Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En Facile og effektiv tilgang til fremkaldelse af reversibel disulfid Cross-forbundne Miceller

Published: December 23, 2016 doi: 10.3791/54722
Automatic Translation
1,2, 1, 3
1Department of Biochemistry & Molecular Medicine, University of California, Davis, 2UC Davis Comprehensive Cancer Center, University of California, Davis, 3Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of California, Davis

Abstract

Nanomedicin er en ny form for terapi, der udnytter de unikke egenskaber af partikler, der er nanometer i skala til biomedicinsk anvendelse. Bedre drug delivery for at maksimere terapeutiske resultater og reducere lægemiddelrelaterede bivirkninger er nogle af hjørnestenene i nutidens nanomedicin. Nanopartikler i særdeleshed har fundet en bred anvendelse i kræftbehandling. Nanopartikler, der tilbyder en høj grad af fleksibilitet i design, ansøgning, og produktion baseret på tumor mikromiljø forventes at være mere effektiv med hurtig oversættelse til klinisk praksis. Den polymere micellære nano-luftfartsselskab er et populært valg for drug delivery applikationer.

I denne artikel beskriver vi en enkel og effektiv protokol til syntese læqemiddelladede, disulfid cross-linked miceller baseret på selv-samling af en veldefineret amphiphile lineær-dendritiske copolymer (telodendrimer, TD). TD er sammensat af polyethylen glycol (PEG) som den hydrofile segment og et thioleret cholsyre klynge som kernedannende hydrofob del bundet trinvis til en amin-termineret PEG hjælp opløsning-baserede peptidkemi. Kemoterapi narkotika, såsom paclitaxel (PTX), kan indlæses ved hjælp af en standard opløsningsmiddelafdampningsfremgangsmåden. O 2 medieret oxidation er tidligere anvendes til at danne intra-micellære disulfid-tværbindinger fra frie thiolgrupper på TDs. Imidlertid har reaktionen var langsom og ikke muligt for storskalaproduktion. For nylig blev en H 2 O 2 medieret oxidation metode udforsket som en mere gennemførlig og effektiv tilgang, og det var 96 gange hurtigere end den tidligere rapporterede metode. Under anvendelse af denne fremgangsmåde, har 50 g PTX-fyldte, disulfid tværbundne nanopartikler blevet fremstillet med snæver partikelstørrelsesfordeling og høj lægemiddelfyldning effektivitet. Stabiliteten af ​​den resulterende micelle opløsning analyseres ved hjælp af forstyrrende tilstande, såsom co-inkubering wed et detergent, natriumdodecylsulfat, med eller uden et reduktionsmiddel. De læqemiddelladede, disulfid tværbundne miceller viste mindre hæmolytisk aktivitet sammenlignet med deres ikke-tværbundne modstykker.

Introduction

Nanoteknologi er en hurtigt voksende felt, der har nydt en række biomedicinske områder 1. Nanopartikler giver muligheder for at designe og tuning egenskaber, der ikke er muligt med andre typer af konventionelle terapeutiske midler. Nano-bærere øge stabiliteten af lægemidler mod biologisk nedbrydning, forlænge narkotika cirkulation tid, overvinde narkotika opløselighed problemer, og kan finjusteres til målrettet drug delivery og co-leverer billeddannende midler 1,2. Nanopartikler-baserede administrationssystemer holder løfte i kræft billeddannelse og behandling. Tumor vaskulaturerne er utæt for makromolekyler og kan føre til en privilegeret ophobning af cirkulerende nanopartikler ved tumor-sites via forbedrede permeabilitet og fastholdelse (EPR) effekt 3. Blandt de mange nano-bærere (f.eks liposomer, hydrogeler og polymere miceller), der er ved at blive aktivt forfølges som bærere for anti-cancer medicin, har polymere miceller vundet bred popularitet i løbet af the sidste årti 4,5.

Polymermiceller er en termodynamisk system, på intravenøs administration, potentielt kan fortyndes under den kritiske micellekoncentration (CMC), fører til deres dissociation i unimerer. Krydsbinding strategier er blevet anvendt til at minimere micellar dissociation i unimerer. Imidlertid kan overdrevent stabiliserede miceller forhindre lægemidlet i at frigive på målstederne og reducerer derved den samlede terapeutiske virkning. Adskillige kemiske fremgangsmåder er blevet udforsket for at gøre den tværbindende nedbrydelige som reaktion på redox eller på ydre stimuli, såsom reducerbare disulfidbindinger 6,7 og pH-spaltelig 8 eller hydrolyserbar esterbindinger 9,10.

Vi har tidligere rapporteret design og syntese af micellenanopartikler bestående af dendritiske cholsyre (CA) blokke og lineær polyethylenglycol (PEG) -copolymerer, benævnt telodendrimers (TD) 11-15 nK -CAy (hvor n = molekylvægt i kilodalton (K), y = antal cholsyre (CA) enheder). De er kendetegnet ved deres lille størrelse, lang holdbarhed og høj effektivitet i indkapsler lægemidler, såsom paclitaxel (PTX) og doxorubicin (DOX) i den hydrofobe kerne. Byggestenene i TD, såsom PEG, lysin og CA, er biokompatible, og tilstedeværelsen af ​​en PEG corona kan bibringe en "stealth" nanopartikel karakter, hindrer ikke-specifik optagelse af micellenanopartikler af det retikuloendoteliale system.

Thiolerede lineære-dendritiske polymerer kan let genereres ved at indføre cysteiner i den dendritiske oligo-lysin rygraden i vores standard TDs. Denne artikel præsenterer en let protokol for produktion af en reversibelt tværbundet micelle lægemiddelafgivelsessystem ved indføring disulfid tværbindinger i den hydrofobe kerne af TDs (figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik erklæring: Kvinde atymiske nøgne mus (nu / nu-stammen), 6-8 uger gamle, blev købt og derefter holdt under patogenfrie betingelser i henhold til AAALAC retningslinjer og fik lov til at akklimatisere i mindst 4 dage før nogen eksperimenter. Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer og i henhold til protokol nr 07-13119 og nr 09-15584, godkendt af Animal brug og pleje Administrative rådgivende udvalg på University of California, Davis.

1. Syntese af TD PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8

  1. I en rundbundet kolbe, opløses MeO-PEG 5K -NH2 (2 g, 0,4 mmol) i 10-20 ml vandfrit dimethylformamid (DMF) og chill på is.
  2. I et bægerglas opløses 3 ækv. af 1-hydroxy-6-chlor-benzotriazol (HOBt), 3 ækv. N, N '-diisopropylcarbodiimide (DIC), og 3 ækv. af (Fmoc) 2 Lys-OH i vandfri DMF (10-15 ml). Omrør i 15-20 min på en magnetomrører.
  3. Tilsæt blandingen til reaktionskolben indeholdende MeO-PEG 5K -NH 2. Fjern isbad, og reaktionsblandingen omrøres natten over ved stuetemperatur.
  4. Bekræft afslutning af reaktionen med tyndtlagschromatografi (TLC) 16 og Kaiser test 17 (en gul farve indikerer fraværet af frit NH2). Udfælde polymere produkt 1 (MeO-PEG 5K-Lys (NH-Fmoc) 2) ved tilsætning af ca. 200 ml iskold ether til reaktionskolben. Adskil det udfældede polymer via centrifugering (6 min ved 6.000 xg og 4 ° C).
    1. For at udføre TLC, spot prøverne på silicagel-coatede TLC-plader. Brug dichlormethan / methanol (9: 1) som den mobile fase. Overhold pletter under en UV-lampe efter at have udviklet TLC-pladerne. Man kan også anvende ninhydrin farvningsreagens at visualisere amin pletter på en varmeplade.
    2. For Kaiser test, placere en lille smule af prøven i glasrør indeholdende Kaiser reagens. Opvarmningen ved 100 ° C i 5 minutter og se efter farveændringen (hvis farven af ​​opløsningen forbliver gul, hvorefter reaktionen er fuldstændig).
  5. Re-opløse produktet i vandfrit DMF (10-20 ml) og gentag udfældning og centrifugering (se trin 1.4).
  6. Gentag trin 1.5, og derefter vaske polymeren bundfaldet tre gange med iskold ether.
  7. Overfør polymeren bundfald 1 til en ren reaktionskolbe og kolben forbindes til en høj vakuumkilde til fjernelse af resterende ether.
  8. Forberede og tilsæt ca. 20-30 ml 20% (v / v) 4-methylpiperidin i DMF til polymer mellemprodukt 1. Omrør indtil fuldstændig opløsning. Udføre reaktionen i 3 timer.
  9. Udfør TLC 16 og Kaiser test (en blå farve bekræfter tilstedeværelsen af frie NH2) 17 (se trin 1.4) for at bekræfte completion af reaktionen. Hvis reaktionen er færdig, gå videre til æteren nedbør, som nævnt for produkt 1 (trin 1,4-1,6).
  10. Tør det polymere produkt 2 (MeO-PEG 5K-Lys (NH2) 2) under et vakuum.
  11. Udfør en runde mere af (Fmoc) 2 Lys-OH-kobling på mellemprodukt 2 (trin 1,1-1,7) til at generere produkt 3 (MeO-PEG 5K-Lys (Lys (NH-Fmoc) 2) 2). De-protect (trin 1,8-1,10) de Fmoc-grupper (4, MeO-PEG 5K-Lys (Lys (NH2) 2) 2) og par (trin 1,1-1,7) den (Fmoc) Lys (Boc) -OH til generere en tredje generation dendritiske polylysin (5, MeO-PEG 5k -Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys (Boc)) 4) termineret med fire Boc og Fmoc-grupper i den ene ende af PEG-kæden.
  12. Overfør den resulterende polymer mellemprodukt 5 til en reaktionskolbe. i såeparate reaktionskolbe, forberede 1: 1 (v / v) trifluoreddikesyre (TFA) i dichlormethan (DCM). Tilsættes 15-20 ml af en 1: 1-blanding TFA / DCM (v / v) til polymeren mellemprodukt 5. Omrør blandingen indtil polymeren er fuldstændig opløst. Der omrøres i yderligere 3 timer.
  13. Udfør TLC 16 og Kaiser test (en blå farve bekræfter tilstedeværelsen af frie NH2) 17 (se trin 1.4) for at bekræfte reaktionens afslutning. Hvis reaktionen er fuldstændig, afdampes polymer-i-TFA / DCM-blanding med luft, indtil der opnås en viskøs opløsning. Fortsæt til æteren nedbør, som nævnt for produkt 1 (trin 1,4-1,6). Tør det polymere produkt 6 (MeO-PEG 5k -Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys (NH2)) 4) under et vakuum.
  14. Transfer polymer mellemprodukt 6 i en reaktionskolbe. Bruge ca. 40 ml vandfrit DMF indeholdende 8 ækv. N, N -diisopropylethylamine (DIEA) at opløse polymeren mellemprodukt 6. I et bægerglas opløses 12 ækv. HOBt 12 ækv. af DIC, og 12 ækv. af (Fmoc) Cys (Trt) -OH i 20-25 ml vandfrit DMF. Ryst i 10-15 min, og tilsæt derefter reaktionsblandingen til reaktionskolben indeholdende 6. Udføre reaktionen natten over.
  15. Bekræft færdiggørelsen af reaktionen med TLC 16 og Kaiser test (se trin 1.4, en gul farve indikerer fraværet af frit NH2) 17. Hvis reaktionen er færdig, gå videre til æteren nedbør, som nævnt for produkt 1 (trin 1,4-1,6), for at isolere produktet 7 (MeO-PEG 5K -Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys - ((Fmoc) Cys (Trt))) 4.
  16. Udfør Fmoc de-beskyttelse på 7, som beskrevet i trin 1.8, til opnåelse af produktet 8 (PEG 5K -Lys-Lys 2 - (Lys (NH2) - (Cys (NH2) (Trt))) 4). Par (Fmoc) -PEG 2 -Suc-OH ( "Ebes" linker, 24 ækv.) På en polymer mellemprodukt under anvendelse af fremgangsmåden skitseret ovenfor for HOBt / DIC-medieret kobling til opnåelse mellemprodukt 9 (MeO-PEG 5K -Lys-Lys 2 -Lys 4 - (Cys (Trt) ) 4 (Ebes (NH-Fmoc)) 8).
  17. Udfør en runde mere af Fmoc afbeskyttelse (trin 1,6-1,8) for at få mellemprodukt 10 (MeO-PEG 5K -Lys-Lys 2 -Lys 4 - (Cys (Trt)) 4 (Ebes (NH2)) 8).
  18. Overfør polymeren mellemprodukt 10 i en reaktionskolbe og tilsæt vandfrit DMF (ca. 30-40 ml) for at opløse det. I en anden reaktion kolbe opløses 24 ækvivalenter. af CAOSu (fremstillet ifølge den tidligere offentliggjorte fremgangsmåde) i vandfrit DMF (20-30 ml) 18. Tilføj 48 ækv. N, N-diisopropylethylamin og lad det omrøre i 10-15 min. Overfør indholdet i reaktionskolben indeholdende 10 og lade reaktionen løbe overnight.
  19. Bekræft afslutning af reaktionen med TLC 16 og Kaiser test (se trin 1.4, en gul farve indikerer fraværet af frit NH2) 17. Hvis reaktionen er færdig, gå videre til æteren nedbør, som nævnt for produkt 1 (trin 1,4-1,6) for at isolere produktet 11 (MeO-PEG 5K -Lys-Lys 2-Lys 4 - (Cys (Trt)) 4 -Ebes 8 -CA 8). Dialysere det i deioniseret vand og lyofilisere prøven til opnåelse af et hvidt pulver.
  20. Placer polymeren mellemprodukt 11 i en reaktionskolbe. Forberede og der tilsættes 20 ml TFA / 1,2-ethandithiol (EDT) / triethylsilan (TIS) / H2O (94 / 2,5 / 1 / 2,5, vol / vol) blanding i polymeropløsningen. Omrør blandingen indtil fuldstændig opløsning. Udføre reaktionen i 4 timer. Bekræft færdiggørelsen af reaktionen ved TLC 16.
  21. Under stinkskabet, blæse luft ind i polymer-TFA / EDT / TIS / H2O-blanding, indtil opløsningen bliver tyktflydende. Fortsæt til etheren udfældning, som nævnt for produkt 1 (trin 1,4-1,6), til isolering af slutproduktet, 12 (PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8). Opløs det i acetonitril og den lyofiliseres til opnåelse af et hvidt pulver.

2. Fremstilling af PTX-fyldte Miceller

  1. Forbered en PTX-loaded PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 micelle hjælp standard fordampning metoden.
    1. Opløs 20 mg af TD med en forskellig mængde PTX (1-9 mg) i 1 ml chloroform (CHCl3). Fjern opløsningsmidlet under anvendelse af en rotationsfordamper til opnåelse af en homogen, tør polymerfilm. Rekonstituer filmen med 1 ml phosphatbufret saltvand (PBS) ved vortex, efterfulgt af lydbehandling i 30 minutter ved 40 kHz, hvis det er nødvendigt, for at tillade dannelsen af ​​lægemiddel fyldte miceller.
    2. Tilsæt 6 pi 3% (w / w) H 2 O 2 (1 ækv. FRee thiolgrupperne) at oxidere thiolgrupper på TD. Brug micelle opløsning til yderligere karakterisering, når niveauet af frie thiolgrupper forbliver i faste lave værdier, som angivet ved Ellman test 19.
    3. Opløsningen filtreres med et 0,22 um filter til at sterilisere prøven. Analyser mængden af lægemiddel der er lagt i micellerne på en HPLC 20 system efter frigivelse af lægemidler fra micellerne ved at tilsætte 9 gange acetonitril og udføre 10 min af sonikering. Brug en C18-søjle til HPLC med acetonitril / vand som den mobile fase.
    4. Beregn medikamentbelastning ifølge kalibreringskurven mellem HPLC area værdier og koncentrationer af lægemidlet standard 11.
      BEMÆRK: belastningseffektivitet er defineret som forholdet mellem lægemiddel fyldt i micellerne i den oprindelige lægemiddelindhold.

3. karakteriseringer af miceller

  1. Måle størrelsen og størrelsesfordelingen af ​​de micelles med et dynamisk lysspredning (DLS) instrument 29. Udfør målingerne ved stuetemperatur og holde micellekoncentration ved 1 mg / ml.
    BEMÆRK: For at udføre analyse af partikelstørrelse, bruge PBS som tom, og derefter optage partikelstørrelsen til egentlige prøver. Tag målingerne i tre eksemplarer for prøver, og derefter gennemsnittet af målinger.
  2. Brug fluorescensspektre at måle den kritiske micellekoncentration (CMC) af PEG-5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 før og efter krydsbinding med pyren som en hydrofob fluorescerende probe, som tidligere 13,21 beskrevet.
    BEMÆRK: Typisk micellekoncentration spænder fra 5 × 10 -7 til 5 × 10 -4 M.

4. Stabilitet af Miceller i SDS med eller uden reduktionsmidler

  1. Forbered stamopløsninger af natriumdodecylsulfat (SDS) opløsning (7,5 mg / ml) og disulfid tværbundne miceller (1,5 mg / ml) i PBS. Dernæst usynge stamopløsningerne, lave en opløsningsblanding, hvor den endelige SDS-koncentration er på 2,5 mg / ml, og micellekoncentration er på 1,0 mg / ml.
  2. Måle størrelsen og størrelsesfordelingen (som nævnt i trin 3.1) i micellen opløsningerne ved forudbestemte tidsintervaller med eller uden tilstedeværelse af 10 mM glutathion (GSH).

5. Hæmolyse Assay

  1. Evaluere den hæmolytiske potentiale PTX-loaded, ikke-tværbundne miceller (PTX-NMRS) fremstillet ifølge tidligere offentliggjorte fremgangsmåde 11 og PTX-fyldte tværbundne miceller (PTX-DCMS) under anvendelse frisk citreret blod fra nøgne mus indsamlet fra hale slør.
    1. Indsamle røde blodlegemer efter centrifugering af blodprøven (1,0 ml) ved 1000 x g i 10 minutter, vaske dem tre gange med PBS, og derefter genopslæmme cellepellets med PBS til en slutkoncentration på 2%.
  2. Bland 200 pi erythrocytsuspension med forskellige koncentrationer (0,2 og 1,0mg / ml) af PTX-NMRS og PTX-DCMS henholdsvis og inkuberes i 4 timer ved 37 ° C i en inkubator-ryster.
  3. Centrifuger micelle-erythrocyt-blandinger ved 3.000 x g i 5 min. Overfør 100 ul af supernatanten af ​​alle prøver til en 96-brønds plade. Mål absorbansen af ​​frit hæmoglobin i supernatanten ved 540 nm under anvendelse af en mikropladelæser.
    BEMÆRK: RBC'er inkuberet med Triton-100 (2%) og PBS skal anvendes som de positive og negative kontroller, henholdsvis. Den procentvise hæmolyse af de røde blodlegemer beregnes med følgende formel: RBC-hæmolyse = (OD prøve - OD negative kontrol) / (OD positiv kontrol - OD negative kontrol) x 100%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Forberedelse og karakterisering af Drug-loaded, disulfid Cross-forbundne Miceller

Amfifile polymer PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 er en dendritisk polymer stand til at danne en disulfid tværbundet micelle system til levering cancer drug. Strukturelt er det defineret som en dendritisk oligomer af cholsyrer (hydrofobe domæne) i tilknytning til den ene ende af den lineære PEG-molekyle (hydrofil domæne, molekylvægt 5K) gennem en forgrenet poly (lysin-cystein-Ebes) backbone. Der er flere fordele ved at bruge disse blokcopolymerer forhold til andre rapporterede micellære systemer. For det første kan det let syntetiseres via trinvise opløsning fase kondensationsreaktioner. Sekund, sammenlignet med flere andre rapporterede amfifile polymerer, det thiolerede polymersystem, fremstillet gennem veletableret opløsningsfase trinvis Fmoc peptidkemi, har en veldefineret struktre. Den kan opbevares i lyofiliseret pulverform og har en forlænget holdbarhed.

Flere teknikker kan anvendes til at karakterisere slutproduktet. Mængden af cholsyre knyttet til TD kan detekteres ved sammenligning af signalet forholdet protonerne på PEG til dem på de tre methylgrupper af cholsyre i 1H NMR-spektre. Molekylvægtene af TD kan bekræftes ved MALDI-TOF massespektrometri og gelpermeationskromatografi (GPC). Den kvantitative Ellman test kan anvendes til at dechifrere antallet af frie cysteinrester til stede pr molekyle.

PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 kan selvorganisere at danne miceller i vandige medier. Anvendelse af en standard opløsningsmiddelafdampningsfremgangsmåden, en række hydrofobe lægemidler, såsom PTX og vincristin, med succes er blevet indkapslet i micellerne 13,22. oxygOr er tidligere anvendt til at oxidere de frie thiolgrupper af PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 og til at danne intra-micellære disulfid tværbindinger. Som overvåges af Ellman test, den omregningskurs fra frie thiolgrupper at disulfidbindingerne nåede 85% efter 48 timers af oxidation. AH 2 O 2 medieret oxidation blev for nylig anvendt som en alternativ metode. Den omregningskurs nåede 88% i 30 minutter (figur 2), som var 96 gange hurtigere end den tidligere strategi. Halvtreds gram PTX-loaded, har disulfid tværbundne nanopartikler succes blevet fremstillet ved hjælp af denne mere effektiv tilgang (figur 3). Partikelstørrelsen var ca. 27 nm, med en snæver størrelsesfordeling (figur 3). Lægemidlet belastningseffektivitet nærmede 100% med PTX loading af 4,0 mg / ml. Disulfidtværbinding havde en dramatisk effekt på CMC-værdi. Sammenlignet med standard TD PEG 5K -CA 8, som manglerdisulfidbindinger, viste den tværbundne TD 10 gange fald i de observerede CMC-værdier (5,53 pM versus 0,67 uM) 13.

stabilitetsstudier

Vi undersøgt yderligere stabiliteten af ​​PTX-fyldte, disulfid tværbundne miceller mod alvorlig micelle forstyrrelser betingelser. Natriumdodecylsulfat (SDS) er en stærk ionisk detergent, der anvendes rutinemæssigt til vurdering micellær stabilitet, da den effektivt kan nedbryde polymere miceller. Stabiliteten af ​​læqemiddelladede, disulfid tværbundne miceller (1,0 mg / ml) blev overvåget ved DLS under tilstedeværelse af micellen forstyrrelser SDS (2,5 mg / ml). Partikelstørrelsen af micellerne forblev stabil over tid, hvilket indikerer, at sådanne tværbundne miceller forblev intakt (figur 4, venstre paneler). forventes reduktive betingelser til spaltning disulfidbindinger i den hydrofobe kerne, therEby gør miceller modtagelige for destabilisering. Glutathion (GSH), et endogent reduktionsmiddel, anvendes ofte til sådanne undersøgelser. Der er stærk kontrast i det intracellulære niveau af GSH i forhold til det ekstracellulære niveau (10 mm versus 2 um). Denne forskel i koncentrationer er ofte anvendt til at generere stimuli-responsive systemer. Efter tilsætning af GSH på en intracellulær koncentration (10 mm) 23, størrelsen af lægemiddel fyldte, disulfid tværbundne miceller forblev intakt i 30 min. De brat faldt til 1 nm, der betyder en reduktion af en kritisk antal disulfidbindinger, en forudsætning for den hurtige dissociation af micellerne (figur 4, højre panel). Tværtimod var stabil i nærvær af extracellulære koncentrationer af GSH systemet (data ikke vist).

hæmolyse Study

Figur5 viser forskelle i den observerede hæmolytiske aktivitet af PTX-fyldte miceller, med eller uden disulfidtværbinding. Hæmolyse af blodceller skal undgås ved administration af disse partikler i blodstrømmen, da det underminerer deres terapeutiske fordele. Hemato-kompatibilitet er meget afgørende for in vivo anvendelse af polymerbaserede lægemiddelbærere, såsom amfifile TDs, der har potentiale til at solubilisere lipider eller til at indsætte sig selv i phospholipidmembraner, der fører til sprængning af plasmamembraner. Som vist i figur 5, blev den PTX-NMRS sig at have en dosisafhængig røde blodlegemer (RBC) lysis Stillingen med procentdelen af hæmolyse stigende fra 8,1% til 14,2% som den koncentration af PTX-NMRS steg fra 0,2 mg / ml til 1,0 mg / ml. Imidlertid PTX-DCMS der har disulfidtværbinding viste ingen observerbare hæmolytiske aktiviteter (<1,0%) i RBC'erne under de samme forsøgsbetingelser. Denne forskel i hemolyser tendens kan tilskrives disulfidbroerne intra micelle stede på den hydrofobe kerne, som forhindrer PTX-DCMS fra dissociere til dannelse amfifile TDs.

figur 1
Figur 1: Skridt for at danne cross-linked miceller. Skematisk fremstilling af disulfid tværbundne miceller dannet ved oxidation af de thioleret telodendrimer PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 efter selvsamling. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Oxidation fremgangsmåder til tværbundet micelledannelse. Den omregningskurs af than thiolgrupper på TDS'et at disulfidbindinger som funktion af oxidation tid for de to oxidationsmetoder. Den samlede koncentration af micellerne blev holdt på 20 mg / ml. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Drug-loaded, tværbundet micelle. Venstre panel: et billede af en batch af PTX-loaded, disulfid krydsbundne miceller. Målestok: 1 tomme. Højre panel: partikelstørrelsen som bestemt ved dynamisk lysspredning (DLS). Den samlede koncentration af miceller blev holdt på 20 mg / ml. Lastningen af ​​PTX var 4 mg / ml. data partikelstørrelsen blev vist som den gennemsnitlige partikelstørrelse ± SD baseret på tre målinger. SD: standardafvigelse, beskriver bredden af ​​den målte partikelstørrelsesfordeling.Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: Stabilitet undersøgelse. Partikelstørrelsen af ​​PTX-fyldte, disulfid tværbundne miceller i nærvær af 2,5 mg / ml SDS uden (venstre) eller med (højre) GSH (10 mM), som målt ved DLS. data partikelstørrelsen blev vist som den gennemsnitlige partikelstørrelse ± SD baseret på tre målinger. SD: standardafvigelse, beskriver bredden af ​​den målte partikelstørrelsesfordeling. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5: Hæmolyse assay. In vitro hæmolytiske aktiviteter af PTX-fyldte, disulfid tværbundne miceller sammenlignet med ikke-tværbundne miceller på røde blodlegemer (RBC). Triton-100 (2%) og PBS blev anvendt som positive og negative kontroller, henholdsvis. De rapporterede værdier er gennemsnit ± SD af tredobbelte prøver. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Adskillige nanopartikler er blevet undersøgt for deres potentielle anvendelse i lægemiddeladministration. Liposomal doxorubicin og paclitaxel (PTX) -loaded humant serumalbumin nano-aggregater er blandt de nanotherapeutics godkendt af FDA til behandling af cancer. Selv om klinisk effektive, begge disse nanotherapeutics er relativt "store" i størrelse, og de har tendens til at ophobes i leveren og lungerne. Polymere miceller med relativt mindre partikelstørrelser og højere narkotika lastning kapacitet dukker nanocarriers til levering stof. Deres unikke kerne-shell struktur '' opløse '' de hydrofobe narkotika molekyler under vandige betingelser ved fysisk indkapsling. Polymere miceller sammensat af veldefinerede TDs udarbejdet i vores laboratorium danner monodisperse nanopartikler (10-50 nm partikelstørrelse) med en lang holdbarhed og høj effektivitet i indkapsle lægemidler. En af de mange fordele ved den robuste TD platformen er alsidigheden af ​​polymeren.Talrige lægemidler, fluorescerende farvestoffer og målretning ligander kan nemt indarbejdes i TD-platformen 13,15,24.

Kritiske trin i protokollen

Vi har udviklet en robust, reversibel, disulfid tværbundet micelle system til PTX levering, som er veldefineret, med en partikelstørrelse omkring 27 nm, og har en snæver størrelsesfordeling. TDS blev syntetiseret via trinvis løsning fase peptidkemi. Den veldefineret kemiske struktur af disse TDs er den vigtigste faktor til at generere nanopartikler med de ønskede egenskaber. Derfor bekræfter gennemførelsen af ​​reaktionen med TLC og Kaiser test er meget kritisk. H 2 O 2 oxidation er også et kritisk trin, thiolgrupperne på TD oxideres til dannelse disulfid tværbindinger, der i høj grad øge stabiliteten af micellerne. Sammenlignet med vores tidligere oxygen-baseret oxidation metode, H 2 O 2 -baseret oxidation metode er 96 gange hurtigere, hvorved der tilvejebringes tværbundne miceller i kortere perioder. Endvidere GSH, en thiol-indeholdende tripeptid, er en vigtig antioxidant der produceres af cellerne, og det spiller en vigtig rolle i scavenging frie radikaler og reaktive oxygenforbindelser. Det gør store bidrag ved at opretholde den cellulære redox homeostase. Den cellulære koncentration af GSH er et interessant aspekt af udviklingen af ​​lægemidler. Den intracellulære koncentration af GSH er nu fast etableret for at være væsentligt højere end den ekstracellulære koncentration (10 mM versus 2 pM, henholdsvis) 25. Endnu vigtigere, har en forhøjet intracellulær GSH-niveau ofte blevet rapporteret i mange resistente menneskelige og murine tumorceller 26. Den høje intracellulære fordeling af GSH letter brud på disulfidtværbinding af miceller og resulterer i frigivelse og akkumulering af lægemidlet nyttelast. Disulfid tværbundne nanopartikler erstabil i nærvær af SDS. Men en GSH-rige intracellulære miljø udløser frigivelsen af ​​lægemidlet ved at nedbryde disulfidbindingerne, hvorved destabilisere systemet. Polymer-induceret hæmolyse resulterede fra den skadelige vekselvirkning af polymere miceller med blodbestanddele, såsom røde blodlegemer. Tværbundne miceller viste meget mindre hæmolyse sammenlignet med ikke-tværbundne analoger.

Ændringer og fejlfinding

Ved hjælp H2O 2 som et oxidationsmiddel muliggør en mere effektiv disulfid cross-link formation sammenlignet med de tidligere rapporterede, oxygen-baserede metode 13. H 2 O 2 er et stærkt oxidationsmiddel 27, der er billigt og stærkt opløseligt i vand og giver kvalitetsprodukter sammenlignet med nogle andre kendte oxidationsmidler (f.eks chromat eller permanganat). oxidation tid kan dog brug for, at further optimeres i forhold til omfanget af syntesen.

Begrænsninger af teknikken

H 2 O 2 er et stærkt oxidationsmiddel. Selvom en lav koncentration af H 2 O 2 anvendes til at udføre disulfid cross-link dannelse, pleje skal tages, når der anvendes med TDs lastet med "oxidationsfølsomme" stoffer for at forebygge uønsket stof nedbrydning.

Betydningen af Teknik med Respekt for eksisterende / Alternative Metoder

Den beskrevne teknik er en let forsøgsopstilling, som let kan replikeres i en standard laboratorium. For eksempel lægemiddelfyldning anvendelse af en standard fordampning fremgangsmåde er mindre tidskrævende end dialysemetoden. Den disulfiddannelse i kernen ved hjælp af H 2 O 2 som oxidationsmiddel er 96 gange hurtigere end den tidligere rapporterede oxidation fremgangsmåde under anvendelse oxygda 13. Reproducerbarhed af den lægemiddel-loading trin kan let vurderes ved måling af partikelstørrelsen (DLS metode) og lægemiddelindhold (HPLC).

Fremtidige Programmer eller vejvisning efter Mastering denne teknik

Sammenlignet med små molekyler lægemidler, til en af de største hindringer, der har brug overvindes før nano-medicin kan indtaste mainstream kræft pleje indstillinger er de tekniske udfordringer i forbindelse med optrapning produktionen 28. Efter mastering denne nyudviklede teknik, kan man let syntetisere disulfid tværbundne miceller i stor skala. Dette er yderst ønskeligt til kliniske undersøgelser af denne nano-formulering i humane patienter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MeO-PEG5K-NH2 Rapp Polymere 125000-2
Fmoc-Lys(Fmoc)-OH Aaptec AFK107
Fmoc-Lys(Boc)-OH Anaspec AS-20132
Fmoc-Cys(Trt)-OH Aapptec AAC105
Dimethylformamide Fisher Scientific BP1160-4
Ethyl ether Fisher Scientific E134-20
N,N-Diisopropylethylamine Sigma Aldrich D125806
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich T6508 Corrosive, handle with care
4-methyl piperidine Alfa-Aesar L-02709
Ebes linker Anaspec AS-61924
Cholic acid Sigma Aldrich C1129
1,2-Ethanedithiol Sigma Aldrich 02390 Handle inside fume hood. Bleach gloves after usage.
Triisopropylsilane Sigma Aldrich 233781
Chloroform (anhydrous) Sigma Aldrich 288306
Hydrogen peroxide solution 30% Aaron Industries NA
HoBt-Cl Aaptec CXZ096
DIC Sigma Aldrich D125407
Female athymic nude mice (Nu/Nu strain), 6–8 weeks age Harlan (Livermore, CA)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, L., et al. Nanoparticles in medicine: therapeutic applications and developments. Clin. Pharmacol. Ther. 83, 761-769 (2008).
  2. Wang, A. Z., Langer, R., Farokhzad, O. C. Nanoparticle Delivery of Cancer Drugs. Annu. Rev. Med. 63, 185-198 (2012).
  3. Iyer, A. K., Khaled, G., Fang, J., Maeda, H. Exploiting the enhanced permeability and retention effect for tumor targeting. Drug Disc. Today Targets. 11, 812-818 (2006).
  4. Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles. Pharmacol. Rev. 64, 505-519 (2012).
  5. Kamaly, N., Xiao, Z., Valencia, P. M., Radovic-Moreno, A. F., Farokhzad, O. C. Targeted polymeric therapeutic nanoparticles: design, development and clinical translation. Chem. Soc. Rev. 41, 2971-3010 (2012).
  6. Li, Y. L., et al. Reversibly stabilized multifunctional dextran nanoparticles efficiently deliver doxorubicin into the nuclei of cancer cells. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 9914-9918 (2009).
  7. Miyata, K., et al. Block catiomer polyplexes with regulated densities of charge and disulfide cross-linking directed to enhance gene expression. J. Am. Chem. Soc. 126, 2355-2361 (2004).
  8. Chan, Y., Wong, T., Byrne, F., Kavallaris, M., Bulmus, V. Acid-labile core cross-linked micelles for pH-triggered release of antitumor drugs. Biomacromolecules. 9, 1826-1836 (2008).
  9. Rijcken, C. J., Snel, C. J., Schiffelers, R. M., van Nostrum, C. F., Hennink, W. E. Hydrolysable core-crosslinked thermosensitive polymeric micelles: synthesis, characterisation and in vivo studies. Biomaterials. 28, 5581-5593 (2007).
  10. Talelli, M., et al. Core-crosslinked polymeric micelles with controlled release of covalently entrapped doxorubicin. Biomaterials. 31, 7797-7804 (2010).
  11. Xiao, K., et al. A self-assembling nanoparticle for paclitaxel delivery in ovarian cancer. Biomaterials. 30, 6006-6016 (2009).
  12. Li, Y., et al. A novel size-tunable nanocarrier system for targeted anticancer drug delivery. J. Control. Release. 144, 314-323 (2010).
  13. Li, Y., et al. Well-defined, reversible disulfide cross-linked micelles for on-demand paclitaxel delivery. Biomaterials. 32, 6633-6645 (2011).
  14. Li, Y., et al. Well-defined, reversible boronate crosslinked nanocarriers for targeted drug delivery in response to acidic pH values and cis-diols. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51, 2864-2869 (2012).
  15. Li, Y., et al. A smart and versatile theranostic nanomedicine platform based on nanoporphyrin. Nat. Commun. 5, (2014).
  16. Belenki, B. G., Gankina, E. S. Thin-Layer chromatography of polymers. J. Chromatogr. A. 141, 13-90 (1977).
  17. Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).
  18. Pandey, P. S., Rai, R., Singh, R. B. Synthesis of cholic acid-based molecular receptors: head-to-head cholaphanes. J. Chem. Soc., Perkin Trans 1. , 918-923 (2002).
  19. Riddles, P. W., Blakeley, R. L., Zerner, B. Reassessment of Ellman's reagent. Methods Enzymol. 91, 49-60 (1983).
  20. Ahuja, S., Rasmussen, H. Overview of HPLC method development for pharmaceuticals. HPLC Method Development for Pharmaceuticals. , Separation Science and Technology; 8. Elsevier Academic Press Inc. 1-11 (2007).
  21. Li, Y., Pan, S., Zhang, W., Du, Z. Novel thermo-sensitive core-shell nanoparticles for targeted paclitaxel delivery. Nanotechnology. 20 (6), 065104 (2009).
  22. Kato, J., et al. Disulfide cross-linked micelles for the targeted delivery of vincristine to B-cell lymphoma. Mol. Pharm. 9, 1727-1735 (2012).
  23. Lu, S. C. Regulation of glutathione synthesis. Mol. Aspects Med. 30, 42-59 (2009).
  24. Xiao, K., et al. "OA02" peptide facilitates the precise targeting of paclitaxel-loaded micellar nanoparticles to ovarian cancer in vivo. Cancer Res. 72, 2100-2110 (2012).
  25. Koo, A. N., et al. Disulfide-cross-linked PEG-poly(amino acid)s copolymer micelles for glutathione-mediated intracellular drug delivery. Chem. Commun. 28, 6570-6572 (2008).
  26. McLellan, L. I., Wolf, C. R. Glutathione and glutathione-dependent enzymes in cancer drug resistance. Drug. Resist. Update. 2, 153-164 (1999).
  27. Karala, A. R., Lappi, A. K., Saaranen, M. J., Ruddock, L. W. Efficient peroxide-mediated oxidative refolding of a protein at physiological pH and implications for oxidative folding in the endoplasmic reticulum. Antioxid. Redox Signal. 11, 963-970 (2009).
  28. Gabizon, A., et al. Cancer nanomedicines: closing the translational gap. Lancet. 384, 2175-2176 (2014).
  29. Nanotrac Nanotechnology Particle Size Measurement Solutions. , Available from: http://www.vahitech.com/Assets/Nano(US)Web.pdf (2006).

Tags

Biochemistry nanopartikel drug delivery miceller telodendrimer disulfidtværbinding hydrogenperoxid-medieret oxidation
En Facile og effektiv tilgang til fremkaldelse af reversibel disulfid Cross-forbundne Miceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Y., Bharadwaj, G., Lee, J. S. A… More

Li, Y., Bharadwaj, G., Lee, J. S. A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles. J. Vis. Exp. (118), e54722, doi:10.3791/54722 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter