Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En Facile og effektiv tilnærming for produksjon av Reversibel disulfide tverrbundet Miceller

Published: December 23, 2016 doi: 10.3791/54722
Automatic Translation
1,2, 1, 3
1Department of Biochemistry & Molecular Medicine, University of California, Davis, 2UC Davis Comprehensive Cancer Center, University of California, Davis, 3Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of California, Davis

Abstract

Nanomedisin er en ny form for terapi som utnytter de unike egenskapene til partiklene som er nanometer i skala for biomedisinsk anvendelse. Forbedre levering av legemidler for å maksimere terapeutisk utfall og for å redusere narkotikarelatert bivirkninger er noen av hjørnesteinene i dagens nanomedisin. Nanopartikler i særdeleshet har funnet en bred anvendelse i behandling av kreft. Nanopartikler som gir en høy grad av fleksibilitet i design, program, og produksjon basert på svulsten mikromiljøet er anslått til å være mer effektiv med rask oversettelse til klinisk praksis. Polymer micellar nano-carrier er et populært valg for levering av legemidler programmer.

I denne artikkelen beskriver vi en enkel og effektiv protokoll for å syntetisere narkotikabelastede, disulfid tverrbundet miceller basert på den selvbygging av en veldefinert amfifil lineær-dendrittiske copolymer (telodendrimer, TD). TD er sammensatt av polyetylen glycol (PEG) som den hydrofile segment og et tiolerte cholinsyre klynge som kjernedannende hydrofob gruppe festet trinnvis til et amin-terminert ved hjelp av PEG-løsning baserte peptidkjemien. Kjemoterapi narkotika, for eksempel paclitaxel (PTX), kan lastes ved hjelp av en standard løsemiddelfordamping metode. O 2 -mediert oksidasjon ble tidligere brukt til å danne intra-micelle disulfide kryssforbindelser fra frie tiol grupper på TDS. Imidlertid var reaksjonen treg og ikke gjennomførbart for stor-skala produksjon. Nylig ble en H 2 O 2-formidlet oksydasjon Fremgangsmåte utforsket som en mer gjennomførbar og effektiv tilnærming, og det var 96 ganger raskere enn tidligere rapportert metode. Ved bruk av denne tilnærmingen, har 50 g av PTX-lastet, disulfid tverrbundne nanopartikler blitt produsert med snever partikkelstørrelsesfordeling og høy medikamentfylling effektivitet. Stabiliteten av den resulterende micellen oppløsningen blir analysert ved bruk av forstyrrende tilstander som ko-inkubasjon wed et vaskemiddel, natriumdodecylsulfat, med eller uten et reduksjonsmiddel. Medikament-lastet, disulfid tverrbundne miceller viste mindre hemolytisk aktivitet sammenlignet med sine ikke-tverrbundne motparter.

Introduction

Nanoteknologi er et raskt voksende felt som har dratt en rekke biomedisinske områder 1. Nanopartikler gir muligheter for å designe og tuning egenskaper som ikke er mulig med andre typer konvensjonelle behandlingsformer. Nano-bærere forbedre stabiliteten av legemidler mot biologisk nedbrytning, forlenge narkotika sirkulasjon tid, vinne løselighet narkotika problemer, og kan være finjustert for målrettet levering av legemidler og for co-levering kontrastmidler 1,2. Nanopartikkel-baserte leveringssystemer holde løftet i kreft bildebehandling og behandling. Tumor vasculatures er lekk til makromolekyler og kan føre til fortrinnsrett opphopning av sirkulerende nanopartikler på kreft nettsteder via den forbedrede permeabilitet og oppbevaring (EPR) effekt 3. Blant de flere nanobærere (f.eks, liposomer, hydrogeler og polymere miceller) som forfølges aktivt som bærere for anti-kreft narkotika, har polymere miceller oppnådd stor popularitet i løpet av the siste tiåret 4,5.

Polymere miceller er et termodynamisk system som, ved intravenøs administrering, kan potensielt bli fortynnet under den kritiske micelle-konsentrasjon (CMC), som fører til deres dissosiasjon til unimers. Cross-linking strategier har blitt ansatt for å minimere micellar dissosiasjon inn unimers. Imidlertid kan overdrevet stabiliserte miceller hindre stoffet fra å slippe på målsetene, for derved å redusere den totale terapeutiske effekt. Flere kjemiske metoder har blitt utforsket for å gjøre kryssbindings nedbrytbare i respons til redox eller på ytre stimuli, slik som reduser disulfidbindinger 6,7 og pH-spaltbare 8 eller hydrolyserbare esterbindinger 9,10.

Vi har tidligere rapportert design og syntese av micelle-nanopartikler bestående av dendrittiske cholsyre (CA) blokker og lineært polyetylen glykol (PEG) kopolymerer, referert til som telodendrimers (TD) 11-15 nK -CAy (hvor n = molekylvekt i kilodalton (k), y = antall av cholsyre (CA) enheter). De er kjennetegnet ved deres lille størrelse, lang holdbarhet og høy effektivitet i innkapsle legemidler, slik som paclitaxel (PTX) og doxorubicin (DOX) i den hydrofobe kjerne. Byggeklossene i TD, for eksempel PEG, lysin, og CA, er biokompatible, og tilstedeværelsen av et PEG korona kan formidle et "stealth" nanopartikler karakter, forebygge ikke-spesifikke opptak av micelle-nanopartikler av det retikuloendoteliale system.

Tiolert lineære-dendrittiske polymerer kan lett bli generert ved å innføre cysteiner inn dendrittiske oligo-lysin ryggraden i vår standard TDS. Denne artikkelen presenterer en lettvint protokoll for fremstilling av et reversibelt kryssbundet micellar medikamentleveringssystemet ved å innføre disulfid tverrbindinger i den hydrofobe kjerne av TDS (figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etikk uttalelse: Kvinne atymiske nakne mus (Nu / Nu stamme), 6-8 uker gammel, ble kjøpt og deretter holdt under patogen-frie forhold i henhold til AAALAC retningslinjer og ble akklimatisert seg i minst 4 dager før noen eksperimenter. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med institusjonens retningslinjer og i henhold til protokoll nr 07-13119 og nr 09-15584, godkjent av Animal bruk og vedlikehold Administrative rådgivende komité ved University of California, Davis.

1. Syntese av TD PEG 5K Cvs 4 -Ebes 8 -CA 8

  1. I en rundbunnet kolbe, oppløse MeO-PEG-5K-NH2 (2 g, 0,4 mmol) i 10-20 ml vannfritt dimetylformamid (DMF) og kjøle på is.
  2. I et glassbeger, oppløse 3 ekv. av 1-hydroksy-6-klor-benzotriazol (HOBt), 3 ekv. av N, N'-diisopropylkarbodiimid (DIC), og 3 ekv. av (Fmoc) 2-Lys-OH i vannfritt DMF (10-15 ml). Omrør i 15-20 minutter på en magnetisk røreplate.
  3. Tilsett blandingen til reaksjonskolben inneholdende MeO-PEG-5K-NH 2. Fjern isbadet og omrør reaksjonsblandingen over natten ved romtemperatur.
  4. Bekreftet fullførelse av reaksjonen med tynnsjiktskromatografi (TLC) 16 og Kaiser-test 17 (en gul farge angir fravær av frie NH2). Utfelle det polymere produkt 1 (MeO-PEG-5K -Lys (NH-Fmoc) 2) ved tilsetning av ca. 200 ml is-kald eter til reaksjonskolben. Separer den utfelte polymeren via sentrifugering (6 minutter ved 6000 xg og 4 ° C).
    1. For å utføre TLC, spot prøvene på silikagel-belagte TLC-plater. Bruke diklormetan / metanol (9: 1) som mobil fase. Observer flekker under en UV-lampe etter å utvikle de TLC-plater. Man kan også bruke ninhydrin-fargereagens for å visualisere amin flekker på en varm plate.
    2. for Kaiser test, plassere en liten bit av prøven i glassrør som inneholder Kaiser reagens. Varme den ved 100 ° C i 5 minutter og se etter fargeendring (hvis fargen på løsningen forblir gult, da reaksjonen er fullstendig).
  5. Re-oppløse produktet i vannfri DMF (10-20 ml) og gjenta utfelling og sentrifugering (se trinn 1.4).
  6. Gjenta trinn 1.5, og deretter vaske polymeren bunnfallet tre ganger med iskald eter.
  7. Overfør utfellingen polymeren en til en ren reaksjonskolbe og koble kolben til en høy vakuumkilde for å fjerne den gjenværende eteren.
  8. Fremstille og legge til omtrent 20-30 ml 20% (v / v) 4-metylpiperidin i DMF til polymer mellomprodukt 1. Rør til fullstendig oppløsning. Kjøre reaksjonen i 3 timer.
  9. Utføre TLC 16 og Kaiser-test (en blå farge bekrefter tilstedeværelsen av fri NH2) 17 (se trinn 1.4) for å bekrefte completion av reaksjonen. Når reaksjonen er fullført, går til eter utfelling, som beskrevet for produkt 1 (trinn 1.4 til 1.6).
  10. Tørk det polymere produkt 2 (MeO-PEG-5K-Lys (NH2) 2) under et vakuum.
  11. Gjennomføre en mer runde (Fmoc) 2 Lys-OH-koblingen på mellom 2 (trinn 1,1-1,7) for å generere produkt 3 (MeO-PEG 5K Lys (Lys (NH-Fmoc) 2) 2). De beskytte (trinn 01.08 til 01.10) Fmoc grupper (4, MeO-PEG 5K Lys (Lys (NH 2) 2) 2) og par (trinn 1,1-1,7) den (Fmoc) Lys (Boc) -OH til generere en tredje generasjons dendritisk polylysin (5, MeO-PEG 5k -Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys (Boe)) 4) terminert med fire Boc og Fmoc-grupper på den ene enden av PEG-kjeden.
  12. Overfør den resulterende polymer mellomproduktet 5 til en reaksjonskolbe. i såeparate reaksjonskolben, forberede 1: 1 (v / v) trifluoreddiksyre (TFA) i diklormetan (DCM). Legg 15-20 ml av en 1: 1 TFA / DCM (volum / volum) blanding til polymermellomprodukt 5. Rør blandingen inntil polymeren er fullstendig oppløst. Rør i ytterligere 3 timer.
  13. Utføre TLC 16 og Kaiser-test (en blå farge bekrefter tilstedeværelsen av fri NH2) 17 (se trinn 1.4) for å få bekreftet fullførelsen av reaksjonen. Når reaksjonen er fullført, fordamp løsnings polymer-i-TFA / DCM blanding med luft inntil det er oppnådd en viskøs oppløsning. Fortsett til eteren nedbør, som nevnt for produktet 1 (trinn 1.4 til 1.6). Tørk det polymere produkt 6 (MeO-PEG-5k -Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys (NH2)) 4) under et vakuum.
  14. Overføring polymermellomprodukt 6 i en reaksjonskolbe. Bruk omtrent 40 ml vannfritt DMF inneholdende 8 ekv. N, N -diisopropylethylamine (DIEA) for å oppløse polymeren mellomprodukt 6. I et glassbeger, oppløse 12 ekv. HOBt, 12 ekv. DIC, og 12 ekv. av (Fmoc) Cys (Trt) -OH i 20-25 ml vannfritt DMF. Rist i 10-15 min, og deretter til reaksjonsblandingen til reaksjonskolben inneholdende 6. Kjør reaksjon over natten.
  15. Bekreftet fullførelsen av reaksjonen med TLC 16 og Kaiser-test (se trinn 1.4, en gul farge angir fravær av frie NH2) 17. Når reaksjonen er fullført, går til eter utfelling, som beskrevet for produkt 1 (trinn 1.4 til 1.6), for å isolere produktet 7 (MeO-PEG-5K-Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys - ((Fmoc) Cys (Trt))) 4.
  16. Utføre Fmoc de-beskyttelse på 7, slik det er beskrevet i trinn 1,8, for å oppnå produkt 8 (PEG 5K -Lys-Lys 2 - (Lys (NH2) - (Cys (NH2) (Trt))) 4). Par (Fmoc) -PEG 2 -Suc-OH ( «Ebes" linker, 24 ekv.) På en polymer som mellomprodukt ved å bruke fremgangsmåten skissert ovenfor for HOBt / DIC-mediert kobling for å oppnå mellomprodukt 9 (MeO-PEG-5K-Lys-Lys -Lys 2 4 - (Cys (Trt) ) 4 (Ebes (NH-Fmoc)) 8).
  17. Utfør en runde av Fmoc de-beskyttelse (trinn 1,6-1,8) for å få mellom 10 (Meo-PEG 5K-Lys-Lys 2 Lys 4 - (Cys (Trt)) 4 (Ebes (NH 2)) 8).
  18. Overfør polymermellomprodukt 10 i en reaksjonskolbe og tilsett vannfri DMF (ca. 30-40 ml) for å oppløse den. I en annen reaksjonskolbe oppløses 24 ekv. av CAOSu (fremstilt i henhold til den tidligere publiserte prosedyre) i vannfritt DMF (20-30 ml) 18. Legg 48 ekv. av N, N-diisopropyletylamin og lar det omrøres i 10-15 min. Overfør innholdet i reaksjonskolben inneholdende 10 og la reaksjonen løpe overnight.
  19. Bekreftet fullførelse av reaksjonen med TLC 16 og Kaiser-test (se trinn 1.4, en gul farge angir fravær av frie NH2) 17. Når reaksjonen er fullført, går til eter utfelling, som beskrevet for produkt 1 (trinn 1.4 til 1.6) for å isolere produktet 11 (MeO-PEG-5K-Lys-Lys -Lys 2 4 - (Cys (Trt)) 4 -Ebes 8 -CA 8). Dialyser den i de-ionisert vann og lyofilisere prøven for å gi et hvitt pulver.
  20. Plasser polymermellom 11 inn i en reaksjonskolbe. Fremstille og tilsett 20 ml av TFA / 1,2-etanditiol (EDT) / trietylsilan (TIS) / H2O (94 / 2,5 / 1 / 2,5, volum / volum) blanding i polymerløsningen. Rør blandingen til fullstendig oppløsning. Kjøre reaksjonen i 4 timer. Bekreftet fullførelse av reaksjonen ved hjelp av TLC 16.
  21. Under avtrekksskap, blåse luft inn i polymer-TFA / EDT / TIS / H 2O blandingen inntil løsningen blir viskøs. Fortsett til eter utfelling, som beskrevet for produkt 1 (trinn 1.4 til 1.6), for å isolere det endelige produkt, 12 (PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8). Oppløs det i acetonitril og lyofilisere den for å gi et hvitt pulver.

2. Utarbeidelse av PTX-lastet Miceller

  1. Forbered en PTX belastet PEG 5K Cvs 4 -Ebes 8 -CA 8 micelle ved hjelp av standard fordampning metoden.
    1. Oppløs 20 mg av TD med en annen mengde av PTX (1-9 mg) i 1 ml kloroform (CHCI3). Fjern løsningsmidlet ved hjelp av en rotasjonsfordamper for å oppnå en homogen, tørr polymer film. Rekonstituer film med 1 ml fosfat-bufret saltvann (PBS) ved vortex, etterfulgt av ultralydbehandling i 30 minutter ved 40 kHz, om nødvendig, for å tillate dannelsen av legemiddel lastet miceller.
    2. Tilsett 6 ul 3% (vekt / vekt) H 2 O 2 (1 ekv. Til free av tiolgrupper) for å oksydere de tiolgrupper på TD. Bruk micelle-løsning for ytterligere karakterisering når nivået av frie tiolgrupper forblir ved konstante lave verdier, som antydet med Ellmans test 19.
    3. Filtrer løsningen med en 0,22-um filter for å sterilisere prøven. Analyser mengden av legemiddel som er lagt i micellene på et HPLC-system 20 etter frigjøring av legemidler fra micellene ved tilsetning av 9 ganger acetonitril og utføre 10 min av ultralydbehandling. Bruke en C18 kolonne for HPLC med acetonitril / vann som den mobile fase.
    4. Beregn medikamentbelastning i henhold til kalibreringskurven mellom de HPLC-arealverdier og konsentrasjonene av medikamentet standard 11.
      MERK: lasting virkningsgrad er definert som forholdet mellom medikament er lagt inn i micellene til det initiale medikamentinnhold.

3. karakterisering av Miceller

  1. Måle størrelsen og størrelsesfordelingen av de micelles med en dynamisk lysspredning (DLS) instrument 29. Utføre målinger ved værelsestemperatur og holde micellekonsentrasjonen ved 1 mg / ml.
    MERK: Hvis du vil utføre partikkelstørrelse analyse, bruke PBS som blank, og deretter spille partikkelstørrelsen for selve prøvene. Ta målingene i tre eksemplarer for prøver, og deretter gjennomsnitt målingene.
  2. Bruk fluorescensspektra for å måle den kritiske micelle-konsentrasjon (CMC) av PEG-5K-Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 før og etter tverrbinding med pyren som en hydrofob fluorescerende probe, som beskrevet tidligere 13,21.
    MERK: Vanligvis strekker den micellekonsentrasjonen fra 5 × 10 -7 til 5 × 10 -4 M.

4. Stabilitet av Miceller i SDS med eller uten reduksjonsmidler

  1. Fremstille stamløsninger av natriumdodecylsulfat (SDS) -løsning (7,5 mg / ml) og disulfid tverrbundet miceller (1,5 mg / ml) i PBS. Neste, usynger stamløsninger, lage en løsning blanding hvori den endelige SDS-konsentrasjonen er på 2,5 mg / ml og den micelle-konsentrasjonen er ved 1,0 mg / ml.
  2. Måle størrelsen og størrelsesfordelingen (som nevnt i trinn 3.1) av micelle-oppløsningene ved forutbestemte tidsintervaller med eller uten nærvær av 10 mM glutation (GSH).

5. Hemolyse analyse

  1. Vurdere hemolytisk potensialet i PTX-lastet, ikke-kryss-lenkede miceller (PTX-NCM), utarbeidet i henhold til tidligere utgitt prosedyre 11 og PTX-lastet tverrbundet miceller (PTX-DCMS) med ferske citrat blod fra nakne mus hentet fra hale slør.
    1. Utlevering røde blodlegemer ved sentrifugering av blodprøver (1,0 ml) ved 1000 xg i 10 min, vaskes tre ganger med PBS, og deretter re-suspencellepelletene med PBS til en sluttkonsentrasjon på 2%.
  2. Bland 200 ul erytrocytt-suspensjon med forskjellige konsentrasjoner (0,2 og 1,0mg / ml) av PTX-NCM og PTX-DCMS, henholdsvis, og inkuberes i 4 timer ved 37 ° C i en risteinkubator.
  3. Sentrifuger micelle-erytrocytt-blandinger ved 3000 xg i 5 min. Overfør 100 ul av supernatanten av alle prøver til en 96-brønns plate. Mål absorbansen av hemoglobin i supernatanten ved 540 nm ved anvendelse av en mikroplateleser.
    MERK: RBC-er inkubert med Triton-100 (2%) og PBS skal brukes som positive og negative kontroller, respektivt. Den prosentvise hemolyse av røde blodceller blir beregnet med følgende formel: RBC hemolyse = (OD sample - OD negativ kontroll) / (OD positiv kontroll - OD negativ kontroll) x 100%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Utarbeidelse og karakterisering av Narkotika lastet, disulfide tverrbundet Miceller

Amfifile polymer PEG-5K-Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 er en dendrittisk polymer som er i stand til å danne et disulfid tverrbundet micellar system for kreftlegemiddelavlevering. Strukturelt er det definert som en dendrittisk oligomer av cholsyrer (hydrofobt domene) er knyttet til en ende av den lineære PEG-molekyl (hydrofil domene, molekylvekt 5K) gjennom et forgrenet poly (lysin-cystein-Ebes) ryggrad. Det er flere fordeler ved å bruke disse blokk-kopolymerer enn andre rapporterte micelle-systemer. For det første kan det lett syntetiseres via trinnvise oppløsningsfase kondensasjonsreaksjoner. Sekund, sammenlignet med flere andre rapporterte amfifile polymerer, den tiolerte polymersystem, som fremstilles ved veletablerte oppløsningsfase trinnvis Fmoc peptidkjemien, har en veldefinert strukturer;re. Den kan lagres i frysetørket pulverform og har en forlenget holdbarhet.

Flere teknikker kan anvendes for å karakterisere sluttproduktet. Mengden av cholsyre festet til TD kan detekteres ved å sammenlikne signalforholdet av protonene i PEG til de på de tre metylgruppene av cholsyre i 1H-NMR-spektra. Molekylvektene til TD kan bekreftes ved MALDI-TOF-massespektrometri og gelgjennomtrengnings-kromatografi (GPC). Den kvantitative Ellmans test kan anvendes for å dechiffrere antall frie cysteinrester er tilstede per molekyl.

PEG 5K Cvs 4 -Ebes 8 -CA 8 kan selv montere å danne miceller i vandige media. Ved hjelp av en standard løsningsmiddel-fordampningsmetoden, en rekke hydrofobe legemidler, slik som PTX og vinkristin, har blitt innkapslet i micellene 13,22. Oxygno ble tidligere brukt til å oksidere de frie tiol grupper av PEG 5K Cvs 4 -Ebes 8 -CA 8 og for å danne intra-micelle disulfid tverrbindinger. Som overvåket av Ellman test, konverteringsfrekvensen fra frie tiol grupper for å disulfidbindingene nådd 85% etter 48 timer av oksidasjon. AH 2 O 2-formidlet oksydasjon ble nylig anvendt som en alternativ metode. Konverteringskursen nådde 88% i 30 min (figur 2), som var 96 ganger raskere enn den forrige tilnærming. Femti gram PTX-lastet, har disulfid tverrbundet nanopartikler blitt produsert ved hjelp av denne mer effektiv tilnærming (figur 3). Partikkelstørrelsen var ca. 27 nm, med en smal størrelsesfordeling (Figur 3). Stoffet lasteeffektivitet nærmet seg 100% med PTX lasting av 4,0 mg / ml. Disulfid tverrbinding hadde en dramatisk effekt på CMC verdi. Sammenlignet med standard TD PEG 5K -CA 8 som manglerdisulfidbindinger, den kryssbundne TD viste en 10 gangers nedgang i de observerte CMC-verdier (5,53 uM versus 0,67 pM) 13.

stabilitets~~POS=TRUNC

Vi undersøkte videre stabiliteten PTX-lastet, disulfid tverrbundet miceller mot alvorlige micelliknende forstyrre forhold. Natriumdodecylsulfat (SDS) er en sterk ionisk detergent som blir rutinemessig brukt for å vurdere micellær stabilitet, da den effektivt kan bryte ned polymere miceller. Stabiliteten av legemiddel lastet, disulfid tverrbundne miceller (1,0 mg / ml) ble overvåket ved DLS i nærvær av det micelle-forstyrre SDS (2,5 mg / ml). Partikkelstørrelsen av micellene forble stabil over tid, noe som indikerer at slike tverrbundne miceller holdt seg intakt (figur 4, venstre panel). Reduktive er ventet å spalte disulfidbindinger i den hydrofobe kjerne, therEby gjør miceller utsatt for destabilisering. Glutation (GSH), et endogent reduksjonsmiddel, er ofte brukt for slike studier. Det er sterk kontrast i det intracellulære nivå av GSH i forhold til det ekstracellulære nivå (10 mm versus 2 um). Denne forskjellen i konsentrasjoner er ofte brukt til å generere stimuli-reagerende systemer. Etter tilsetning av GSH ved en intracellulær konsentrasjon (10 mm) 23, størrelsen av legemiddelbelastet, disulfid tverrbundne miceller forble intakt etter 30 min. De brått ble redusert til 1 nm, som betegner reduksjon av et kritisk antall disulfidbindinger, en forutsetning for den raske dissosiasjon av micellene (figur 4, høyre panel). Tvert imot, forble systemet stabilt i nærvær av ekstracellulære konsentrasjoner av GSH (data ikke vist).

hemolyse Study

Figur5 viser forskjeller i den observerte hemolytiske aktivitet av PTX-lastede miceller, med eller uten disulfid tverrbinding. Hemolyse av blodceller må unngås ved administrasjon av disse partiklene inn i blodstrømmen, som det undergraver deres terapeutiske fordeler. Hemato-kompatibilitet er meget viktig for in vivo anvendelse av polymerbaserte legemiddelbærere, for eksempel amfifile TDS som har potensial til å oppløse lipidene eller til å sette seg selv inn i fosfolipid-membraner, noe som fører til at sprekker av plasmamembraner. Som vist i figur 5, ble det PTX-NCM funnet å ha en doseavhengig av røde blodceller (RBC) lyseringstall, med prosentandelen av hemolyse å øke fra 8,1% til 14,2% når konsentrasjonen av PTX-NCM økt fra 0,2 mg / ml til 1,0 mg / ml. Imidlertid PTX-DCMS som har disulfid tverrbindingen viste ingen observerbar hemolytiske aktivitet (<1,0%) i RBC-ene under de samme forsøksbetingelser. Denne forskjellen i hemolyser trenden kan tilskrives intra-micellar disulfidbroer stede på hydrofobe kjerne, som hindrer PTX-DCMS fra dissosiering å danne amfifile TDS.

Figur 1
Figur 1: Fremgangsmåte for å danne tverrbundet miceller. Skjematisk fremstilling av disulfid tverrbundet miceller dannet ved oksidasjon av tiolerte telodendrimer PEG 5K Cvs 4 -Ebes 8 -CA 8 etter selvbygging. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Oksidasjon metoder for tverrbundet miceller formasjon. Konverteringskursen av than tiolgrupper på de TDS til disulfidbindinger som en funksjon av oksydasjon tid for de to oksidasjonsmetoder. Den totale konsentrasjon av micellene ble holdt ved 20 mg / ml. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Drug-lastet, tverrbundet micelle. Venstre panel: et bilde av en gruppe med PTX-lastet, disulfid tverrbundet miceller. Skala: 1 tomme. Høyre panel: partikkelstørrelse, som bestemt ved dynamisk lysspredning (DLS). Den totale konsentrasjon av miceller ble holdt ved 20 mg / ml. Lastingen av PTX ble 4 mg / ml. Partikkelstørrelsen Dataene ble vist som den gjennomsnittlige partikkelstørrelse ± SD basert på tre målinger. SD: standardavvik, beskriver bredden av den målte partikkelstørrelsesfordeling.Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Stabilitet studien. Partikkelstørrelsen av PTX-lastet, disulfid tverrbundet miceller i nærvær av 2,5 mg / ml SDS uten (til venstre) eller med (høyre) GSH (10 mM), målt ved DLS. Partikkelstørrelsen Dataene ble vist som den gjennomsnittlige partikkelstørrelse ± SD basert på tre målinger. SD: standardavvik, beskriver bredden av den målte partikkelstørrelsesfordeling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: Hemolyse assay. In vitro hemolytiske aktivitet av PTX-lastet, disulfid tverrbundne miceller i forhold til ikke-kryssbundne miceller på røde blodceller (RBC). Triton-100 (2%) og PBS ble anvendt som den positive og negative kontroller, respektivt. De rapporterte verdier er gjennomsnittet ± SD av triplikate prøver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flere nanopartikler har blitt undersøkt for deres potensielle bruk i levering av legemidler. Liposomalt doxorubicin og paclitaxel (PTX) -loaded humant serumalbumin nano-aggregater er blant de nanotherapeutics godkjent av FDA for kreftbehandling. Imidlertid, selv om klinisk effektive, begge disse nanotherapeutics er forholdsvis "stort" i størrelse, og de har en tendens til å akkumulere i lever og lunger. Polymer miceller med relativt mindre partikkelstørrelser og høyere narkotika lastekapasitet dukker nanocarriers for levering av legemidler. Deres unike kjerne-skall struktur '' oppløse '' de hydrofobe legemiddelmolekylene under vandige betingelser ved fysisk innkapsling. Polymer miceller består av veldefinerte TDS utarbeidet i våre lab skjema monodispergerte nanopartikler (10-50 nm partikkelstørrelse) med lang holdbarhet og høy effektivitet i innkapsle narkotika. En av de mange fordelene med robust TD plattformen er allsidighet av polymer.Tallrike stoffer, fluorescerende fargestoffer, og som målretter ligander kan lett bli inkorporert i TD plattformen 13,15,24.

Kritiske trinn i protokollen

Vi har utviklet en robust, reversible, disulfid tverrbundet micellen system for levering PTX, som er godt definert, med en partikkelstørrelse på omkring 27 nm, og har en snever størrelsesfordeling. TDS ble syntetisert via trinnvis løsning fase peptid kjemi. Den veldefinerte kjemiske struktur av disse TDS er en nøkkelfaktor for å generere nanopartikler med de ønskede egenskaper. Derfor bekrefter fullførelse av reaksjonen med TLC og Kaiser test er meget kritisk. 'H 2 O 2 oksidering er også et kritisk punkt, tiolgruppene på TD er oksidert til å danne disulfid-kryssbindinger, noe som i stor grad øke stabiliteten av micellene. Forhold til våre tidligere oksygenbasert oksidasjonsmetoden, H 2 O 2 -basert oksidasjon metode er 96 ganger raskere, og dermed gi kryssbundne miceller i kortere tidsperioder. Videre GSH, en tiol-inneholdende tripeptidet, er en viktig anti-oxidant produsert av cellene, og den spiller en viktig rolle i scavenging frie radikaler og reaktive oksygenforbindelser. Det gjør store bidrag ved å opprettholde den cellulære redoks homeostase. Den cellulære konsentrasjonen av GSH er et interessant aspekt av drug design. Den intracellulære konsentrasjonen av GSH er nå godt etablert til å være betydelig høyere enn den ekstracellulære konsentrasjon (10 mM i forhold til 2 pM, henholdsvis) 25. Enda viktigere, har en forhøyet intracellulær GSH nivå ofte blitt rapportert i mange resistente menneskelige og murine tumorceller 26. Den høye intracellulære fordeling av GSH letter brekkasje av disulfid tverrbinding av micellene og resulterer i utslipp og akkumulering av medikamentet nyttelast. De disulfid tverrbundet nanopartikler erstabil i nærvær av SDS. Imidlertid utløser en GSH-rikt miljø intracellulær frigjøring av medikamentet ved å bryte ned disulfidbindingene, for derved å destabilisere systemet. Polymer-indusert hemolyse resulterte fra den skadelige interaksjon av polymere miceller med blodbestanddeler, så som røde blodceller. Tverrbundne miceller viste mye mindre hemolyse sammenlignet med ikke-tverrbundne analoger.

Modifikasjoner og feilsøking

Utnytte H 2 O 2 som et oksidasjonsmiddel gir mulighet for en mer effektiv disulfid tverrbinde dannelse sammenlignet med den tidligere rapportert, oksygenbasert metode 13. H 2 O 2 er et sterkt oksidasjonsmiddel 27 som er billig og meget oppløselig i vann og gir produkter av høy kvalitet sammenlignet med noen andre kjente oksidasjonsmidler (f.eks, kromat eller permanganatoppløsninger). Imidlertid kan oksidering tid må further optimalisert basert på vekten av syntesen.

Begrensninger av teknikken

H 2 O 2 er et kraftig oksydasjonsmiddel. Selv om en lav konsentrasjon av H 2 O 2 brukes for utførelse av disulfid-kryssbinde formasjon, må tas ved bruk sammen med TDS lastet med "oksidasjons-sensitive" legemidler for å forebygge uønsket nedbrytning medikament forsiktighet.

Betydningen av Technique For eksisterende / alternative metoder

Den teknikk som er beskrevet er en lett eksperimentelt oppsett som lett kan replikeres i en standard laboratorium. For eksempel, medikament-last ved hjelp av en standard fordampning metode er mindre tidkrevende enn den dialysemetoden. Disulfidet formasjonen i kjernen ved hjelp av H 2 O 2 som oksydasjonsmiddel er 96 ganger raskere enn tidligere rapportert oksidering metode med bruk av oxygno 13. Reproduserbarhet av medikamentet lasttrinn lett kan vurderes ved å måle partikkelstørrelsen (DLS-metoden) og medikamentinnhold (HPLC).

Fremtidige søknader eller Veibeskrivelse Etter å mestre denne teknikken

Sammenlignet med små-molekyl narkotika, en av de største hindringene som må overvinnes før nano-medisin kan skrive mainstream kreftomsorgen innstillingene er de tekniske utfordringene med å skalere opp produksjonen 28. Etter å mestre dette nylig utviklet teknikk, kan man lett syntetisere disulfid tverrbundne miceller i stor skala. Dette er svært ønskelig for kliniske studier av denne nano-formulering i humane pasienter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MeO-PEG5K-NH2 Rapp Polymere 125000-2
Fmoc-Lys(Fmoc)-OH Aaptec AFK107
Fmoc-Lys(Boc)-OH Anaspec AS-20132
Fmoc-Cys(Trt)-OH Aapptec AAC105
Dimethylformamide Fisher Scientific BP1160-4
Ethyl ether Fisher Scientific E134-20
N,N-Diisopropylethylamine Sigma Aldrich D125806
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich T6508 Corrosive, handle with care
4-methyl piperidine Alfa-Aesar L-02709
Ebes linker Anaspec AS-61924
Cholic acid Sigma Aldrich C1129
1,2-Ethanedithiol Sigma Aldrich 02390 Handle inside fume hood. Bleach gloves after usage.
Triisopropylsilane Sigma Aldrich 233781
Chloroform (anhydrous) Sigma Aldrich 288306
Hydrogen peroxide solution 30% Aaron Industries NA
HoBt-Cl Aaptec CXZ096
DIC Sigma Aldrich D125407
Female athymic nude mice (Nu/Nu strain), 6–8 weeks age Harlan (Livermore, CA)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, L., et al. Nanoparticles in medicine: therapeutic applications and developments. Clin. Pharmacol. Ther. 83, 761-769 (2008).
  2. Wang, A. Z., Langer, R., Farokhzad, O. C. Nanoparticle Delivery of Cancer Drugs. Annu. Rev. Med. 63, 185-198 (2012).
  3. Iyer, A. K., Khaled, G., Fang, J., Maeda, H. Exploiting the enhanced permeability and retention effect for tumor targeting. Drug Disc. Today Targets. 11, 812-818 (2006).
  4. Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles. Pharmacol. Rev. 64, 505-519 (2012).
  5. Kamaly, N., Xiao, Z., Valencia, P. M., Radovic-Moreno, A. F., Farokhzad, O. C. Targeted polymeric therapeutic nanoparticles: design, development and clinical translation. Chem. Soc. Rev. 41, 2971-3010 (2012).
  6. Li, Y. L., et al. Reversibly stabilized multifunctional dextran nanoparticles efficiently deliver doxorubicin into the nuclei of cancer cells. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 9914-9918 (2009).
  7. Miyata, K., et al. Block catiomer polyplexes with regulated densities of charge and disulfide cross-linking directed to enhance gene expression. J. Am. Chem. Soc. 126, 2355-2361 (2004).
  8. Chan, Y., Wong, T., Byrne, F., Kavallaris, M., Bulmus, V. Acid-labile core cross-linked micelles for pH-triggered release of antitumor drugs. Biomacromolecules. 9, 1826-1836 (2008).
  9. Rijcken, C. J., Snel, C. J., Schiffelers, R. M., van Nostrum, C. F., Hennink, W. E. Hydrolysable core-crosslinked thermosensitive polymeric micelles: synthesis, characterisation and in vivo studies. Biomaterials. 28, 5581-5593 (2007).
  10. Talelli, M., et al. Core-crosslinked polymeric micelles with controlled release of covalently entrapped doxorubicin. Biomaterials. 31, 7797-7804 (2010).
  11. Xiao, K., et al. A self-assembling nanoparticle for paclitaxel delivery in ovarian cancer. Biomaterials. 30, 6006-6016 (2009).
  12. Li, Y., et al. A novel size-tunable nanocarrier system for targeted anticancer drug delivery. J. Control. Release. 144, 314-323 (2010).
  13. Li, Y., et al. Well-defined, reversible disulfide cross-linked micelles for on-demand paclitaxel delivery. Biomaterials. 32, 6633-6645 (2011).
  14. Li, Y., et al. Well-defined, reversible boronate crosslinked nanocarriers for targeted drug delivery in response to acidic pH values and cis-diols. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51, 2864-2869 (2012).
  15. Li, Y., et al. A smart and versatile theranostic nanomedicine platform based on nanoporphyrin. Nat. Commun. 5, (2014).
  16. Belenki, B. G., Gankina, E. S. Thin-Layer chromatography of polymers. J. Chromatogr. A. 141, 13-90 (1977).
  17. Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).
  18. Pandey, P. S., Rai, R., Singh, R. B. Synthesis of cholic acid-based molecular receptors: head-to-head cholaphanes. J. Chem. Soc., Perkin Trans 1. , 918-923 (2002).
  19. Riddles, P. W., Blakeley, R. L., Zerner, B. Reassessment of Ellman's reagent. Methods Enzymol. 91, 49-60 (1983).
  20. Ahuja, S., Rasmussen, H. Overview of HPLC method development for pharmaceuticals. HPLC Method Development for Pharmaceuticals. , Separation Science and Technology; 8. Elsevier Academic Press Inc. 1-11 (2007).
  21. Li, Y., Pan, S., Zhang, W., Du, Z. Novel thermo-sensitive core-shell nanoparticles for targeted paclitaxel delivery. Nanotechnology. 20 (6), 065104 (2009).
  22. Kato, J., et al. Disulfide cross-linked micelles for the targeted delivery of vincristine to B-cell lymphoma. Mol. Pharm. 9, 1727-1735 (2012).
  23. Lu, S. C. Regulation of glutathione synthesis. Mol. Aspects Med. 30, 42-59 (2009).
  24. Xiao, K., et al. "OA02" peptide facilitates the precise targeting of paclitaxel-loaded micellar nanoparticles to ovarian cancer in vivo. Cancer Res. 72, 2100-2110 (2012).
  25. Koo, A. N., et al. Disulfide-cross-linked PEG-poly(amino acid)s copolymer micelles for glutathione-mediated intracellular drug delivery. Chem. Commun. 28, 6570-6572 (2008).
  26. McLellan, L. I., Wolf, C. R. Glutathione and glutathione-dependent enzymes in cancer drug resistance. Drug. Resist. Update. 2, 153-164 (1999).
  27. Karala, A. R., Lappi, A. K., Saaranen, M. J., Ruddock, L. W. Efficient peroxide-mediated oxidative refolding of a protein at physiological pH and implications for oxidative folding in the endoplasmic reticulum. Antioxid. Redox Signal. 11, 963-970 (2009).
  28. Gabizon, A., et al. Cancer nanomedicines: closing the translational gap. Lancet. 384, 2175-2176 (2014).
  29. Nanotrac Nanotechnology Particle Size Measurement Solutions. , Available from: http://www.vahitech.com/Assets/Nano(US)Web.pdf (2006).

Tags

Biokjemi nanopartikler levering av legemidler miceller telodendrimer disulfid kryssbinding hydrogenperoksid-mediert oksidasjon
En Facile og effektiv tilnærming for produksjon av Reversibel disulfide tverrbundet Miceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Y., Bharadwaj, G., Lee, J. S. A… More

Li, Y., Bharadwaj, G., Lee, J. S. A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles. J. Vis. Exp. (118), e54722, doi:10.3791/54722 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter