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Biochemistry

Eine leichte und effiziente Ansatz für die Produktion von Reversible Disulfid Vernetzte Mizellen

Published: December 23, 2016 doi: 10.3791/54722
Automatic Translation
1,2, 1, 3
1Department of Biochemistry & Molecular Medicine, University of California, Davis, 2UC Davis Comprehensive Cancer Center, University of California, Davis, 3Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of California, Davis

Abstract

Nanomedizin ist eine neue Form der Therapie, die die einzigartigen Eigenschaften von Teilchen nutzt, die Nanometer-Skala für die biomedizinische Anwendung sind. Die Verbesserung der Arzneimittelabgabe zu therapeutischen Ergebnisse zu maximieren und Drogen-assoziierte Nebenwirkungen zu reduzieren, sind einige der Eckpfeiler der heutigen Nanomedizin. Nanopartikel haben insbesondere eine breite Anwendung in der Krebstherapie gefunden. Nanopartikel, die ein hohes Maß an Flexibilität in Design, Anwendung bieten, und die Produktion auf der Tumor-Mikroumgebung basieren projiziert effektiver mit schnellen Übersetzung in die klinische Praxis zu sein. Der polymere mizellaren Nanoträger ist eine beliebte Wahl für Drug-Delivery-Anwendungen.

In diesem Artikel beschreiben wir ein einfaches und wirksames Protokoll für wirkstoffbeladene, Disulfid- vernetzte Mizellen auf der Basis der Selbstorganisation von einem gut definierten amphiphilen dendritischen linear-Copolymer (telodendrimer, TD) zu synthetisieren. TD besteht aus Polyethylen gl zusammengesetztycol (PEG) als hydrophiles Segment und ein thiolierten Cholsäure cluster als kernbildende hydrophobe Einheit gebunden schrittweise an ein Amin-terminiertes PEG-Peptid unter Verwendung basierten Lösungschemie. Chemotherapeutika, wie Paclitaxel (PTX), kann unter Verwendung einer Standard-Lösungsmittelverdampfungsverfahren geladen werden. Die O 2 -vermittelte Oxidation wurde zuvor verwendet intra-micellaren von freien Thiolgruppen auf der TDs Vernetzungen Disulfid zu bilden. Allerdings war die Reaktion langsam und nicht durchführbar für die großtechnische Produktion. Kürzlich wurde eine H 2 O 2 -vermittelten Oxidationsverfahren als ein durchführbarer und effizienten Ansatz untersucht, und es war 96 - mal schneller als die zuvor beschriebene Verfahren. Mit diesem Ansatz 50 g PTX belastetes, Disulfid vernetzten Nanoteilchen wurden mit enger Korngrößenverteilung und eine hohe Wirkstoffbeladung Effizienz erfolgreich hergestellt. Die Stabilität der resultierenden Mizellen-Lösung wird analysiert unter Verwendung stören Bedingungen wie Koinkubation with eines Detergens Natriumdodecylsulfat, mit oder ohne Reduktionsmittel. Die wirkstoffbeladenen, Disulfid- vernetzte Mizellen zeigten weniger hämolytische Aktivität im Vergleich zu ihren nicht-vernetzten Pendants.

Introduction

Die Nanotechnologie ist eine sich schnell entwickelnden Feld , das eine Reihe von biomedizinischen Bereichen 1 profitiert hat. Nanopartikel bieten Möglichkeiten für die Gestaltung und Abstimmung Eigenschaften, die nicht möglich mit anderen Typen von konventionellen Therapeutika sind. Nano-Carrier , die Stabilität von Medikamenten gegen biologischen Abbau zu verbessern, Drogenzirkulationszeit verlängern, Arzneistofflöslichkeit Probleme zu überwinden, und kann für eine gezielte Arzneimittelabgabe und für die Co-Abgabe - Bildgebungsmittel 1,2 fein abgestimmt werden. Nanopartikel-basierten Delivery-Systeme halten Versprechen in der Tumordiagnostik und Behandlung. Tumorgefäßsystemen sind undicht Makromoleküle und können über die erhöhte Permeabilität und Retention (EPR) Effekt 3 von zirkulierenden Nanopartikel an Tumorstellen zu Vorzugs Akkumulation führen. Unter den verschiedenen Nanoträger (zB Liposomen, Hydrogele und polymere Mizellen) , die aktiv als Träger für Medikamente gegen Krebs verfolgt werden, haben polymere Mizellen große Popularität über th gewonnene letzten zehn Jahren 4,5.

Polymere Mizellen sind ein thermodynamisches System, das, bei intravenöser Applikation, potentiell unterhalb der kritischen Mizellenkonzentration (CMC) verdünnt werden, was zu ihrer Dissoziation in Unimere. Die Vernetzung Strategien wurden eingesetzt, um mizellare Dissoziation in Unimere minimieren. Jedoch übermäßig stabilisierten Micellen kann das Arzneimittel durch die Freisetzung an den Zielstellen zu verhindern, wodurch die Gesamt therapeutische Wirksamkeit reduziert. Das Vernetzungs abbaubaren in Reaktion auf machen erforscht Redox- oder auf externe Stimuli, wie reduzierbare Disulfidbindungen 6,7 und pH spaltbare 8 oder hydrolysierbaren Esterbindungen 9,10 mehrere chemische Ansätze wurden.

Wir haben bereits berichtet , das Design und die Synthese von mizellaren Nanopartikel bestehend aus dendritischen Cholsäure (CA) blockiert und lineare Polyethylenglykol (PEG) -Copolymeren, die als telodendrimers (TD) 11-15 nK -CAy (wobei n = Molekulargewicht in Kilodalton (K), y = Anzahl der Cholsäure (CA) units). Sie zeichnen sich durch ihre geringe Größe, lange Haltbarkeit gekennzeichnet, und eine hohe Effizienz in Einkapseln Wirkstoffen wie Paclitaxel (PTX) und Doxorubicin (DOX) in dem hydrophoben Kern. Die Bausteine ​​von TD, wie PEG, Lysin und CA, sind biokompatibel, und die Anwesenheit einer PEG corona kann eine "stealth" Nanoteilchen Charakter verhindert unspezifische Aufnahme von mizellaren Nanopartikel von den retikuloendothelialen Systemen verleihen.

Thiolierte linear-dendritischen Polymere lassen sich leicht durch die Einführung von Cysteinen in die dendritischen Oligo-Lysin Rückgrat unserer Standard-TDs erzeugt werden. Dieser Artikel stellt eine einfache Protokoll zur Herstellung eines reversibel vernetzten mizellaren Arzneimittelabgabesystem durch Disulfid - Vernetzungen in den hydrophoben Kern von TDs (Abbildung 1) eingeführt wird .

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Protocol

Ethik-Anweisung: Weibliche athymische Nacktmäuse (Nu / Nu-Stamm), 6-8 Wochen alt, wurden gekauft und dann unter keimfreien Bedingungen gehalten nach AAALAC Richtlinien und wurden für mindestens 4 Tage vor irgendwelchen Experimenten zu akklimatisieren gelassen. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts durchgeführt und gemäß Protokoll Nr 07-13119 und Nr 09-15584, genehmigt durch den Einsatz von Tieren und Pflege Verwaltungs Advisory Committee an der University of California, Davis.

1. Synthese von TD PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8

  1. MeO-PEG 5K - NH 2 (2 g, 0,4 mmol) in 10 bis 20 ml wasserfreiem Dimethylformamid (DMF) und Chill auf Eis in einem Rundkolben, aufzulösen.
  2. In einem Becherglas auflösen 3 Äquiv. von 1-Hydroxy-6-chlor-benzotriazol (HOBt), 3 equiv. von N, N '-diisopropylcarbodiimide (DIC) und 3 equiv. von (Fmoc) 2 Lys-OH in wasserfreiem DMF (10-15 ml). Rühren Sie für 15-20 min auf einer magnetischen Rührplatte.
  3. Fügen Sie die Mischung in den Reaktionskolben enthalten , die MeO-PEG 5K - NH 2. das Eisbad entfernen und rühren Sie das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur.
  4. Bestätigen Sie den Abschluss der Reaktion mit Dünnschichtchromatographie (TLC) 16 und Kaiser-Test 17 (eine gelbe Farbe zeigt das Fehlen von freien NH 2). Auszufällen , das Polymerprodukt 1 (MeO-PEG 5K -Lys (NH-Fmoc) 2) durch Zugabe von etwa 200 ml eiskaltem Ether zu dem Reaktionskolben. Trennen des ausgefällten Polymers durch Zentrifugation (6 min bei 6000 xg und 4 ° C).
    1. Zur Durchführung TLC, vor Ort die Proben an Kieselgel beschichtete DC-Platten. Verwenden von Dichlormethan / Methanol (9: 1) als mobile Phase. Beachten Sie Flecken unter einer UV-Lampe, nachdem sie die DC-Platten zu entwickeln. Man kann auch Färbereagenz verwenden Ninhydrin zu Amin Flecken auf einer heißen Platte visualisieren.
    2. Für Kaiser Test, setzen Sie ein wenig von der Probe in Glasröhrchen Kaiser-Reagenz enthält. Erhitzen Sie es bei 100 ° C für 5 Minuten und suchen Sie nach dem Farbwechsel (wenn die Farbe der Lösung gelb bleibt, dann ist die Reaktion abgeschlossen ist).
  5. Wieder lösen das Produkt in wasserfreiem DMF (10-20 ml) und wiederholen Sie die Fällung und Zentrifugation (siehe Schritt 1.4).
  6. Wiederholen Sie Schritt 1.5, und dann waschen Sie den Polymerniederschlag dreimal mit eiskaltem Äther.
  7. Übertragen Sie das Polymerniederschlag 1 in ein sauberes Reaktionskolben und schließt den Kolben an einer Hochvakuumquelle , um die restliche Ether zu entfernen.
  8. Bereiten Sie und fügen Sie ca. 20-30 ml 20% (v / v) 4-Methylpiperidin in DMF zu Polymer Zwischen 1. Rühren bis zur vollständigen Auflösung. Führen Sie die Reaktion für 3 Stunden.
  9. Führen TLC 16 und Kaiser-Test (eine blaue Farbe bestätigt das Vorhandensein von freien NH 2) 17 (siehe Schritt 1.4) , um die completio zu bestätigenn der Reaktion. Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, fahren Sie mit dem Etherfällung, wie für das Produkt 1 erwähnt (Schritte 1,4-1,6).
  10. Trocknen des polymeren Produkts 2 (MeO-PEG 5K -Lys (NH 2) 2) unter einem Vakuum.
  11. Führen Sie eine weitere Runde von (Fmoc) 2 Lys-OH-Kupplung auf Zwischenprodukt 2 (Schritte 1,1-1,7) zu erzeugen Produkt 3 (MeO-PEG 5K -Lys (Lys (NH-Fmoc) 2) 2). De-Schutz (Schritte 1,8-1,10) werden die Fmoc - Gruppen (4, MeO-PEG 5K -Lys (Lys (NH 2) 2) 2) und Paar (Schritte 1,1-1,7) , um das (Fmoc) Lys (Boc) -OH zu erzeugen eines dritten Generation dendritische Polylysin (5, MeO-PEG 5K -Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys (Boc)) 4) terminiert mit vier Boc und Fmoc - Gruppen an einem Ende der PEG - Kette.
  12. Übertragung der resultierenden Polymerzwischenprodukt 5 in einen Reaktionskolben. in wieeparate Reaktionskolben, bereiten 1: 1 (v / v) Trifluoressigsäure (TFA) in Dichlormethan (DCM). Hinzufügen 15-20 ml einer 1: 1 TFA / DCM (v / v) Mischung an das Polymerzwischenprodukt 5. Rühren Sie die Mischung, bis das Polymer vollständig gelöst ist. Rühre weitere 3 Stunden.
  13. Führen TLC 16 und Kaiser-Test (eine blaue Farbe bestätigt das Vorhandensein von freien NH 2) 17 (siehe Schritt 1.4) , um die Beendigung der Reaktion zu bestätigen. Wenn die Reaktion vollständig ist, dampft das Polymer-in-TFA / DCM-Gemisch mit Luft, bis eine viskose Lösung erhalten wird. Fahren Sie mit dem Etherfällung, wie für das Produkt 1 erwähnt (Schritte 1,4-1,6). Trocknen das polymere Produkt 6 (MeO-PEG 5K -Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys (NH 2)) 4) unter einem Vakuum.
  14. Transfer Polymerzwischenprodukt 6 in einen Reaktionskolben. Verwenden etwa 40 ml wasserfreiem DMF, enthaltend 8 equiv. von N, N -diisopropylethylamine (DIEA) , um die Polymerzwischenprodukt 6 zu lösen. In einem Becherglas löst man 12 equiv. HOBt, 12 equiv. von DIC und 12 equiv. von (Fmoc) Cys (Trt) -OH in 20-25 ml wasserfreiem DMF. Schütteln für 10-15 Minuten, und fügen Sie dann das Reaktionsgemisch in den Reaktionskolben mit 6. Führen Sie die Reaktion über Nacht.
  15. Bestätigen Sie den Abschluss der Reaktion mit TLC 16 und Kaiser-Test (siehe Schritt 1.4, eine gelbe Farbe zeigt das Fehlen von freien NH 2) 17. Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, fahren Sie mit dem Etherfällung, wie für das Produkt 1 (Schritt 1,4-1,6) erwähnt, Produkt 7 (MeO-PEG 5K -Lys-Lys 2 zu isolieren - ((Fmoc) Lys - ((Fmoc) Cys (Trt))) 4.
  16. Führen Fmoc de-Schutz auf 7, wie in Schritt 1.8 beschriebenen, zu erhalten Produkt 8 (PEG 5K -Lys-Lys 2 - (Lys (NH 2) - (Cys (NH 2) (Trt))) 4). Paar (Fmoc) -PEG 2 Suc--OH ( "Ebes" Linker, 24 Äquiv.) Auf einem Polymerzwischen mit dem oben beschriebene Verfahren für HOBt / DIC-vermittelte Kopplung zu erhalten Zwischen 9 (MeO-PEG 5K -Lys-Lys 2 -Lys 4 - (Cys (Trt) ) 4 (Ebes (NH-Fmoc)) 8).
  17. Führen Sie eine weitere Runde von Fmoc de-Schutz (Schritte 1,6-1,8) zu erhalten Zwischenprodukt 10 (MeO-PEG 5K -Lys-Lys 2 -Lys 4 - (Cys (Trt)) 4 (Ebes (NH 2)) 8).
  18. Übertragen Sie die Polymerzwischenstufe 10 in einen Reaktionskolben und fügen wasserfreiem DMF (ca. 30-40 ml) , um es aufzulösen. In einem anderen Reaktionskolben, lösen sich 24 equiv. von CAOSu (hergestellt nach dem zuvor veröffentlichten Verfahren) in wasserfreiem DMF (20-30 ml) 18. In 48 equiv. von N, N - Diisopropylethylamin und lassen Sie es für 10-15 min rühren. Übertragen Sie den Inhalt in den Reaktionskolben mit 10 und ließ den Reaktionslauf overnight.
  19. Bestätigen Sie den Abschluss der Reaktion mit TLC 16 und Kaiser-Test (siehe Schritt 1.4, eine gelbe Farbe zeigt das Fehlen von freien NH 2) 17. Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, fahren Sie mit dem Etherfällung, wie für das Produkt 1 erwähnt (Schritte 1,4-1,6) zu isolieren Produkt 11 (MeO-PEG 5K -Lys-Lys 2 -Lys 4 - (Cys (Trt)) 4 -Ebes 8 -CA 8). Dialysieren es in deionisiertem Wasser und lyophilisieren der Probe um ein weißes Pulver zu ergeben.
  20. Legen Sie das Polymerzwischenprodukt 11 in einen Reaktionskolben. Bereiten Sie und fügen Sie 20 ml des TFA / 1,2-Ethandithiol (EDT) / Triethylsilan (TIS) / H 2 O (94 / 2,5 / 1 / 2,5, v / v) Mischung in die Polymerlösung. Rühren Sie die Mischung bis zur vollständigen Auflösung. Führen Sie die Reaktion für 4 Stunden. Bestätigen der Beendigung der Reaktion durch TLC 16.
  21. Unter der Dunstabzug, blasen Luft in das Polymer-TFA / EDT / TIS / H 2O-Mischung, bis die Lösung viskos. Fahren Sie mit dem Etherfällung, wie für das Produkt 1 erwähnt (Schritte 1,4-1,6), das Endprodukt zu isolieren, 12 (PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8). Löst ihn in Acetonitril und lyophilisieren es ein weißes Pulver zu ergeben.

2. Herstellung von PTX belasteten Micellen

  1. Bereiten Sie eine PTX belastetes PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 Mizellen die Standard - Verdampfungsverfahren verwendet wird .
    1. Man löst 20 mg des TD mit einer unterschiedlichen Menge an PTX (1-9 mg) in 1 ml Chloroform (CHCl 3). Entfernen des Lösungsmittels am Rotationsverdampfer unter Verwendung eines homogenen, trockenen Polymerfilm zu erhalten. Rekonstituieren der Film mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch Wirbel, gefolgt durch Beschallung für 30 min bei 40 kHz, falls notwendig, die Bildung von wirkstoffbeladenen Mizellen zu ermöglichen.
    2. Hinzufügen 6 ul 3% (w / w) H 2 O 2 (1 Äquiv. FRee den Thiolgruppen) die Thiolgruppen auf dem TD zu oxidieren. Verwenden Sie die Mizellen - Lösung für die weitere Charakterisierung einmal das Niveau der freien Thiolgruppen bleibt bei konstant niedrigen Werten, wie 19 von Ellman-Test zeigte.
    3. Filtern der Lösung mit einem 0,22-um-Filter, um die Probe zu sterilisieren. Analyse der Menge an Arzneimittel in den Mizellen auf einem 20 - System HPLC geladen , nachdem die Medikamente aus den Mizellen durch Zugabe von Löse 9mal Acetonitril und die Durchführung 10 min Beschallung. Verwenden Sie eine C18-Säule für HPLC mit Acetonitril / Wasser als mobile Phase.
    4. Berechne die Wirkstoffbeladung nach der Kalibrierungskurve zwischen den HPLC - Flächenwerten und den Konzentrationen des Arzneimittels Standard 11.
      HINWEIS: Die Beladungseffizienz als das Verhältnis von Arzneimittel in die Mizellen auf den Anfangswirkstoffgehalt geladen definiert ist.

3. Charakterisierungen von Mizellen

  1. Messen der Größe und Größenverteilung der micelles mit einer dynamischen Lichtstreuung (DLS) Instrument 29. Führen Sie die Messungen bei Raumtemperatur und halten Sie die Micellenkonzentration bei 1 mg / ml.
    HINWEIS: Um die Partikelgrößenanalyse durchzuführen, verwenden PBS als leer, und dann die Partikelgröße für den tatsächlichen Proben aufzuzeichnen. Nehmen Sie die Messwerte in dreifacher Ausfertigung für Proben, und dann die Messwerte gemittelt.
  2. Verwenden Fluoreszenzspektren der kritischen mizellaren Konzentration (CMC) von PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 vor und nach der Vernetzung mit Pyren als hydrophobe fluoreszierende Sonde zu messen, wie zuvor beschrieben 13,21.
    HINWEIS: In der Regel reicht die Mizellenkonzentration von 5 × 10 -7 bis 5 × 10 -4 M.

4. Stabilität der Mizellen in SDS mit oder ohne Reduktionsmittel

  1. Vorbereitung Stammlösungen von Natriumdodecylsulfat (SDS) Lösung (7,5 mg / ml) und Disulfid vernetzte Mizellen (1,5 mg / ml) in PBS. Als nächstes udie Stammlösungen singen, eine Lösung Mischung die endgültige SDS-Konzentration bei 2,5 mg / ml, und die Mizellen-Konzentration bei 1,0 mg / ml, in dem zu machen.
  2. Messen der Größe und Größenverteilung der Mizelle-Lösungen in vorgegebenen Zeitabständen mit oder ohne die Gegenwart von 10 mM Glutathion (GSH) (wie in Schritt 3.1 erwähnt).

5. Hämolyse-Assay

  1. Bewerten Sie die hämolytische Potenzial der PTX-geladen, nicht-vernetzte Mizellen (PTX-NCM) , hergestellt nach zuvor veröffentlichten Verfahren 11 und PTX belasteten vernetzte Mizellen (PTX-DCMs) mit frischen Citratblut von Nacktmäusen aus den gesammelten Schwanz Schleier.
    1. Sammeln der roten Blutzellen durch Zentrifugation der Blutprobe (1,0 ml) bei 1.000 xg für 10 min, wasche sie dreimal mit PBS, dann Resuspendieren der Zellpellets mit PBS auf eine Endkonzentration von 2%.
  2. Mischen Sie 200 ul Erythrozytensuspension mit unterschiedlichen Konzentrationen (0,2 und 1,0mg / ml) von PTX-NCM und PTX-DCMs sind und bei 37 ° C in einem Inkubator-Schüttler für 4 Stunden inkubiert.
  3. Zentrifugieren der Micelle-Erythrozyten Mischungen bei 3.000 xg für 5 min. Transfer von 100 & mgr; l des Überstands aller Proben in eine 96-Well-Platte. Messen Sie die Absorption von freiem Hämoglobin im Überstand bei 540 nm eine Mikroplattenleser verwenden.
    HINWEIS: RBCs inkubiert mit Triton-100 (2%) und PBS sind die positive und negative Kontrollen verwendet werden, respectively. Die prozentuale Hämolyse der RBCs wird mit folgender Formel berechnet wird : RBC - Hämolyse = (OD Probe - OD Negativkontrolle) / (OD positive Kontrolle - OD negative Kontrolle) × 100%.

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Representative Results

Herstellung und Charakterisierung von wirkstoffbeladenen, Disulfide Vernetzte Micellen

Amphiphile Polymer PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 ist eine dendritische Polymer in der Lage , eine Disulfid - vernetztes micellaren System für die Krebsmedikamentenabgabe zu bilden. Strukturell ist es als dendritischen Oligomer von Cholsäuren (hydrophobe Domäne), die mit einem Ende des linearen PEG-Molekül (hydrophile Domäne, Molekulargewicht 5K) durch einen verzweigten Poly (lysin-Cystein-Ebes) Rückgrat definiert. Es gibt mehrere Vorteile dieser Blockcopolymere gegenüber anderen berichtet mizellaren Systemen. Erstens kann sie leicht über schrittweise Lösungsphasenkondensationsreaktionen synthetisiert werden. Zweitens, im Vergleich zu mehreren anderen beschriebenen amphiphilen Polymere, die thiolierten Polymersystem, hergestellt durch gut etablierte Lösungsphase schrittweise Fmoc Peptidchemie, hat eine gut definierte structuRe. Es kann in lyophilisierter Pulverform gelagert werden und hat eine längere Haltbarkeit.

Verschiedene Techniken können das Endprodukt zu charakterisieren, verwendet werden. Die Menge an Cholsäure TD befestigt kann durch Vergleichen des Signalverhältnisses der Protonen an PEG zu denjenigen auf den drei Methylgruppen von Cholsäure in 1 H - NMR - Spektren nachgewiesen werden. Die Molekulargewichte der TD kann durch MALDI-TOF Massenspektrometrie und Gelpermeationschromatographie (GPC) bestätigt werden. Die quantitative Ellman-Test kann verwendet werden, um die Anzahl der freien Cysteinresten pro Molekül vorhanden zu dechiffrieren.

PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 kann selbstorganisieren Micellen in wässrigen Medien zu bilden. Mit einem Standard - Lösungsmittelverdampfungsverfahren, eine Vielzahl von hydrophoben Arzneimitteln, wie PTX und Vincristin, wurden in den Mizellen 13,22 erfolgreich eingekapselt. Oxygen wurde zuvor die freien Thiolgruppen von PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 zur Oxidation eingesetzt und intra mizellaren Disulfidquervernetzungen zu bilden. Wie von Ellman-Test überwacht, um die Conversion-Rate von freien Thiolgruppen Disulfidbindungen erreichte 85% nach 48 Stunden der Oxidation. AH 2 O 2 -vermittelten Oxidierung wurde vor kurzem als eine alternative Methode angewendet. Die Umwandlungsrate erreichte 88% in 30 Minuten (Abbildung 2), die 96 - mal schneller als der bisherige Ansatz war. Fünfzig Gramm PTX belastetes, Disulfid- vernetzten Nanoteilchen wurden erfolgreich unter Verwendung dieser effizienteren Ansatz (3) erzeugt wird . Die Teilchengröße betrug etwa 27 nm mit einer engen Größenverteilung (Abbildung 3). Die Arzneimittelbeladungseffizienz genähert 100% mit PTX Beladung von 4,0 mg / ml. Disulfid-Vernetzung hatte eine dramatische Wirkung auf die CMC-Wert. Im Vergleich zu Standard TD PEG 5K -CA 8 , die fehlenDisulfidbindungen, die vernetzte TD zeigte eine 10-fache Abnahme in der CMC - Werte beobachtet (5,53 & mgr; M gegenüber 0,67 uM) 13.

Stabilitätsstudien

Wir untersuchten die Stabilität von PTX-geladen, Disulfid vernetzte Mizellen gegen schwere Mizellen zu stören Bedingungen. Natriumdodecylsulfat (SDS) ist eine starke ionische Reinigungsmittel, die für die Beurteilung der mizellaren Stabilität routinemäßig verwendet wird, wie es effizient polymere Mizellen kann brechen. Die Stabilität von mit Wirkstoff beladenen, Disulfid- vernetzte Mizellen (1,0 mg / ml) wurde durch DLS in Gegenwart der Mizelle-Unterbrechung SDS (2,5 mg / ml) überwacht. Die Partikelgröße der Mizellen blieb stabil über die Zeit, was darauf hinweist , dass eine solche vernetzte Mizellen intakt blieb (Abbildung 4, linke Felder). Reduktiven Bedingungen erwartet Disulfidbrücken in dem hydrophoben Kern spalten, thereby machen Mizellen anfällig für Destabilisierung. Glutathion (GSH), eine endogene Reduktionsmittel wird oft für solche Studien verwendet. Es gibt starken Kontrast in der intrazellulären Ebene von GSH im Vergleich zu der extrazellulären Ebene (10 mm im Vergleich zu 2 & mgr; m). Dieser Unterschied in der Konzentration wird häufig zu erzeugen stimulierbaren Systemen eingesetzt. Nach der Zugabe von GSH bei einer intrazellulären Konzentration (10 mm) 23, die Größe der wirkstoffbeladenen, Disulfid- vernetzte Mizellen blieb für 30 min erhalten. Sie verringerte sich abrupt bis 1 nm, was bedeutet , die Reduktion einer kritischen Anzahl von Disulfidbindungen, eine Voraussetzung für die schnelle Dissoziation der Mizellen (Abbildung 4, rechtes Feld). Im Gegenteil blieb das System stabil in Gegenwart von extrazellulären Konzentrationen von GSH (Daten nicht gezeigt).

Hämolyse - Studie

Zahl5 zeigt die Unterschiede in der beobachteten hämolytischen Aktivität von PTX belasteten Mizellen mit oder ohne Disulfid - Vernetzung. Hämolyse der Blutzellen zu vermeiden, wenn diese Partikel in den Blutstrom verabreicht, da sie ihre therapeutische Vorteile unterminiert. Blut-Kompatibilität ist sehr entscheidend für die in vivo Anwendung polymerbasierter Wirkstoffträger, wie beispielsweise die amphiphilen TDs, die das Potential haben , Lipiden zur Solubilisierung oder sich in Phospholipid - Membranen einzusetzen, zum Aufreißen von Plasmamembranen führen. Wie in 5 gezeigt, wurden die PTX-NCM gefunden 0,2 mg erhöht eine dosisabhängige roten Blutkörperchen (RBC) Lyse Zählung zu haben, mit dem Prozentsatz der Hämolyse von 8,1% auf 14,2% , wenn die Konzentration der PTX-NCM zunehmenden / ml bis 1,0 mg / ml. Allerdings PTX-DCMs, die Disulfid-Vernetzung haben zeigte keine beobachtbare hämolytische Aktivitäten (<1,0%) in den roten Blutkörperchen unter den gleichen Versuchsbedingungen. Dieser Unterschied in der hemolysist, kann Trend zu den Intra-micellaren Disulfidbrücken, die an der hydrophoben Kern zurückgeführt werden, die aus dissoziierenden amphiphilen TDs zu bilden PTX-DCMs verhindern.

Abbildung 1
Abbildung 1: Schritte zur Bildung vernetzte Mizellen. Schematische Darstellung der Disulfid - quervernetzten Micellen durch Oxidation der gebildeten thiolierten telodendrimer PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 nach Selbstmontage. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Oxidationsverfahren für vernetzte Mizellenbildung. Die Umwandlungsrate von ter Thiolgruppen an den TDS-Bindungen als Funktion der Oxidationszeit für die beiden Oxidationsverfahren zu Disulfid. Die Gesamtkonzentration der Mizellen wurde bei 20 mg / ml gehalten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: wirkstoffbeladene, vernetzte Mizellen. Linke Seite: ein Bild von einem Stapel von PTX-geladen, Disulfid vernetzte Mizellen. Maßstabsbalken: 1 Zoll. Rechts: die Partikelgröße, wie durch dynamische Lichtstreuung (DLS) bestimmt. Die Gesamtkonzentration von Micellen wurde bei 20 mg / ml gehalten. Die Beladung des PTX betrug 4 mg / ml. Die Partikelgrößendaten wurde als die mittlere Teilchengröße ± SD auf drei Messungen basiert gezeigt. SD: Standardabweichung, beschreibt die Breite der gemessenen Korngrößenverteilung.Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Stabilitätsstudie. Die Partikelgröße des PTX belasteten, Disulfid- vernetzte Mizellen in Gegenwart von 2,5 mg / ml SDS, ohne (links) oder mit (rechts) GSH (10 mM), wie von DLS gemessen. Die Partikelgrößendaten wurde als die mittlere Teilchengröße ± SD auf drei Messungen basiert gezeigt. SD: Standardabweichung, beschreibt die Breite der gemessenen Korngrößenverteilung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5: Hämolyse - Assay. Die in vitro hämolytischen Aktivitäten PTX belastetes, Disulfid- vernetzte Mizellen im Vergleich zu nicht-vernetzte Mizellen auf roten Blutzellen (RBCs). Triton-100 (2%) und PBS wurden als positive und negative Kontrollen verwendet wurden. Die angegebenen Werte sind der Mittelwert ± SD von dreifachen Proben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Mehrere Nanopartikel wurden für ihre mögliche Verwendung in Medikamentenabgabe untersucht. Liposomales Doxorubicin und Paclitaxel (PTX) -beladene Humanserumalbumin Nanoaggregaten unter den nanotherapeutics von der FDA zur Behandlung von Krebs zugelassen sind. Obwohl jedoch klinisch wirksam sind beide dieser nanotherapeutics relativ "groß" in der Größe, und sie neigen dazu, in der Leber und Lunge anreichern. Polymere Mizellen mit relativ kleineren Partikelgrößen und höhere Wirkstoffbeladung Kapazitäten entstehen Nanocarriern zur Arzneimittelabgabe. Ihre einzigartige Kern-Schale-Struktur '' solubilisieren '' die hydrophoben Wirkstoffmoleküle unter wässrigen Bedingungen durch physikalische Kapselung. Polymere Mizellen, bestehend aus wohldefinierten TDs, hergestellt in unserem Labor Form monodisperser Nanopartikel (10-50 nm Partikelgröße) mit einer langen Haltbarkeit und hohe Effizienz Drogen in kapseln. Einer der vielen Vorteile der robusten TD Plattform ist die Vielseitigkeit des Polymers.Zahlreiche Medikamente, Fluoreszenzfarbstoffe und Targeting - Liganden können leicht in die TD - Plattform 13,15,24 eingearbeitet werden.

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls

Wir haben eine robuste, reversible, Disulfid vernetzten Micelle System zur Lieferung PTX entwickelt, die gut definiert ist, mit einer Partikelgröße etwa 27 nm, und eine enge Größenverteilung. Die TDs wurden über schrittweise Lösungsphasen-Peptidchemie synthetisiert. Die wohldefinierte chemische Struktur dieser TDs ist der Schlüsselfaktor für Nanopartikel mit den gewünschten Eigenschaften zu erzeugen. Daher mit TLC und Kaiser-Test die Beendigung der Reaktion bestätigt ist sehr kritisch. Die H 2 O 2 die Oxidation ist auch ein entscheidender Schritt, die Thiolgruppen auf dem TD oxidiert werden Disulfidbrücke einen Verbindungen zu bilden, die stark die Stabilität der Mizellen verstärken. Im Vergleich zu unseren früheren Sauerstoffbasis Oxidationsverfahren, das H 2 O 2 -basierend Oxidationsverfahren ist 96 mal schneller, wodurch vernetzte Mizellen in kürzerer Zeit bereitstellt. Weiterhin GSH, ein Thiol-enthaltendes Tripeptid, ist ein wichtiges Antioxidationsmittel von den Zellen produziert, und es spielt eine wichtige Rolle in freie Radikale und reaktive Sauerstoff-Verbindungen Spülung. Es macht wichtige Beiträge durch die zellulären Redox Aufrechterhaltung der Homöostase. Die zelluläre Konzentration von GSH ist ein interessanter Aspekt der Wirkstoffentwicklung. Die intrazelluläre Konzentration von GSH ist nun fest wesentlich höher als die extrazelluläre Konzentration (10 mM gegenüber 2 uM jeweils) 25 aufgebaut werden. Noch wichtiger ist , ein erhöhter intrazellulärer GSH Niveau oft in vielen Medikamenten-resistenten humanen und murinen Tumorzellen 26 berichtet. Die hohe intrazelluläre Verteilung von GSH erleichtert den Bruch der Disulfid Vernetzung der Micellen und führt zur Freisetzung und Akkumulation des Arzneimittels Nutzlast. Das Disulfid vernetzten Nanoteilchenin Gegenwart von SDS stabil. Jedoch ein GSH-rich intrazellulären Umgebung löst die Freisetzung des Medikaments durch Aufbrechen der Disulfidbindungen nach unten, wodurch das System zu destabilisieren. Polymer-induzierte Hämolyse resultiert aus der nachteilige Wechselwirkung von polymeren Mizellen mit Blutbestandteilen wie roten Blutkörperchen. Vernetzte Mizellen zeigte viel weniger Hämolyse im Vergleich zu nicht-vernetzten Analoga.

Technische Änderungen und Fehlerbehebung

H 2 O 2 als Oxidationsmittel verwendet ermöglicht eine effizientere Disulfid Vernetzungsbildung bei 13 mit dem bereits berichtet, auf Sauerstoff basierenden Verfahren verglichen. H 2 O 2 ist ein starkes Oxidationsmittel 27 , die kostengünstig und in Wasser gut löslich ist und gibt qualitativ hochwertige Produkte im Vergleich zu einigen anderen bekannten Oxidationsmitteln (zB Chromat oder Permanganat). Jedoch kann die Oxidierung Zeit werden müssen further optimiert auf der Grundlage des Ausmaßes der Synthese.

Einschränkungen der Technik

H 2 O 2 ist ein starkes Oxidationsmittel. Auch wenn eine niedrige Konzentration von H 2 O 2 für die Durchführung verwendet wird , um die Disulfid - Vernetzung Bildung, muss darauf geachtet werden , wenn sie mit TDs beladen mit "oxidationsempfindlichen" Drogen zu unerwünschten Arzneimittel Abbau zu verhindern.

Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende / Alternativmethoden

Die beschriebene Technik ist eine einfache Versuchsanordnung, die ohne weiteres in einem Standardlabor repliziert werden kann. Zum Beispiel Wirkstoffbeladung eine Standard-Verdampfungsverfahren ist weniger Zeit, um die Dialyseverfahren im Vergleich raubend. Die Disulfid - Bildung in den Kern H 2 O 2 als Oxidationsmittel verwendet ist 96 mal schneller als die zuvor berichteten Oxidationsverfahren unter Verwendung oxygde 13. Reproduzierbarkeit der Wirkstoff-Beladungsschritt kann leicht durch die Messung der Partikelgröße (DLS-Methode) und Wirkstoffgehalt (HPLC) untersucht werden.

Zukünftige Anwendungen oder Anfahrt nach dieser Technik Mastering

Im Vergleich zu kleinmolekularer Medikamente, eines der wichtigsten Hindernisse , die vor dem Nano-Medizin muss überwunden werden können Mainstream Krebsbehandlung Einstellungen geben die technischen Herausforderungen durch die Aufstockung der Produktion 28 auf. Diese neu entwickelte Technik Nach dem Mastering, kann man leicht Disulfidbrücken vernetzte Mizellen in großem Maßstab synthetisieren. Dies ist äußerst wünschenswert für klinische Studien dieser Nano Formulierung in menschlichen Patienten.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
MeO-PEG5K-NH2 Rapp Polymere 125000-2
Fmoc-Lys(Fmoc)-OH Aaptec AFK107
Fmoc-Lys(Boc)-OH Anaspec AS-20132
Fmoc-Cys(Trt)-OH Aapptec AAC105
Dimethylformamide Fisher Scientific BP1160-4
Ethyl ether Fisher Scientific E134-20
N,N-Diisopropylethylamine Sigma Aldrich D125806
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich T6508 Corrosive, handle with care
4-methyl piperidine Alfa-Aesar L-02709
Ebes linker Anaspec AS-61924
Cholic acid Sigma Aldrich C1129
1,2-Ethanedithiol Sigma Aldrich 02390 Handle inside fume hood. Bleach gloves after usage.
Triisopropylsilane Sigma Aldrich 233781
Chloroform (anhydrous) Sigma Aldrich 288306
Hydrogen peroxide solution 30% Aaron Industries NA
HoBt-Cl Aaptec CXZ096
DIC Sigma Aldrich D125407
Female athymic nude mice (Nu/Nu strain), 6–8 weeks age Harlan (Livermore, CA)

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Biochemistry Ausgabe 118 Nanopartikel Arzneimittelabgabe Mizellen telodendrimer Disulfid- Vernetzung Wasserstoffperoxid-vermittelten Oxidations
Eine leichte und effiziente Ansatz für die Produktion von Reversible Disulfid Vernetzte Mizellen
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Li, Y., Bharadwaj, G., Lee, J. S. A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles. J. Vis. Exp. (118), e54722, doi:10.3791/54722 (2016).

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