17. أداء جولة واحدة أكثر من FMOC دي الحماية (الخطوات 1،6-1،8) للحصول على وسيط 10 (ميو-PEG 5K -Lys-ليز 2 -Lys 4 - (السيستئين (TRT)) 4 (Ebes (NH 2)) 8).
  18. نقل البوليمر المتوسط 10 في قارورة التفاعل وإضافة اللامائية DMF (حوالي 30-40 مل) لحله. في قارورة رد فعل آخر، ويحل 24 يعادل. من CAOSu (المعد وفقا للإجراءات التي نشرت سابقا) في اللامائية DMF (20-30 مل) 18. إضافة 48 يعادل. من N، N -diisopropylethylamine والسماح لها يحرك المزيج لمدة 10-15 دقيقة. نقل المحتويات في قارورة التفاعل التي تحتوي على 10 والسماح للرد فعل المدى سvernight.
  19. تأكيد الانتهاء من رد فعل مع TLC 16 و اختبار كايزر (راجع الخطوة 1.4، واللون الأصفر يدل على غياب حرية NH 2) 17. إذا كان رد الفعل هو الكامل، انتقل إلى هطول الأثير، كما ذكر للمنتج 1 (الخطوات 1،4-1،6) لعزل المنتج 11 (ميو-PEG 5K -Lys-ليز 2 -Lys 4 - (السيستئين (TRT)) 4 -Ebes 8 -CA 8). Dialyze في الماء غير المتأينة ويجفد العينة أن تسفر عن مسحوق أبيض.
  20. وضع البوليمر المتوسط 11 في قارورة التفاعل. إعداد وإضافة 20 مل من TFA / 1،2-ethanedithiol (بتوقيت شرق الولايات المتحدة) / triethylsilane (TIS) / H 2 O (94 / 2.5 / 1 / 2.5، ت / ت) الخليط في حل البوليمر. يحرك الخليط حتى حل كامل. تشغيل رد فعل لمدة 4 ساعة. تأكيد الانتهاء من رد فعل من قبل TLC 16.
  21. تحت غطاء الدخان، ضربة جوية الى البوليمر TFA / بتوقيت شرق الولايات المتحدة / TIS / ح 2يا الخليط حتى يصبح لزج الحل. انتقل إلى هطول الأثير، كما ذكر للمنتج 1 (الخطوات 1،4-1،6)، لعزل المنتج النهائي، 12 (PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8). حله في الأسيتونتريل ويجفد أن تسفر عن مسحوق أبيض.

2. إعداد المذيلات تحميل PTX-

  1. إعداد تحميل PTX-PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 مذيلة باستخدام طريقة التبخر القياسية.
    1. حل 20 ملغ من TD مع كمية مختلفة من PTX (1-9 ملغ) في 1 مل من الكلوروفورم (CHCl 3). إزالة المذيب باستخدام المبخر الدوار للحصول على متجانسة، جافة فيلم البوليمر. إعادة الفيلم مع 1 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) من خلال دوامة، تليها صوتنة لمدة 30 دقيقة في 40 كيلو هرتز، إذا لزم الأمر، للسماح للتشكيل المذيلات محملة المخدرات.
    2. إضافة 6 ميكرولتر من 3٪ (ث / ث) H 2 O 2 (1 يعادل. لالابه ه المجموعات ثيول) لأكسدة المجموعات ثيول على TD. استخدام الحل مذيلة لمزيد من توصيف مرة واحدة على مستوى مجموعات ثيول حرة لا يزال في انخفاض قيم ثابتة، كما يتضح من اختبار المان والبالغ عددهم 19.
    3. تصفية حل مع فلتر 0.22 ميكرون لتعقيم العينة. تحليل كمية من المخدرات التي تم تحميلها في المذيلات على 20 نظام HPLC بعد الإفراج عن المخدرات من المذيلات بإضافة 9 مرات الأسيتونتريل وأداء 10 دقيقة من صوتنة. استخدام عمود C18 لHPLC مع الأسيتونتريل / المياه باعتبارها مرحلة الجوالة.
    4. حساب جاري المخدرات وفقا لمنحنى المعايرة بين القيم منطقة HPLC وتركيزات الدواء القياسية 11.
      ملاحظة: يتم تعريف الكفاءة تحميل كنسبة من المخدرات تحميلها في المذيلات إلى المحتوى المخدرات الأولي.

3.، توصيف المذيلات

  1. قياس حجم وحجم توزيع مicelles مع أداة ديناميكية تشتت الضوء (DLS) 29. إجراء القياسات في درجة حرارة الغرفة والحفاظ على تركيز مذيلة في 1 ملغ / مل.
    ملاحظة: لإجراء تحليل حجم الجسيمات، استخدم برنامج تلفزيوني أنه فارغ، ثم تسجيل حجم الجسيمات لعينات الفعلية. أخذ قراءات في ثلاث نسخ للعينات، ومن ثم متوسط ​​القراءات.
  2. استخدام أطياف مضان لقياس تركيز micellar الحرجة (CMC) من PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 قبل وبعد عبر ربط مع بيرين باعتباره التحقيق الفلورسنت مسعور، كما هو موضح سابقا 13،21.
    ملاحظة: عادة، ويتراوح تركيز مذيلة من 5 × 10 -7 إلى 5 × 10 -4 م.

4. استقرار المذيلات في SDS مع أو بدون وكلاء الحد

  1. إعداد الحلول الأسهم من كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) حل (7.5 ملغ / مل)، وثاني كبريتيد المذيلات عبر ربط (1.5 ملغ / مل) في برنامج تلفزيوني. بعد ذلك، شالغناء الحلول الأسهم، وجعل مزيج الحل يكون فيها تركيز SDS النهائي هو في 2.5 ملغ / مل وتركيز مذيلة هو عند 1.0 ملغ / مل.
  2. قياس حجم وحجم التوزيع (كما ذكر في الخطوة 3.1) من حلول مذيلة في فترات زمنية محددة سلفا مع أو من دون وجود 10 ملي الجلوتاثيون (GSH).

5. انحلال الدم الفحص

  1. تقييم إمكانية انحلال الدم من المذيلات PTX محملة، غير عبر ربط (PTX-NCMs) التي أعدت وفقا للإجراءات التي نشرت سابقا 11 وتحميل PTX-المذيلات عبر ربط (PTX-البريطانية قد) باستخدام الدم سيتراتية جديدة من الفئران عارية التي تم جمعها من ذيل الحجاب.
    1. جمع خلايا الدم الحمراء عن طريق الطرد المركزي لعينة الدم (1.0 مل) في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة، ويغسل لهم ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، ثم اعادة تعليق الكريات الخلايا مع برنامج تلفزيوني لتركيز النهائي من 2٪.
  2. مزيج 200 ميكرولتر من تعليق كرات الدم الحمراء مع تركيزات مختلفة (0.2 و 1.0ملغ / مل) من PTX-NCMs وPTX-البريطانية قد، على التوالي، واحتضان لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية في شاكر حاضنة.
  3. أجهزة الطرد المركزي الخلطات مذيلة-كرات الدم الحمراء في 3000 x ج لمدة 5 دقائق. نقل 100 ميكرولتر من طاف من جميع العينات إلى لوحة 96-جيدا. قياس امتصاص الهيموغلوبين الحر في طاف في 540 نانومتر باستخدام قارئ لوحة صغيرة.
    ملاحظة: كرات الدم الحمراء حضنت مع تريتون-100 (2٪) وبرنامج تلفزيوني هي لاستخدامها الضوابط الإيجابية والسلبية، على التوالي. ويتم احتساب انحلال الدم في المئة من عدد كرات الدم الحمراء مع الصيغة التالية: RBC انحلال الدم = (OD عينة - OD المراقبة السلبية) / (مراقبة OD إيجابية - السيطرة السلبية OD) × 100٪.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إعداد وتوصيف، المذيلات ثاني كبريتيد عبر ربط محملة بالمخدرات

محبة للجهتين البوليمر PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 هو بوليمر شجيري قادرة على تشكيل نظام micellar عبر ربط ثاني كبريتيد للتسليم سرطان المخدرات. هيكليا، ويعرف بأنه قليل وحدات شجيري من الأحماض الكوليك (المجال مسعور) مرتبطة واحدة من نهاية جزيء خطي PEG (المجال ماء، الوزن الجزيئي 5K) من خلال بولي متفرعة (يسين السيستين-Ebes) العمود الفقري. وهناك العديد من المزايا لاستخدام هذه بوليمرات كتلة على الأنظمة micellar أخرى عنها. لأول مرة، ويمكن تصنيعه بسهولة عبر تفاعل تكثيف مرحلة الحل التدريجي. ثانيا، بالمقارنة مع العديد من البوليمرات الأخرى ذكرت محبة للجهتين النظام البوليمر thiolated، أعدت خلال مرحلة الحل راسخة تدريجي الكيمياء الببتيد FMOC، لديها structu واضحة المعالمإعادة. ويمكن تخزينها في شكل مسحوق مجفف بالتجميد وتبلغ مدة الصلاحية طويلة.

ويمكن استخدام العديد من التقنيات لتوصيف المنتج النهائي. كمية حمض الكوليك تعلق TD يمكن الكشف عن بمقارنة نسبة إشارة من البروتونات على PEG لتلك التي على مجموعات الميثيل ثلاثة من حمض الكوليك في أطياف 1 H NMR. ويمكن التأكد من الأوزان الجزيئية للTD بواسطة MALDI-TOF الشامل اللوني الطيفي وتغلغل الجل (المؤتمر الشعبي العام). الاختبار الكمي المان ويمكن أن تستخدم لفك عدد من بقايا السيستين الحرة الموجودة في الجزيء.

PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 يمكن تجميع الذاتي لتشكيل المذيلات في الأوساط المائية. باستخدام طريقة تبخر المذيبات القياسية، ومجموعة متنوعة من العقاقير مسعور، مثل PTX والفينكريستين، وقد مغلفة بنجاح في المذيلات 13،22. Oxygوقد استخدمت أون سابقا لأكسدة المجموعات ثيول خالية من PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 وتشكيل داخل micellar ثاني كبريتيد عبر الروابط. كما رصدتها اختبار المان، وبلغ معدل التحويل من جماعات ثيول حرة في ثاني كبريتيد السندات 85٪ بعد 48 ساعة من الأكسدة. ه كان يعمل 2 O 2 بوساطة أكسدة مؤخرا كطريقة بديلة. بلغ معدل التحويل 88٪ في 30 دقيقة (الشكل 2)، والذي كان 96 مرات أسرع من الطريقة السابقة. خمسين غراما من PTX تحميلها، وقد تم إنتاج ثاني كبريتيد النانوية عبر ربط بنجاح باستخدام هذا النهج أكثر كفاءة (الشكل 3). وكان حجم الجسيمات حوالي 27 نانومتر، مع توزيع حجم الضيق (الشكل 3). اقتربت كفاءة التحميل المخدرات 100٪ مع PTX تحميل 4.0 ملغ / مل. وكان ثاني كبريتيد عبر ربط لها تأثير كبير على قيمة CMC. مقارنة مع معيار TD PEG 5K -CA 8 التي تفتقرالسندات ثاني كبريتيد، أظهر TD عبر ربط انخفاضا بنسبة 10 أضعاف في القيم CMC احظ (5.53 ميكرومتر مقابل 0.67 ميكرومتر) 13.

الدراسات الاستقرار

ونحن التحقيق كذلك استقرار تحميل PTX، المذيلات عبر ربط ثاني كبريتيد ضد ظروف قاسية للاختلال مذيلة. كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) هي المنظفات الأيونية القوي الذي يستخدم عادة لتقييم الاستقرار micellar، لأنها يمكن أن كسر بكفاءة أسفل المذيلات البوليمرية. تم رصد استقرار، المذيلات محملة المخدرات ثاني كبريتيد عبر ربط (1.0 ملغ / مل) من قبل دائرة الأراضي والمساحة في وجود SDS-تعطيل مذيلة (2.5 ملغ / مل). بقي حجم الجسيمات من المذيلات مطرد مع مرور الوقت، مشيرا إلى أن مثل هذه المذيلات عبر ربط بقيت على حالها (الشكل 4، لوحات اليسرى). ومن المتوقع أن يلتصق السندات كبريتيد في قلب مسعور الظروف الاختزالية، ذرإيبي جعل المذيلات عرضة لزعزعة الاستقرار. الجلوتاثيون (GSH)، والحد من وكيل الذاتية، وغالبا ما تستخدم لمثل هذه الدراسات. هناك تناقض صارخ في مستوى الخلايا من GSH مقارنة بالمستوى خارج الخلية (10 ملم مقابل 2 ميكرون). وكثيرا ما يستخدم هذا الاختلاف في تركيز لتوليد أنظمة المحفزات متجاوبة. بعد إضافة GSH في تركيز الخلايا (10 ملم) 23، ظل حجم، المذيلات عبر ربط ثاني كبريتيد محملة المخدرات سليمة لمدة 30 دقيقة. أنها انخفضت بشكل مفاجئ إلى 1 نانومتر، مما يدل على الحد من عدد حاسما من السندات ثاني كبريتيد، وهو شرط أساسي من التفكك السريع للالمذيلات (الشكل 4، اللوحة اليمنى). على العكس من ذلك، ظل نظام مستقر في وجود تركيزات الخلية من الجلوتاثيون (لا تظهر البيانات).

دراسة انحلال الدم

الشكل5 يبين الاختلافات في النشاط الانحلالي لوحظ من المذيلات تحميل PTX، مع أو بدون ثاني كبريتيد عبر ربط. ويجب تجنب انحلال الدم من خلايا الدم عند إدارة هذه الجزيئات في مجرى الدم، كما أنها تقوض مزاياها العلاجية. أمراض الدم و التوافق هو أمر بالغ الأهمية للتطبيق في الجسم الحي من شركات الدواء على أساس البوليمر، مثل المواد الصلبة الذائبة محبة للجهتين التي لديها القدرة على إذابة الدهون أو إدراج نفسها في الأغشية فوسفورية، مما أدى إلى تمزق الأغشية البلازما. كما هو مبين في الشكل (5)، تم العثور على PTX-NCMs لديها خلايا الدم الحمراء التي تعتمد على الجرعة (ربك) العد تحلل، مع نسبة انحلال الدم زيادة من 8.1٪ إلى 14.2٪ كما تركز PTX-NCMs ارتفعت من 0.2 ملغ / مل إلى 1.0 ملغ / مل. ومع ذلك، أظهرت PTX-البريطانية قد التي لديها ثاني كبريتيد عبر ربط لا يمكن ملاحظتها الانشطه الحالة للدم (<1.0٪) في عدد كرات الدم الحمراء في ظل الظروف التجريبية نفسها. هذا الاختلاف في hemolysوالاتجاه يمكن أن يعزى إلى جسور ثاني كبريتيد داخل micellar الحالية في صميم مسعور، التي تمنع PTX-البريطانية قد من عدم الربط لتشكيل تدس محبة للجهتين.

شكل 1
الشكل 1: خطوات لتشكيل المذيلات عبر ربط. التمثيل التخطيطي للثاني كبريتيد المذيلات عبر ربط شكلتها أكسدة من thiolated telodendrimer PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 بعد التجميع الذاتي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: طرق الأكسدة لتشكيل عبر ربط مذيلة. معدل التحويل رانه ثيول المجموعات على المواد الصلبة الذائبة إلى ثاني كبريتيد السندات بوصفها وظيفة من الزمن الأكسدة لأساليب الأكسدة اثنين. أبقى التركيز الكلي للالمذيلات في 20 ملغ / مل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): محملة المخدرات، عبر ربط مذيلة. لوحة اليسار: صورة لمجموعة من تحميل PTX، المذيلات عبر ربط ثاني كبريتيد. شريط الحجم: 1 بوصة. اللوحة اليمنى: حجم الجسيمات، على النحو الذي يحدده تشتت الضوء الحيوي (DLS). أبقى التركيز الكلي من المذيلات في 20 ملغ / مل. كان تحميل PTX 4 ملغ / مل. وقد أظهرت بيانات حجم الجسيمات حيث بلغ متوسط ​​حجم الجسيمات ± SD على أساس ثلاثة قياسات. SD: الانحراف المعياري، ويصف عرض توزيع قياس حجم الجسيمات.الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: دراسة الاستقرار. حجم الجسيمات من تحميل PTX، المذيلات عبر ربط ثاني كبريتيد في ظل وجود 2.5 ملغ / مل SDS دون (يسار) أو مع (يمين) GSH (10 ملم)، كما تقاس DLS. وقد أظهرت بيانات حجم الجسيمات حيث بلغ متوسط ​​حجم الجسيمات ± SD على أساس ثلاثة قياسات. SD: الانحراف المعياري، ويصف عرض توزيع قياس حجم الجسيمات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: انحلال الدم فحص. في المختبر الأنشطة الانحلالي من تحميل PTX، المذيلات عبر ربط ثاني كبريتيد بالمقارنة مع المذيلات غير crosslinked على خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء). استخدمت تريتون-100 (2٪) وبرنامج تلفزيوني باسم الضوابط الإيجابية والسلبية، على التوالي. والقيم المبلغ عنها هي يعني ± SD العينات ثلاث نسخ. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد تم التحقيق في عدة النانوية لاحتمال استخدامها في توصيل الدواء. -loaded دوكسوروبيسين Liposomal وباكليتاكسيل (PTX) الإنسان ألبومين المصل نانو المجاميع هي من بين nanotherapeutics التي وافقت عليها ادارة الاغذية والعقاقير لعلاج السرطان. ومع ذلك، على الرغم من فعالية سريريا، كل من هذه nanotherapeutics هي "كبير" نسبيا في الحجم، وأنها تميل إلى تتراكم في الكبد والرئتين. المذيلات البوليمرية مع أحجام الجسيمات الصغيرة نسبيا وارتفاع قدرات تحميل المخدرات وnanocarriers لتسليم المخدرات في الظهور. فريدة من نوعها بنية الأساسية شل '' إذابة '' على جزيئات الدواء مسعور في ظل ظروف المائية التي كتبها التغليف البدني. المذيلات البوليمرية يتألف من المواد الصلبة الذائبة واضحة المعالم أعد في شكل مختبر النانوية monodispersed لدينا (10-50 نانومتر حجم الجسيمات) مع طويلة العمر الافتراضي وكفاءة عالية في التغليف المخدرات. واحدة من العديد من المزايا من منصة TD قوية وبراعة من البوليمر.يمكن بسهولة العديد من الأدوية والأصباغ الفلورية، وبروابط تستهدف إدراجها في منصة TD 13،15،24.

خطوات حاسمة في إطار بروتوكول

وقد وضعنا، عكسها، ثنائي السلفيد نظام مذيلة عبر ربط قوي للتسليم PTX، الذي يعرف جيدا، مع حجم الجسيمات حوالي 27 نانومتر، ويبلغ حجم التوزيع الضيق. تم تصنيعه من المواد الصلبة الذائبة عبر حل تدريجي الكيمياء المرحلة الببتيد. التركيب الكيميائي محددة جيدا من هذه المواد الصلبة الذائبة هو العامل الرئيسي لتوليد الجسيمات النانوية مع الخصائص المطلوبة. لذلك، مؤكدا الانتهاء من رد فعل مع TLC وكايزر الاختبار هو حرجة للغاية. وH 2 O 2 أكسدة هي أيضا خطوة حاسمة، تتأكسد المجموعات ثيول على TD لتشكيل ثاني كبريتيد الروابط عبر، والذي يعزز إلى حد كبير في استقرار المذيلات. مقارنة مع أسلوبنا السابق الأكسدة القائم على الأكسجين، وH 2 O 2 -طريقة أكسدة أساس 96 مرات أسرع، وبالتالي توفير المذيلات عبر ربط في فترات زمنية أقصر. وعلاوة على ذلك، GSH، وهو ثلاثي الببتيد التي تحتوي على ثيول، هو مضاد للأكسدة الهامة التي تنتجها الخلايا، وأنها تلعب دورا هاما في نظافتها الجذور الحرة ومركبات الأكسجين التفاعلية. يجعل مساهمات كبيرة من خلال الحفاظ على التوازن الأكسدة الخلوية. تركيز الخلوي للGSH هو الجانب المثير من تصميم الأدوية. ثبت الآن تركيز الخلايا من GSH بقوة إلى أن تكون أعلى بكثير من تركيز خارج الخلية (10 ملم مقابل 2 ميكرومتر، على التوالي) 25. الأهم من ذلك، وكثيرا ما ذكرت مستوى الجلوتاثيون داخل الخلايا مرتفعة في العديد من الخلايا السرطانية البشرية والفئران المقاومة للأدوية 26. توزيع الخلايا عالية من GSH يسهل الكسر من ثاني كبريتيد عبر ربط من المذيلات والنتائج في إطلاق سراح وتراكم حمولة المخدرات. النانوية عبر ربط ثاني كبريتيد هيمستقر في وجود SDS. ومع ذلك، فإن البيئة داخل الخلايا-GSH الغنية يؤدي الافراج عن المخدرات عن طريق تحطيم السندات ثاني كبريتيد، وبالتالي زعزعة استقرار النظام. أدى انحلال الدم الناجم عن البوليمر من التفاعل الضار من المذيلات البوليمرية مع مكونات الدم، مثل خلايا الدم الحمراء. وأظهرت المذيلات عبر ربط أقل بكثير انحلال الدم بالمقارنة مع نظائرها غير عبر ربط.

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

استخدام H 2 O 2 وكيلا المؤكسدة يسمح لتشكيل عبر الارتباط ثاني كبريتيد أكثر كفاءة بالمقارنة مع ذكر سابقا، القائم على الأكسجين طريقة 13. H 2 O 2 هو عامل مؤكسد قوي 27 التي هي رخيصة وقابلة للذوبان في الماء بدرجة كبيرة ويعطي منتجات ذات جودة عالية مقارنة مع بعض العوامل المؤكسدة المعروفة الأخرى (على سبيل المثال، كرومات أو برمنجنات). ومع ذلك، قد يحتاج وقت أكسدة أن ابعد من ذلكص الأمثل على أساس حجم التوليف.

القيود المفروضة على تقنية

H 2 O 2 هو مؤكسد قوي. على الرغم من أن يستخدم على تركيز منخفض من H 2 O 2 لتنفيذ ثاني كبريتيد تشكيل عبر الارتباط والرعاية التي يجب اتخاذها عند استخدام مع تدس محملة بالمخدرات "الحساسة للأكسدة" لمنع تدهور المخدرات غير مرغوب فيه.

أهمية تقنية مع الاحترام لالحالية / الطرق البديلة

تقنية الموضحة هي الإعداد التجريبية من السهل أن يمكن تكرارها بسهولة في المختبر القياسية. على سبيل المثال، تحميل الدواء باستخدام طريقة التبخر هو معيار أقل استهلاكا للوقت مقارنة لطريقة غسيل الكلى. تشكيل ثاني كبريتيد في قلب باستخدام H 2 O 2 كما عامل مؤكسد هو 96 مرات أسرع من الطريقة أكسدة ذكرت سابقا باستخدام oxygأون (13). استنساخ الخطوة التحميل المخدرات يمكن تقييمها بسهولة عن طريق قياس حجم الجسيمات (طريقة DLS)، والمحتوى المخدرات (HPLC).

التطبيقات المستقبلية أو الاتجاهات بعد اتقان هذه التقنية

بالمقارنة مع العقاقير جزيء صغير، واحدة من العقبات الرئيسية التي يجب التغلب عليها قبل نانو الدواء يمكن أن يدخل التيار إعدادات رعاية مرضى السرطان هي التحديات التقنية من رفع مستوى إنتاج 28. بعد اتقان هذه التقنية المطورة حديثا، يمكن للمرء بسهولة تجميع ثاني كبريتيد المذيلات cross-linked على نطاق واسع. هذا أمر مرغوب فيه للغاية للدراسات السريرية لهذا نانو صياغة في المرضى من البشر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MeO-PEG5K-NH2 Rapp Polymere 125000-2
Fmoc-Lys(Fmoc)-OH Aaptec AFK107
Fmoc-Lys(Boc)-OH Anaspec AS-20132
Fmoc-Cys(Trt)-OH Aapptec AAC105
Dimethylformamide Fisher Scientific BP1160-4
Ethyl ether Fisher Scientific E134-20
N,N-Diisopropylethylamine Sigma Aldrich D125806
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich T6508 Corrosive, handle with care
4-methyl piperidine Alfa-Aesar L-02709
Ebes linker Anaspec AS-61924
Cholic acid Sigma Aldrich C1129
1,2-Ethanedithiol Sigma Aldrich 02390 Handle inside fume hood. Bleach gloves after usage.
Triisopropylsilane Sigma Aldrich 233781
Chloroform (anhydrous) Sigma Aldrich 288306
Hydrogen peroxide solution 30% Aaron Industries NA
HoBt-Cl Aaptec CXZ096
DIC Sigma Aldrich D125407
Female athymic nude mice (Nu/Nu strain), 6–8 weeks age Harlan (Livermore, CA)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, L., et al. Nanoparticles in medicine: therapeutic applications and developments. Clin. Pharmacol. Ther. 83, 761-769 (2008).
  2. Wang, A. Z., Langer, R., Farokhzad, O. C. Nanoparticle Delivery of Cancer Drugs. Annu. Rev. Med. 63, 185-198 (2012).
  3. Iyer, A. K., Khaled, G., Fang, J., Maeda, H. Exploiting the enhanced permeability and retention effect for tumor targeting. Drug Disc. Today Targets. 11, 812-818 (2006).
  4. Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles. Pharmacol. Rev. 64, 505-519 (2012).
  5. Kamaly, N., Xiao, Z., Valencia, P. M., Radovic-Moreno, A. F., Farokhzad, O. C. Targeted polymeric therapeutic nanoparticles: design, development and clinical translation. Chem. Soc. Rev. 41, 2971-3010 (2012).
  6. Li, Y. L., et al. Reversibly stabilized multifunctional dextran nanoparticles efficiently deliver doxorubicin into the nuclei of cancer cells. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 9914-9918 (2009).
  7. Miyata, K., et al. Block catiomer polyplexes with regulated densities of charge and disulfide cross-linking directed to enhance gene expression. J. Am. Chem. Soc. 126, 2355-2361 (2004).
  8. Chan, Y., Wong, T., Byrne, F., Kavallaris, M., Bulmus, V. Acid-labile core cross-linked micelles for pH-triggered release of antitumor drugs. Biomacromolecules. 9, 1826-1836 (2008).
  9. Rijcken, C. J., Snel, C. J., Schiffelers, R. M., van Nostrum, C. F., Hennink, W. E. Hydrolysable core-crosslinked thermosensitive polymeric micelles: synthesis, characterisation and in vivo studies. Biomaterials. 28, 5581-5593 (2007).
  10. Talelli, M., et al. Core-crosslinked polymeric micelles with controlled release of covalently entrapped doxorubicin. Biomaterials. 31, 7797-7804 (2010).
  11. Xiao, K., et al. A self-assembling nanoparticle for paclitaxel delivery in ovarian cancer. Biomaterials. 30, 6006-6016 (2009).
  12. Li, Y., et al. A novel size-tunable nanocarrier system for targeted anticancer drug delivery. J. Control. Release. 144, 314-323 (2010).
  13. Li, Y., et al. Well-defined, reversible disulfide cross-linked micelles for on-demand paclitaxel delivery. Biomaterials. 32, 6633-6645 (2011).
  14. Li, Y., et al. Well-defined, reversible boronate crosslinked nanocarriers for targeted drug delivery in response to acidic pH values and cis-diols. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51, 2864-2869 (2012).
  15. Li, Y., et al. A smart and versatile theranostic nanomedicine platform based on nanoporphyrin. Nat. Commun. 5, (2014).
  16. Belenki, B. G., Gankina, E. S. Thin-Layer chromatography of polymers. J. Chromatogr. A. 141, 13-90 (1977).
  17. Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).
  18. Pandey, P. S., Rai, R., Singh, R. B. Synthesis of cholic acid-based molecular receptors: head-to-head cholaphanes. J. Chem. Soc., Perkin Trans 1. , 918-923 (2002).
  19. Riddles, P. W., Blakeley, R. L., Zerner, B. Reassessment of Ellman's reagent. Methods Enzymol. 91, 49-60 (1983).
  20. Ahuja, S., Rasmussen, H. Overview of HPLC method development for pharmaceuticals. HPLC Method Development for Pharmaceuticals. , Separation Science and Technology; 8. Elsevier Academic Press Inc. 1-11 (2007).
  21. Li, Y., Pan, S., Zhang, W., Du, Z. Novel thermo-sensitive core-shell nanoparticles for targeted paclitaxel delivery. Nanotechnology. 20 (6), 065104 (2009).
  22. Kato, J., et al. Disulfide cross-linked micelles for the targeted delivery of vincristine to B-cell lymphoma. Mol. Pharm. 9, 1727-1735 (2012).
  23. Lu, S. C. Regulation of glutathione synthesis. Mol. Aspects Med. 30, 42-59 (2009).
  24. Xiao, K., et al. "OA02" peptide facilitates the precise targeting of paclitaxel-loaded micellar nanoparticles to ovarian cancer in vivo. Cancer Res. 72, 2100-2110 (2012).
  25. Koo, A. N., et al. Disulfide-cross-linked PEG-poly(amino acid)s copolymer micelles for glutathione-mediated intracellular drug delivery. Chem. Commun. 28, 6570-6572 (2008).
  26. McLellan, L. I., Wolf, C. R. Glutathione and glutathione-dependent enzymes in cancer drug resistance. Drug. Resist. Update. 2, 153-164 (1999).
  27. Karala, A. R., Lappi, A. K., Saaranen, M. J., Ruddock, L. W. Efficient peroxide-mediated oxidative refolding of a protein at physiological pH and implications for oxidative folding in the endoplasmic reticulum. Antioxid. Redox Signal. 11, 963-970 (2009).
  28. Gabizon, A., et al. Cancer nanomedicines: closing the translational gap. Lancet. 384, 2175-2176 (2014).
  29. Nanotrac Nanotechnology Particle Size Measurement Solutions. , Available from: http://www.vahitech.com/Assets/Nano(US)Web.pdf (2006).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 118، جسيمات متناهية الصغر، والتسليم المخدرات، المذيلات، telodendrimer، ثنائي السلفيد عبر ربط والهيدروجين بيروكسيد بوساطة الأكسدة
مقاربة سطحية وكفاءة لإنتاج المذيلات عكسية ثاني كبريتيد عبر ربط
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Y., Bharadwaj, G., Lee, J. S. A… More

Li, Y., Bharadwaj, G., Lee, J. S. A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles. J. Vis. Exp. (118), e54722, doi:10.3791/54722 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter