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Biochemistry

가역 디설파이드 가교 미셀 제조를위한 손쉬운 효율적인 접근법

Published: December 23, 2016 doi: 10.3791/54722
Automatic Translation
1,2, 1, 3
1Department of Biochemistry & Molecular Medicine, University of California, Davis, 2UC Davis Comprehensive Cancer Center, University of California, Davis, 3Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of California, Davis

Abstract

나노 의학은 생물 의학 응용 프로그램에 대한 규모 나노 미터 입자의 고유 한 특성을 이용합니다 치료의 새로운 형태이다. 치료 결과를 극대화하고, 약물과 관련된 부작용을 감소시키는 약물 전달을 향상 오늘날 나노 의학의 초석 일부이다. 특히 나노 입자는 암 치료의 다양한 응용 프로그램을 발견했다. 디자인, 응용 프로그램 및 종양 미세 환경에 따라 생산에 높은 수준의 유연성을 제공 나노 입자는 임상 적으로 신속한 번역 더 효과적 일 것으로 예상된다. 고분자 미셀 나노 캐리어는 약물 전달 응용 프로그램에 대한 인기있는 선택입니다.

이 글에서, 우리는 잘 정의 된 양친 선형 수지상 공중 합체 (telodendrimer, TD)의 자기 조립 (self-assembly)에 따라 약물로드, 이황화 가교 미셀을 합성하는 간단하고 효과적인 프로토콜을 설명합니다. TD는 폴리에틸렌 GL 구성된다친수성 세그먼트 용액 계 펩티드 화학 제를 사용하여 아민 종결 된 PEG에 코어 형성 용 소수성 잔기에 부착 단계적 같은 티올 콜산 클러스터와 ycol (PEG). 파클리탁셀 (PTX)과 같은 화학 요법 약물은 표준 용매 증발 법을 사용하여로드 될 수있다. 오 2 - 매개 산화는 이전에 TDS 농도에 무료 티올 그룹에서 내 미셀 이황화 가교를 형성하기 위해 사용 하였다. 그러나 반응이 느리고 대규모 생산에 가능하지 않았다. 최근는 H 2 O 2 - 매개 산화법 더 가능하고 효율적인 방식으로 탐구하였으며, 이는 96 배 빠른 속도로 이전에보고 된 방법보다이었다. 이 방법을 사용 PTX로드, 이황화 가교 나노 입자 50g을 성공적으로 좁은 입자 크기 분포와 높은 약물 적재 효율로 생산되고있다. 얻어진 미셀 용액의 안정성은 그러한 w 공동 배양 같은 방해 조건을 이용하여 분석또는 환원제없이 세제, 도데 실 황산나트륨, 제 i. 이들 비 - 가교 상대 비교할 때 약물로드 디설파이드 가교 미셀 적은 용혈 활성을 보여 주었다.

Introduction

나노 기술은 생물 의학 분야 (1)의 수를 도움이되고 빠른 신흥 분야이다. 나노 입자는 기존 치료제의 다른 유형 가능하지 않은 특성을 설계 및 튜닝을위한 기회를 제공한다. 나노 담체는 약물 순환 시간을 연장, 생분해에 대한 약물의 안정성을 향상시키는 약물 용해도 문제를 극복하고, 미세 조정 표적 약물 전달 및 공동 전달 조영제 1.2이 될 수있다. 나노 입자 기반 배달 시스템은 암 이미징 및 치료에 약속을 개최합니다. 종양 vasculatures는 거대 분자에 누설하고 향상된 침투성 및 보존 (EPR) 효과 3를 통해 종양 부위에 나노 입자를 순환의 우선 축적으로 이어질 수 있습니다. 적극적으로 항암 약물 캐리어로 추진되고있는 여러 가지 나노 캐리어 (예를 들어, 리포좀, 하이드로 겔 및 고분자 미셀) 중 고분자 미셀은 일을 통해 폭 넓은 인기를 얻고있다전자 지난 십 4,5.

고분자 미셀은 정맥 내 투여에 잠재적으로 그들의 unimers 해리 선도의 임계 미셀 농도 (CMC) 미만으로 희석 할 수 있고, 열역학 시스템이다. 가교 전략에 unimers 미셀 해리를 최소화하기 위해 사용되어왔다. 그러나, 과도하게 미셀 안정화시켜 전체 치료 효과를 감소 대상 부위에서 방출로부터 약물을 방지 할 수있다. 여러 가지 화학적 방법은 수 있도록 탐구 된 가교 산화 환원에 대한 응답으로 또는 환원 이황화 결합 6,7 및 pH의 절단 (8) 또는 가수 분해 가능한 에스테르 결합 9,10와 같은 외부 자극에 분해.

우리는 이전에 telodendrimers (TD)이라고 설계 및 수지상 콜산 (CA) 및 블록 선형 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 공중 합체로 이루어진 미셀 나노 입자의 합성을보고 11-15 NK -CAy로 표시됩니다. 그들은 이러한 소수성 코어 파클리탁셀 (PTX)과 독소루비신 (DOX)로 캡슐화 약물에 작은 크기, 긴 수명, 높은 효율을 특징으로한다. 이러한 PEG, 리신, 및 CA 등 TD의 빌딩 블록은 생체 적합성 및 PEG 코로나의 존재는 망상 내피 시스템에 의해 미셀 나노 입자의 비특이적 흡수를 방지하는 "은폐"나노 입자의 특성을 부여 할 수있다.

티올 선형 덴드리머 용이 우리 표준의 TDS 수지상 올리고 라이신 백본에 시스테인을 도입함으로써 생성 될 수있다. 이 문서의 TDS 소수성 코어에 이황 가교 (도 1)을 도입함으로써 가역적 가교 미셀 약물 전달체의 제조를위한 손쉬운 프로토콜을 제공한다.

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Protocol

윤리 문 : 여성 무 흉선 누드 마우스 (민 / 뉴 주) 6-8 주령은 구입 후 AAALAC 지침에 따라 무균 상태에서 보관하고 실험하기 전에 적어도 4 일 동안 순응시켰다되었다. 모든 동물 실험은 기관의 지침에 따라 수행 캘리포니아 데이비스 대학의 동물 사용 및 관리 관리 자문위원회에 의해 승인 된 프로토콜 번호 07-13119 호 및 제 09-15584에 따라되었다.

TD PEG 5K -Cys 1. 합성 4 -Ebes 8 -CA (8)

  1. 둥근 바닥 플라스크에, 얼음에 무수 디메틸 포름 아미드 (DMF) 및 냉기의 10 ~ 20 ml의 MEO-PEG 5K -NH 2 (2g, 0.4 밀리몰)을 녹인다.
  2. 유리 비이커에 3 당량을 용해. 1- 히드 록시 -6- 클로로 - 벤조 트리아 졸, 벤조 트리아 졸 (HOBt), 3 당량의. N의 N '이소 프로필 카보 다이이 미드 (DIC), 3 당량. 무수 D에서의 (FMOC) 2리스-OHMF (10-15 mL)을 첨가 하였다. 자기 볶음 접시에 15 ~ 20 분 동안 교반한다.
  3. 메오 5K-PEG -NH 2. 얼음 욕을 제거하고 실온에서 밤새 반응 혼합물을 교반 함유하는 반응 플라스크에 혼합물을 추가한다.
  4. 박막 크로마토 그래피 (TLC) 16 카이저 테스트 (17), 반응의 완료를 확인 (황색 무연 NH 2의 부재를 나타낸다). 반응 플라스크에 빙냉 에테르 약 200 ml에 첨가하여 중합체 생성물 1 (MEO 5K-PEG -Lys (NH-FMOC)를 2) 침전물. 원심 분리를 통해 침전 된 폴리머 (6 6,000 XG에 분, 4 ° C)를 분리합니다.
    1. TLC를 수행 실리카겔 코팅 TLC 플레이트 상에 시료를 발견. 디클로로 메탄 / 메탄올을 사용하여 (9 : 1)을 이동상으로서. TLC 판을 개발 한 후 UV 램프 아래 지점을 관찰한다. 하나는 핫 플레이트 아민 반점을 가시화 염색 시약을 닌히 드린 사용할 수있다.
    2. 카이에 대한산이의 테스트는, 카이저의 시약을 포함하는 유리 튜브의 샘플을 조금 넣습니다. 5 분 동안 100 ℃에서 가열 한 상기 색상 변화 (용액의 색이 노란색 남아있는 경우, 다음 반응이 완료 될 때)을 찾는다.
  5. 무수 DMF (10-20 mL) 중의 생성물을 재용 해하고, 침전 및 원심 분리를한다 (단계 1.4 참조)를 반복한다.
  6. 다음 반복 단계 1.5 및 빙냉 에테르 중합체 침전물을 세 번 세척 하였다.
  7. 깨끗한 반응 플라스크에 폴리머 석출 한 전송 잔류 에테르를 제거 고진공 소스로 플라스크를 연결한다.
  8. 준비하고 20 %의 약 20 ~ 30 ml에 추가 (v / v)의 DMF 4 메틸 피 1 중간을 중합체. 완전히 용해 될 때까지 저어. 3 시간 동안 반응을 실행합니다.
  9. TLC 16 수행하고 황제의 시험 (청색 무료 NH 2의 존재를 확인) (17) (단계 1.4 참조) completio을 확인합니다반응 없음. 반응이 완료되면 제품 1 (1.4-1.6 단계)에 대해 언급 한 바와 같이, 에테르 침전를 진행합니다.
  10. 고분자 제품 2 (MEO-PEG 5K -Lys (NH 2) 2) 진공에서 건조.
  11. (1.1-1.7 단계) 제품 3을 생성하는 중간 2 상 (FMOC) 2리스-OH 결합 하나 더 라운드를 수행 (MEO-PEG 5K -Lys (리스 (NH-FMOC) 2) 2). (1.8-1.10 단계)를 FMOC 그룹 (4, MEO-PEG 5K -Lys (리스 (NH 2) 2) 2) 커플 (FMOC)리스 (BOC) (1.1-1.7 단계) -OH로 드 보호 3 세대 수지상 폴리 라이신 생성 (5, MEO-PEG 5K -Lys-리스 2 - ((FMOC)리스 (BOC)) 4) PEG 사슬의 한쪽 끝에서 네 BOC 및 FMOC 그룹이 종료되었습니다.
  12. 반응 플라스크에 중간체 얻어진 중합체 5 옮긴다. 에서와 같이디클로로 메탄 (DCM)에서 1 (v / v)의 트리 플루오로 아세트산 (TFA) : eparate 반응 플라스크 1을 준비합니다. 폴리머 (5) 중간에 1 TFA / DCM (v / v)의 혼합물 : 1의 15 ~ 20 ML을 추가합니다. 중합체가 완전히 용해 될 때까지 혼합물을 교반한다. 추가로 3 시간 동안 교반한다.
  13. TLC 16 카이저의 수행 및 시험 반응 종료를 확인하기 위해도 17의 (단계 1.4 참조) (청색 무연 NH (2)의 존재를 확인한다). 반응이 완료되면 점성 용액이 얻어 질 때까지 공기와 중합체 인 TFA / DCM 혼합물을 증발시켰다. 제품 1 (1.4-1.6 단계)에 대해 언급 한 바와 같이, 에테르 침전를 진행합니다. 진공에서 - (((FMOC)리스 (NH 2)) 4 -Lys-리스 2 MEO-PEG 5K) 고분자 제품 (6)을 건조.
  14. 반응 플라스크에 6 중간 전사 중합체. 8 당량을 포함하는 무수 DMF의 약 40 ml를 사용합니다. N의 N의 -diisopropylethylami네브라스카 (DIEA)는 폴리머 (6) 중간을 용해한다. 유리 비이커에, 12 당량을 용해. 의 HOBt, 12 당량. DIC, 12 당량의. 무수 DMF의 20 ~ 25 ml의의의 (FMOC) 시스테인 (트리트) -OH. 10 ~ 15 분 동안 진탕 한 후 (6)을 함유하는 반응 플라스크에 반응 혼합물을 추가한다. 밤새 반응을 실행합니다.
  15. TLC (16)와 카이저의 시험과 반응의 완료를 확인합니다 (단계 1.4 참조; 황색 무료 NH 2의 부재를 나타내는) 17. ((FMOC) 라이신 - - ((FMOC) Cys 또는 반응이 완료되면 제품 1 (단계 1.4-1.6)에 대해 언급 된 바와 같이, 제품 7 (MEO 5K-PEG -Lys-리스 2 분리, 에테르 침전 진행 (트리트))) 4.
  16. 제품 8 얻기 위해, 단계 1.8에 설명 된대로, 7 FMOC 탈 보호를 수행합니다 (- (리스 (NH 2) - PEG 5K -Lys-리스 2 (시스테인 (NH 2) (트리트을))) 4). 커플 (FMOC) -PEG 2 -Suc-OH ( "Ebes"링커, 24 당량.)를의 HOBt에 대해 위에서 설명 된 절차를 사용하여 중간 고분자 / DIC 매개 커플 링에 중간 9 (MEO-PEG 5K -Lys-리스 2 -Lys 4 얻기 - (시스테인 (트리트을) ) 4 (Ebes (NH-FMOC)) 8).
  17. 중간 10 얻을 수 FMOC 탈 보호 한 번 더 라운드 (1.6-1.8 단계) 수행 (MEO-PEG 5K -Lys-리스를 2 -Lys 4 - (시스테인 (트리트)) 4 (Ebes (NH 2)) 8).
  18. 반응 플라스크에 폴리머 중간층 (10)을 전송하고 용해 무수 DMF (30-40 ml)로 추가한다. 또 다른 반응 플라스크에서 24 당량을 용해. 무수 DMF에 (이전에 게시 된 절차에 따라 제조) CAOSu (20 ~ 30 ㎖) 18. 48 당량을 추가합니다. 및 N, N- 디 이소 프로필 에틸 아민으로는 10 ~ 15 분 동안 교반 할 수 있습니다. 10을 함유하는 반응 플라스크에 콘텐츠를 전송하고, 반응 런 O하자vernight.
  19. TLC 16 카이저의 테스트로 반응 종료를 확인하고 (단계 1.4 참조, 황색 무연 NH 2의 부재를 나타내는) 17. (Cys이고 (트리트)) 4 -Ebes - 반응이 완료되면 제품 1 (1.4-1.6 단계) 제품 (11)을 분리 (MEO 5K-PEG -Lys-리스 2 -Lys 4 바와 같이, 에테르 침전 진행 8 -CA 8). 탈 이온수를 투석하고, 백색 분말을 수득 샘플을 동결 건조.
  20. 반응 플라스크에 중간 폴리머 (11)를 놓습니다. 준비하고 고분자 용액에 TFA / 1,2- 에탄 (EDT) / 트리 에틸 실란 (TIS)의 20 ㎖ / H 2 O (94 / 2.5 / 1 / 2.5, v / v)의 혼합물을 추가합니다. 완전히 용해 될 때까지 혼합물을 저어. 4 시간 동안 반응을 실행합니다. TLC (16)에 의해 반응 종료를 확인한다.
  21. 흄 후드 아래에 공기를 불어 폴리머 TFA / EDT / TIS / H 2용액까지 O 혼합물의 점성이된다. 제품 1 (1.4-1.6 단계)에 대해 언급 한 바와 같이 최종 제품, 12 (PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8)를 분리, 에테르 침전를 진행합니다. 아세토 니트릴에 용해하고, 백색 분말을 수득하여 동결 건조.

PTX로드 미셀 2. 준비

  1. 표준 증착 방법을 사용하여 PTX로드 PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 미셀을 준비합니다.
    1. 클로로포름 1 ㎖ (클로로포름)에서 PTX의 다른 양 (1-9 mg)을 함께 TD 20 mg을 녹이고. 균질 건조한 중합체 필름을 수득하는 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거한다. 필요한 경우 약물로드 미셀의 형성을 허용하도록, 40 kHz에서 30 분 동안 초음파 처리 하였다 와류에 의한 인산 완충 용액 (PBS) 1 ㎖로 필름을 재구성한다.
    2. 3 %의 (w / w) H 2 O 2 (1 당량 6 μl를 추가합니다. 호텔 fr하기TD를에 티올기를 산화) 티올기를 EE. 엘만 (Ellman) 테스트 (19)에 의해 지시 된 바와 같이 유리 티올 그룹의 레벨이 일정하게 낮은 값으로 유지되면 추가 특성에 대한 미셀 솔루션을 사용합니다.
    3. 샘플을 살균 할 수있는 0.22 μm의 필터 솔루션을 필터링합니다. 9 번 아세토 니트릴을 첨가하고, 초음파 처리를 10 분간 수행하여 미셀의 약물 방출 후 HPLC 시스템 (20)의 미셀에로드 된 약물의 양을 분석한다. 이동상으로 아세토 니트릴 / 물 HPLC의 C18 컬럼을 사용합니다.
    4. HPLC로 면적 값과 11 표준 약물 농도의 검량선에 따라 약물 로딩을 계산한다.
      주 : 적재 효율이 초기 약물 함량 미셀에로드 약물의 비율로 정의된다.

미셀 3 요소 특성 분석

  1. 제 m의 크기 및 크기 분포를 측정동적 광산란 (DLS) 악기 (29)와 icelles. 실온에서 측정을 수행하고 ㎖ / 1 밀리그램의 미셀 농도를 유지한다.
    주 : 입자 크기 분석을 수행 빈으로 PBS를 사용하고 실제 샘플 입자 크기를 기록한다. 샘플에 대한 세중의 측정을하고 측정 값을 평균.
  2. 이전에 13,21 바와 같이, 이전과 소수성 형광 프로브로 피렌와 가교 후 PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA (8)의 임계 미셀 농도 (CMC)을 측정하는 형광 스펙트럼을 사용합니다.
    참고 : 일반적으로, 미셀 농도는 5 × 10-7 5 × 10 -4 M. 범위

또는 환원제없이 SDS에서 미셀 4. 안정성

  1. 소듐 도데 실 설페이트 스톡 용액 (SDS) 용액 (7.5 ㎎ / ㎖) 및 PBS에서 이황화 가교 미셀 (1.5 ㎎ / ㎖)을 준비한다. 다음, U를최종 SDS 농도로 된 혼합 용액을 상기 원액을 2.5 ㎖의 노래 밀리그램 / 및 미셀 농도가 1.0 ㎎ / ㎖이다.
  2. 또는 10 mM의 글루타치온 (GSH)의 존재없이 소정의 시간 간격으로 미셀 용액 (단계 3.1에서 언급 한 바와 같이) 크기 및 크기 분포를 측정한다.

5. 용혈 분석

  1. 로부터 수집 이전에 발행 절차 (11)와 누드 마우스에서 신선한 구연산 혈액을 사용하여 PTX-로드 가교 미셀 (PTX-된 DCM)에 따라 제조 PTX-로드, 비 가교 미셀 (PTX-NCMs)의 용혈성 잠재력을 평가 꼬리 베일.
    1. 2 %의 최종 농도로 PBS로 세포 펠렛을 다시 정지 후, 10 분간 1,000 XG에서 혈액 샘플 (1.0 mL)을 원심 분리하여 적혈구를 모아서 PBS로 세 번 세척하고.
  2. 서로 다른 농도 (0.2 및 1.0 적혈구 현탁액 200 μl를 혼합mg의 PTX-NCMs 및 PTX-된 DCM,의 / ㎖)을 각각 및 인큐베이터 통에 37 ° C에서 4 시간 동안 배양한다.
  3. 5 분 동안 3,000 XG에서 미셀 적혈구 혼합물을 원심 분리기. 96 웰 플레이트의 모든 샘플의 상등액 100 ㎕를 옮긴다. 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 540 nm에서 상층 액의 헤모글로빈의 흡광도를 측정한다.
    주 : 트리톤-100 (2 %) 및 PBS와 함께 배양 된 RBC를 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용하여야한다. 적혈구의 퍼센트 용혈는 다음과 같은 공식으로 계산된다 적혈구 용혈 = (OD 샘플 - OD 대조군) / (OD 양성 대조군 - OD 대조군) × 100 %입니다.

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Representative Results

약물로드, 이황화 가교 미셀의 제조 및 특성

양친 매성 고분자 5K PEG -Cys -Ebes 4 8 8 -CA 암 약물 전달 디설파이드 가교 미셀 시스템을 형성 할 수있는 수지상 중합체. 구조적으로, 이는 분지 된 폴리 (라이신 시스테인 Ebes) 백본을 통해 선형 PEG 분자 (친수성 도메인 분자량 5K)의 일단에 연결된 콜릭 산 (소수성 도메인)의 수지상 올리고머로서 정의된다. 다른보고 미셀 시스템을 통해 이러한 블록 공중 합체를 사용하여 여러 가지 이점이있다. 첫째, 용이 단계적 용액 상 축합 반응을 통해 합성 될 수있다. 둘째, 잘 확립 된 용액 상 펩티드 단계적 FMOC 화학을 통해 제조 된 몇몇 다른보고 된 양친 성 중합체, 티올 중합체 시스템에 비해, 잘 정의 된 구조물의 있습니다레. 이 동결 건조 된 분말 형태로 저장되고 확장 된 수명을 보유 할 수있다.

몇 가지 기술은 최종 제품의 특성을 이용할 수있다. TD 부착 콜산의 양은 1 H NMR 스펙트럼에 콜산의 세 메틸기에서에게 PEG의 양성자의 신호 비를 비교함으로써 검출 될 수있다. TD를의 분자량은 MALDI-TOF 질량 분석 및 겔 투과 크로마토 그래피 (GPC)에 의해 확인 될 수있다. 엘만 (Ellman) 정량 시험 분자 당 존재하는 자유 시스테인 잔기의 수를 해독하는데 사용될 수있다.

PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 수성 미디어에서 미셀을 형성하는 자기 조립 할 수 있습니다. 표준 용매 증발 법 등 PTX 및 빈 크리스틴과 같은 소수성 약물의 다양한 사용하여 성공적 미셀 13,22 캡슐화되었다. OxygEN는 이전 5K PEG -Cys 4 -Ebes 8 -CA (8)의 유리 티올기를 산화 인트라 미셀 이황화 가교 결합을 형성하는데 이용되었다. 엘만 (Ellman) 시험에 의해 모니터링 된 바와 같이, 다이 설파이드 결합을 위해 유리 티올 기의 전화율은 산화 후 48 시간 후 85 %에 달했다. AH 2 O 2 - 매개 산화는 최근 또 다른 방법으로 사용 하였다. 전환율은 이전의 방법보다 96 배 빠른 속도로 30 분이었다 (도 2)의 88 %에 달했다. PTX로드 오십 g는 이황화 가교 나노 입자가 성공적으로 더 효율적인 접근 방법 (도 3)를 사용하여 제조되었다. 입자 크기는 좁은 크기 분포 (도 3)와, 주위에 27 nm였다. 약물 적재 효율은 4.0 ㎎ / ㎖의 PTX로드와 100 %에 접근했다. 이황화 가교는 CMC 값에 큰 영향을 미쳤다. 부족 표준 TD PEG 5K -CA 8 비교이황화 결합은 가교 TD 관찰 된 CMC 값의 10 배 감소 (0.67 μM 대 5.53 μM) 13을 나타내었다.

안정성 연구

우리는 더 심한 미셀 방해 조건으로부터 PTX로드, 이황화 가교 미셀의 안정성을 조사 하였다. 소듐 도데 실 설페이트 (SDS)를 효율적 고분자 미셀을 분해 수 일상적 미셀의 안정성을 평가하기 위해 사용되는 강한 이온 성 세제이다. 약물 - 로딩 디설파이드 가교 미셀 (1.0 ㎎ / ㎖)의 안정성은 미셀을 방해 SDS (2.5 ㎎ / ㎖)의 존재 하에서 DLS로 모니터링 하였다. 미셀의 입자 크기는 (도 4의 왼쪽 패널) 등의 가교 미셀 그대로 남아 있음을 나타내는 시간에 걸쳐 꾸준히 유지되었다. 환원 조건 THER 소수성 코어에 이황화 결합을 절단 예상eby 불안정에 민감한 미셀을. 글루타티온 (GSH)을 환원제 내인성 종종 이러한 연구에 사용된다. 세포 외 수준 (2 μm의 대 10mm)에 비해 GSH의 세포 내 수준에서 뚜렷한 대조가있다. 농도의 차이는 종종 자극 응답 시스템을 생성하는 데 사용된다. 세포 내 농도 (10mm) 23 GSH를 첨가 한 후, 약물 - 로딩 디설파이드 가교 미셀의 크기는 30 분 동안 그대로 남아 있었다. 그들은 갑자기 이황화 결합, 미셀 (그림 4, 오른쪽 패널)의 신속한 분리의 전제 조건의 중요한 수의 감소를 의미, 1 나노 미터로 감소. 반대로, 시스템 (데이타 미기재) GSH의 세포 외 농도의 존재 하에서 안정적이었다.

용혈 연구

그림5 또는 이황화 가교없이 PTX로드 미셀의 관찰 용혈 활성의 차이를 나타낸다. 혈류에서 이러한 입자를 관리 할 때 그들의 치료 이점을 저해 혈액 세포의 용혈은 피해야한다. Hemato 호환성은 지질을 용해하거나 세포막의 파열로 이어지는 인지질 세포막에 끼어있는 잠재력을 가지고있는 양친 TDs를 같은 고분자 계 약물 담체의 생체 응용에 매우 중요하다. 도 5에 도시 된 바와 같이, PTX-NCMs 0.2 mg 내지 증가 PTX-NCMs의 농도가 14.2 %로 8.1 %에서 증가 용혈의 백분율 (RBC) 용해 수, 용량 의존적 적혈구가 나타났다 / 1.0 ㎎ / ㎖로 용액. 그러나 PTX-된 DCM 이황화 가교 결합이 동일 실험 조건에서 적혈구의 용혈 관측 활동 (<1.0 %)을 나타내지 않았다. hemolys의 차이추세는 양친 TDS 파일을 형성하기 위해 해리로부터 PTX-된 DCM을 방지 소수성 코어에 존재하는 내부 미셀 디설파이드 브릿지에 기인 할 수있다.

그림 1
그림 1 : 가교 미셀을 형성하는 단계. 자기 조립 후에 5K PEG 티올 telodendrimer -Cys 4 -Ebes 8 -CA (8)의 산화에 의해 형성되는 디설파이드 가교 미셀의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
도 2 : 가교 미셀 형성 산화법. t의 전환율그 TDS 농도에서 그룹이 두 산화법위한 산화 시간의 함수로서 결합 디설파이드 티올. 미셀의 총 농도가 20 ㎎ / ㎖로 유지 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
도 3 : 약물로드 가교 미셀. 왼쪽 패널 : PTX로드, 이황화 가교 미셀의 배치의 사진. 스케일 바 : 1 인치. 오른쪽 패널 : 입자 직경, 동적 광산란 (DLS)에 의해 측정. 미셀의 총 농도가 20 ㎎ / ㎖로 유지 하였다. PTX의 로딩 ㎖ / 4 mg을했다. 입자 크기 데이터는 3 회 측정에 기초하여 ± SD 평균 입자 크기로 나타내었다. SD : 표준 편차는 측정 된 입자 크기 분포의 폭을 설명한다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : 안정성 연구. DLS 의해 측정 (왼쪽) 또는없이 (오른쪽) GSH (10 mM)을 2.5 ㎎ / ㎖ SDS의 존재 PTX로드, 이황화 가교 미셀의 입자 크기. 입자 크기 데이터는 3 회 측정에 기초하여 ± SD 평균 입자 크기로 나타내었다. SD : 표준 편차는 측정 된 입자 크기 분포의 폭을 설명한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 : 용혈 분석. 적혈구에 비가 교 미셀 비교 PTX로드, 이황화 가교 미셀의 생체 외 용혈성 활동 (적혈구). 트리톤-100 (2 %) 및 PBS는 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용 하였다. 보고 된 값은 배수로 샘플들의 평균 ± SD이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

여러 가지 나노 입자는 약물 전달에 잠재적 인 사용을 위해 조사되었다. 리포좀 독소루비신과 파클리탁셀 (PTX)는 인간 혈청 알부민 나노 집계가 암 치료에 대한 FDA의 승인을 nanotherapeutics 중입니다 -loaded. 임상 적 효과가 있지만, 그러나, 이러한 nanotherapeutics 모두는 상대적으로 크기가 "큰"이며, 그들은 간과 폐에 축적되는 경향이있다. 상대적으로 작은 입자 크기와 높은 약물 적재 용량 고분자 미셀 약물 전달을위한 nanocarriers을 부상하고있다. 고유 한 코어 - 쉘 구조의 '용해'물리적 캡슐화 수성 조건 하에서 소수성 약물 분자. 약물 봉입 긴 저장 수명 및 높은 효율을 갖는 연구실 형태 단 분산 나노 입자 제조 TDs를 잘 정의 된 (10 내지 50 nm의 입자 지름)으로 구성된 고분자 미셀. 강인한 TD 플랫폼의 많은 장점 중 하나는 고분자의 다양성이다.많은 약물, 형광 염료 및 타겟팅 리간드 용이 TD 13,15,24 플랫폼으로 통합 될 수있다.

프로토콜 내에서 중요한 단계

우리는 27 나노 미터 주위에 입자 크기가 잘 정의 PTX 배달을위한 강력한 가역적 디설파이드 가교 미셀 시스템을 개발 및 좁은 크기 분포를 갖고있다. TDS 농도가 단계적 용액 상 펩티드 화학을 통해 합성 하였다. 이들의 TDS의 잘 정의 된 화학 구조는, 원하는 특성을 갖는 나노 입자를 생성하는 중요한 요인이다. 따라서, TLC 카이저의 테스트로 반응 종료를 확인하는 것은 매우 중요하다. 가 H 2 O 2 산화는 TD의 티올 기 크게 미셀의 안정성을 향상되는 디설파이드 가교를 형성하기 위해 산화된다 중요한 단계이다. 이전 산소계 산화법에 비해, H 2 O 2 -기초 산화 방법에 따라서 짧은 기간에 가교 미셀을 제공하는 96 배 더 빠르다. 또한, GSH, 티올 - 함유 트리 펩타이드는 세포에 의해 생성 중요한 항산화 제이며, 유리 라디칼 및 반응성 산소 화합물을 청소하는 데 중요한 역할을한다. 그것은 세포의 산화 환원 항상성을 유지함으로써 큰 ​​기여를한다. GSH의 세포 농도는 약물 설계의 흥미로운 특징이다. GSH의 세포 내 농도는 지금 단단히 세포 외 농도 25 (2 μM, 각각 대 10 밀리미터)보다 훨씬 높게 설정됩니다. 더 중요한 것은, 상승 된 세포 내 GSH 수준은 종종 많은 약제 내성 인간과 쥐의 종양 세포 (26)에보고되었다. GSH의 높은 세포 내 분포, 약물 페이로드의 방출 및 축적 미셀과 결과의 이황화 가교 결합의 파단을 용이하게한다. 이황화 가교 결합 된 나노 입자는SDS의 존재 하에서 안정한. 그러나, GSH가 풍부한 세포 내 환경함으로써 시스템을 불안정, 디설파이드 결합을 분해하여 약물의 방출을 트리거합니다. 중합체 유도 된 용혈은 적혈구 세포와 같은 혈액 성분과 고분자 미셀의 유해한 상호 작용에 기인. 가교 미셀 비 - 가교 된 유사체와 비교하여 훨씬 적은 용혈을 보였다.

수정 및 문제 해결

이전에보고 된, 산소 기반 방법 (13)에 비교할 때, 산화제로서 H 2 O 2를 이용하면보다 효율적 이황화 가교 결합 형성을 허용한다. H 2 O 2 물 높고 저렴한 가용성 인 몇몇 다른 공지 된 산화제 (예를 들어, 크롬산이나 과망간산)에 비해 높은 품질의 제품을 제공하는 강력한 산화제 (27)이다. 그러나, 산화 시간 furthe해야 할 수도(R)은 합성의 스케일에 기초하여 최적화.

기술의 한계

H 2 O 2는 강한 산화제이다. H 2 O 2의 낮은 농도는 이황화 가교 결합 형성을 수행하기 위해 사용되는 경우에도주의가 바람직하지 않은 약물 열화를 방지하는 "산화 성"약물 적재 TDs를 함께 사용할 때 수행되어야한다.

기존 / 대체 방법에 대하여 기술의 중요성

설명이 기술은 쉽게 표준 실험실에서 복제 할 수있는 쉬운 실험 장치이다. 예를 들어, 표준 증착법을 이용하여 약물 로딩은 투석 방법과 비교하여 섭취하는 짧은 시간이다. 산화제로서 H 2 O 2를 사용하여 코어의 다이 설파이드 형성은 빠르게 oxyg 이용한 산화 이전에보고 된 방법보다 96 배13 갖추고 있습니다. 약물 적재 단계 재현성 쉽게 입도 (DLS 방법)과 약물 함량 (HPLC)를 측정함으로써 평가할 수있다.

이 기술을 마스터 한 후 미래의 응용 프로그램 또는 방향

소분자 약물에 비해 필요로하는 주요 장애물 중 하나는 주요 암 치료 설정 생산을 28 배율의 기술적 인 과제를 입력 할 수있는 나노 의학 전에 극복되어야한다. 이것은 새롭게 개발 된 기술을 습득 한 후, 하나는 쉽게 대규모 디설파이드 가교 미셀을 합성 할 수있다. 이것은 인간의 환자에서이 나노 제제의 임상 연구에 매우 바람직하다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
MeO-PEG5K-NH2 Rapp Polymere 125000-2
Fmoc-Lys(Fmoc)-OH Aaptec AFK107
Fmoc-Lys(Boc)-OH Anaspec AS-20132
Fmoc-Cys(Trt)-OH Aapptec AAC105
Dimethylformamide Fisher Scientific BP1160-4
Ethyl ether Fisher Scientific E134-20
N,N-Diisopropylethylamine Sigma Aldrich D125806
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich T6508 Corrosive, handle with care
4-methyl piperidine Alfa-Aesar L-02709
Ebes linker Anaspec AS-61924
Cholic acid Sigma Aldrich C1129
1,2-Ethanedithiol Sigma Aldrich 02390 Handle inside fume hood. Bleach gloves after usage.
Triisopropylsilane Sigma Aldrich 233781
Chloroform (anhydrous) Sigma Aldrich 288306
Hydrogen peroxide solution 30% Aaron Industries NA
HoBt-Cl Aaptec CXZ096
DIC Sigma Aldrich D125407
Female athymic nude mice (Nu/Nu strain), 6–8 weeks age Harlan (Livermore, CA)

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References

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생화학 호 118 나노 입자 약물 전달 미셀 telodendrimer 이황화 가교 과산화수소 - 매개 산화
가역 디설파이드 가교 미셀 제조를위한 손쉬운 효율적인 접근법
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Li, Y., Bharadwaj, G., Lee, J. S. A… More

Li, Y., Bharadwaj, G., Lee, J. S. A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles. J. Vis. Exp. (118), e54722, doi:10.3791/54722 (2016).

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