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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Uma abordagem fácil e eficiente para a produção de micelas reversível Disulfide Cross-linked

Published: December 23, 2016 doi: 10.3791/54722
Automatic Translation
1,2, 1, 3
1Department of Biochemistry & Molecular Medicine, University of California, Davis, 2UC Davis Comprehensive Cancer Center, University of California, Davis, 3Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of California, Davis

Abstract

Nanomedicina é uma forma emergente da terapia que utiliza as propriedades únicas de partículas que são nanómetros em escala para aplicação biomédica. Melhorar a entrega da droga para maximizar os resultados terapêuticos e para reduzir os efeitos colaterais associados ao fármaco são alguns dos pilares da atual nanomedicina. As nanopartículas, em particular, têm encontrado uma ampla aplicação no tratamento do câncer. Nanopartículas que oferecem um alto grau de flexibilidade no desenho, aplicação e produção com base no microambiente do tumor são projetados para ser mais eficaz com tradução rápida para a prática clínica. O micelar nano-veículo polimérico é uma escolha popular para aplicações de entrega de drogas.

Neste artigo, descreve-se um protocolo simples e eficaz para sintetizar, micelas reticuladas de dissulfureto carregadas com fármaco com base na auto-montagem de um copolímero anfifílico bem definida linear-dendrítica (telodendrimer, TD). TD é composta de polietileno glycol (PEG) como o segmento hidrofílico e um agrupamento de ácido eólico tiolado como a porção hidrofóbica por passos em anexo para formação de núcleo a um PEG terminado por amina usando química de péptidos à base de solução. drogas de quimioterapia, tais como paclitaxel (PTX), pode ser carregada utilizando um processo de evaporação de solvente padrão. O 2 a oxidação mediada foi previamente utilizado para formar dissulfeto ligações cruzadas intra-micelares de grupos tiol livres no TDs. No entanto, a reacção foi lento e não é viável para produção em larga escala. Recentemente, um método de oxidação de H 2 O 2 foi explorada como mediada por uma abordagem mais viável e eficiente, e que era 96 vezes mais rápido do que o método previamente relatado. Utilizando esta abordagem, 50 g de PTX-carregadas, nanopartículas reticuladas de dissulfureto ter sido produzido com sucesso, com distribuição de tamanho de partículas estreita e alta eficiência de carregamento de drogas. A estabilidade da solução de micelas resultante é analisada utilizando condições perturbadoras tais como co-incubação wom um dodecil sulfato de detergente, de sódio, com ou sem um agente redutor. As micelas, reticuladas de dissulfureto carregadas com fármaco demonstrou uma actividade menos hemolítica quando comparada com os seus homólogos não-reticulados.

Introduction

A nanotecnologia é um campo de fast-emergente que tem beneficiado um número de áreas biomédicas 1. Nanopartículas fornecer oportunidades para desenhar e ajustar as propriedades que não são viáveis ​​com outros tipos de agentes terapêuticos convencionais. Nano-transportadores aumentar a estabilidade dos medicamentos contra a biodegradação, prolongar o tempo de circulação da droga, superar problemas de solubilidade de drogas, e podem ser afinadas para a entrega de drogas específicas e para os agentes de imagem co-entrega de 1,2. sistemas de entrega baseados em nanopartículas promissoras em imagiologia e tratamento do câncer. Vasculaturas tumorais são permeável a macromoléculas e podem levar a uma acumulação preferencial de nanopartículas que circula nos locais de tumores por meio da permeabilidade aumentada e retenção (EPR) 3 efeito. Entre os vários nano-transportadores (por exemplo, lipos somas, hidrogeles, e micelas poliméricas) que estão a ser activamente prosseguidas como transportadores para drogas anti-cancro, micelas poliméricas têm ganho grande popularidade sobre o the última década 4,5.

As micelas poliméricas são um sistema termodinâmico que, por administração intravenosa, potencialmente, pode ser diluído abaixo da concentração crítica de micelas (CMC), levando a sua dissociação em unimers. estratégias de cross-linking têm sido empregadas para minimizar a dissociação micelar em unimers. No entanto, as micelas excessivamente estabilizadas podem impedir o fármaco de libertação de nos locais alvo, reduzindo assim a eficácia terapêutica global. Várias abordagens químicas foram exploradas para fazer a ligação cruzada degradável em resposta ao redox ou a estímulos externos, tais como ligações dissulfureto redutível 6,7 e pH 8 clivável ou éster hidrolisável ligações 9,10.

Descrevemos previamente a concepção e síntese de nanopartículas micelares que consiste em ácido eólico dendrítica (CA) e polietileno linear de blocos de glicol (PEG), copolímeros de referido como telodendrimers (TD) 15/11 nK -CAy (onde n = peso molecular em quilodaltons (k), y = número de ácido eólico (CA) unidades). Eles são caracterizados pela sua pequena dimensão, longa vida de prateleira, e alta eficiência na drogas encapsulando tal como paclitaxel (PTX) e doxorrubicina (DOX) no núcleo hidrofóbico. Os blocos de construção da TD, tais como PEG, lisina, e CA, são biocompatíveis, e a presença de uma coroa de PEG pode conferir um carácter nanopartícula "stealth", evitando a absorção não específica de nanopartículas micelares pelos sistemas reticuloendoteliais.

polímeros lineares-dendrítica tiolada pode ser facilmente gerado através da introdução de cisteínas para a coluna vertebral de oligo-lisina dendrítica da nossa DT padrão. Este artigo apresenta um protocolo fácil para a produção de um sistema de entrega de droga micelar reversivelmente reticulado através da introdução de ligações cruzadas dissulfureto dentro do núcleo hidrofóbico de DT (Figura 1).

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Protocol

declaração de ética: ratinhos nus atímicos fêmea (estirpe nu / nu), 6-8 semanas de idade, foram adquiridos e, em seguida, mantidos sob condições isentas de patogénios de acordo com as orientações da AAALAC e foram deixados a aclimatar durante pelo menos 4 dias antes de qualquer experimentos. Todos os experimentos com animais foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais e de acordo com o protocolo nº 07-13119 e nº 09-15584, aprovado pelo Uso de Animais e Comité Consultivo Cuidados Administrativo na Universidade da Califórnia, Davis.

1. Síntese de TD PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8

  1. Em um balão de fundo redondo, dissolvem MeO-PEG 5 K-NH2 (2 g, 0,4 mmol) em 10-20 ml de dimetilformamida anidra (DMF) e arrefecer em gelo.
  2. Em um copo de vidro, dissolver-se 3 equiv. de 1-hidroxi-6-cloro-benzotriazol (HOBt), 3 equiv. de N, N '-diisopropilcarbodiimida (DIC), e 3 equiv. de (Fmoc) 2 Lys-OH em D anidroMF (10-15 ml). Agita-se durante 15-20 minutos numa placa de agitação magnética.
  3. Adicionar a mistura ao balão de reacção que contém o MeO-PEG 5K -NH 2. Remover o banho de gelo e agita-se a mistura reaccional durante a noite à temperatura ambiente.
  4. Confirmar a conclusão da reacção por cromatografia em camada fina (TLC), 16 e 17 de teste de Kaiser (uma cor amarela indica a ausência de livre NH2). Precipitar o produto polimérico 1 (MeO-PEG 5K-Lys (Fmoc-NH 2)), adicionando cerca de 200 ml de éter arrefecido com gelo para o frasco de reacção. Separa-se o polímero precipitado por centrifugação (6 min a 6000 xg e 4 ° C).
    1. Para executar TLC, manchar as amostras em placas de TLC de gel de sílica revestidas. Use diclorometano / metanol (9: 1) como a fase móvel. Observar pontos sob uma lâmpada UV depois de desenvolver as placas de TLC. Pode-se também utilizar reagente de coloração de ninidrina para visualizar locais de amina em uma placa quente.
    2. para Kaiteste de Sor, coloque um pouco da amostra no tubo de vidro contendo o reagente de Kaiser. Aquecê-la a 100 ° C durante 5 min e olhar para a mudança de cor (se a cor da solução permanecer amarela, em seguida, a reacção está completa).
  5. Re-dissolve-se o produto no seio de DMF anidro (10-20 ml) e repetir a precipitação e centrifugação (ver passo 1.4).
  6. Repetir o passo 1.5, e, em seguida lavar o precipitado de polímero três vezes com éter arrefecido com gelo.
  7. Transferir o precipitado de polímero 1 a um balão de reacção limpo e ligar o balão a uma fonte de vácuo elevado para remover o éter residual.
  8. Preparar e adicionar cerca de 20-30 mL de 20% (v / v) de 4-metilpiperidina no seio de DMF para um polímero intermediário. Agita-se até à dissolução completa. Executar a reacção durante 3 h.
  9. Execute TLC 16 e teste de Kaiser (a cor azul confirma a presença de livre NH 2) 17 (veja o passo 1.4) para confirmar a completioN da reacção. Se a reacção está completa, proceder à precipitação éter, como mencionado para o produto de 1 (passos 1,4-1,6).
  10. Seca-se o produto polimérico 2 (MeO-PEG 5K-Lys (NH2) 2) sob um vácuo.
  11. Levar a cabo mais uma ronda de (Fmoc) 2-OH Lys-acoplamento no intermediário 2 (passos 1,1-1,7) para gerar o produto 3 (MeO-PEG 5K-Lys (Lys (NH-Fmoc) 2) 2). De proteger-(passos 1,8-1,10) os grupos Fmoc (4, MeO-PEG 5K-Lys (Lys (NH2) 2) 2) e pares (passos 1,1-1,7) o (Fmoc) Lis (Boc) -OH A gerar uma polilisina dendrítica da terceira geração (5, MeO-PEG 5k-Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys (Boc)) 4) terminado com quatro grupos Boc e Fmoc sobre uma extremidade da cadeia PEG.
  12. Transferir o polímero resultante intermediário 5 num frasco de reacção. em quantobalão de reacção eparate, preparar a 1: 1 (v / v) de ácido trifluoroacético (TFA) em diclorometano (DCM). Adicionar 15-20 mL de uma mistura 1: 1 de TFA / DCM (v / v) para o polímero intermediário 5. Agita-se a mistura até o polímero estar completamente dissolvido. Agita-se durante mais 3 horas.
  13. Realizar TLC 16 e o teste de Kaiser (uma cor azul confirma a presença de NH livre 2) 17 (ver passo 1.4) para confirmar a conclusão da reacção. Se a reacção está completa, evapora-se a mistura de polímero-em-TFA / DCM com ar, até ser obtida uma solução viscosa. Proceder à precipitação éter, como mencionado para o produto 1 (passos 1,4-1,6). Seca-se o produto polimérico 6 (MeO-PEG 5k-Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys (NH2)) 4) sob um vácuo.
  14. Polímero de transferência intermédia 6 para um balão de reacção. Usar cerca de 40 ml de DMF anidro contendo 8 equiv. de N, N -diisopropylethylamine (DIEA) para dissolver o polímero intermediário 6. Em um copo de vidro, dissolver 12 equiv. de HOBt, 12 equiv. de DIC, e 12 equiv. de (Fmoc) Cys (Trt) -OH, em 20-25 ml de DMF anidro. Agitar durante 10-15 min, e, em seguida, adicionar a mistura de reacção para o balão de reacção contendo 6. Executar a reacção durante a noite.
  15. Confirmar a conclusão da reacção com o TLC 16 e teste de Kaiser (veja o passo 1.4, uma cor amarela indica a ausência de livre NH 2) 17. Se a reacção está completa, proceder à precipitação éter, como mencionado para o produto de 1 (passo 1,4-1,6), para isolar o produto 7 (MeO-PEG-Lys-Lys 5K 2 - ((Fmoc) Lys - ((Fmoc) Cys (Trt))) 4.
  16. Realizar-Fmoc de protecção no dia 7, como descrito na etapa 1.8, para se obter o produto 8 (PEG 5K-Lys-Lys 2 - (Lys (NH2) - (Cys (NH2) (Trt))) 4). Casal (Fmoc) PEG 2 -Suc-OH ( "Ebes" ligante, 24 equiv.) Num intermediário de acoplamento utilizando o procedimento descrito acima para o polímero HOBt / DIC-mediada para se obter o intermediário 9 (MeO-PEG 5K-Lys-Lys-Lys 2 4 - (Cys (Trt) ) 4 (Ebes (NH-Fmoc)) 8).
  17. Realizar mais uma ronda de Fmoc desprotecção (passos 1,6-1,8) para obter intermediário 10 (MeO-PEG 5K-Lys-Lys-Lys 2 4 - (Cys (Trt)) 4 (Ebes (NH2)) 8).
  18. Transferir o polímero intermediário 10 em um frasco de reacção e adicionar DMF anidro (cerca de 30-40 mL) para o dissolver. Num outro balão de reacção, dissolve-se 24 equiv. de CAOSu (preparado de acordo com o procedimento publicado anteriormente) em DMF anidro (20-30 ml) 18. Adicionar 48 equiv. de N, N-diisopropiletilamina e deixou-agita-se durante 10-15 min. Transferir o conteúdo para o balão de reacção que contém 10 e deixe correr a reacção overnight.
  19. Confirmar a conclusão da reacção por TLC com 16 e o teste de Kaiser (ver passo 1.4; uma cor amarela indica a ausência de livre NH2) 17. Se a reacção está completa, proceder à precipitação éter, como mencionado para o produto de 1 (passos 1,4-1,6) para isolar o produto 11 (MeO-PEG 5K-Lys-Lys-Lys 2 4 - (Cys (Trt)) 4 -Ebes 8 -CA 8). Dialisar-o em água desionizada e liofilizar a amostra para se obter um pó branco.
  20. Colocar o polímero intermediário 11 em um frasco de reacção. Preparar e adiciona-se 20 ml de TFA / 1,2-etanoditiol (EDT) / trietilsilano (TIS) / H 2 O (94 / 2,5 / 1 / 2,5, v / v) de mistura na solução de polímero. Agita-se a mistura até à dissolução completa. Executar a mistura reaccional durante 4 h. Confirmar a conclusão da reacção por TLC 16.
  21. Sob o capô fume, soprando ar para dentro do polímero TFA / EDT / TIS / H 2O mistura até a solução se tornar viscosa. Proceda à precipitação éter, como mencionado para o produto de 1 (passos 1,4-1,6), para isolar o produto final, de 12 (PEG 4 5K Cys -Ebes 8 -CA 8). Dissolve-o em acetonitrilo e liofilizar-lo para se obter um pó branco.

2. Preparação de micelas de PTX-carregados

  1. Prepara-se uma PTX-carregado PEG 5K Cys -Ebes 4 8 8 -CA micela utilizando o método de evaporação do padrão.
    1. Dissolve-se 20 mg de TD com uma quantidade diferente de PTX (1-9 mg) em 1 ml de clorofórmio (CHCl 3). Remover o solvente utilizando um evaporador rotativo para se obter um filme de polímero homogéneo, seco. Reconstituir o filme com 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) por vórtice, seguido de sonicação durante 30 min a 40 kHz, se necessário, para permitir a formação de micelas carregadas com fármaco.
    2. Adicionar 6 ul de 3% (w / w) de H 2 O 2 (1 equiv. A Peee os grupos tiol) para oxidar os grupos tiol na TD. Usar a solução micelar para caracterização adicional uma vez que o nível de grupos tiol livres permanece a baixos valores de constantes, como indicado pelo teste 19 de Ellman.
    3. Filtra-se a solução com um filtro de 0,22 uM para esterilizar a amostra. Analisar a quantidade de fármaco carregada nas micelas em um 20 sistema de HPLC depois de libertar a droga a partir das micelas através da adição de 9 vezes de acetonitrilo e realizando 10 minutos de sonicação. Usar uma coluna C18 para HPLC com acetonitrilo / água como fase móvel.
    4. Calcula-se a carga de fármaco de acordo com a curva de calibração entre os valores de área de HPLC e as concentrações da droga de referência 11.
      NOTA: A eficiência de carga é definido como a proporção de fármaco carregados nas micelas para o conteúdo de medicamento inicial.

3. Caracterizações de micelas

  1. Medir a distribuição do tamanho e dimensão da micelles com um instrumento de espalhamento dinâmico de luz (DLS) 29. Efectuar as medições à temperatura ambiente e manter a concentração de micelas a 1 mg / ml.
    NOTA: Para realizar a análise de tamanho de partícula, use PBS como em branco, e depois gravar o tamanho de partícula para amostras reais. Tome as leituras em triplicado para amostras, e depois calcular a média das leituras.
  2. Use espectros de fluorescência para medir a concentração micelar crítica (CMC) de PEG-Cys 5K 4 -Ebes 8 -CA 8, antes e depois de reticulação com pireno como sonda fluorescente hidrofóbica, tal como descrito anteriormente 13,21.
    NOTA: Tipicamente, a concentração de micelas varia de 5 x 10 -7 a 5 x 10 -4 M.

4. Estabilidade de micelas de SDS com ou sem agentes redutores

  1. Preparar soluções stock de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) a solução (7,5 mg / ml) e dissulfureto de micelas reticuladas (1,5 mg / ml) em PBS. Em seguida, ucantar as soluções de reserva, fazer uma mistura de solução em que a concentração final de SDS é de 2,5 mg / ml e a concentração de micela é de 1,0 mg / ml.
  2. Medir a distribuição do tamanho e tamanho (tal como mencionado no passo 3.1) das soluções micelares, a intervalos de tempo predeterminados, com ou sem a presença de 10 mM de glutationa (GSH).

Ensaio 5. A hemólise

  1. Avaliar o potencial hemolítico de micelas PTX-carregado, não-reticulada (PTX-NCMS) preparado de acordo com o procedimento previamente publicado em 11 e micelas reticuladas PTX-carregados (PTX-DCMs) utilizando sangue citratado fresco de ratinhos nus recolhido a partir da véu cauda.
    1. Recolher as células vermelhas do sangue por centrifugação da amostra de sangue (1,0 ml) a 1000 xg durante 10 min, lavagem três vezes com PBS, e em seguida, re-suspender as pelotas celulares com PBS a uma concentração final de 2%.
  2. Misturar 200 ul de suspensão de eritrócitos com concentrações diferentes (0,2 e 1,0mg / ml) de PTX-NCMs e PTX-DCMs, respectivamente, e incubar durante 4 horas a 37 ° C num agitador de incubador.
  3. Centrifugar as misturas de micelas-eritrócitos a 3000 xg durante 5 min. Transferir 100 ul do sobrenadante de todas as amostras para uma placa de 96 poços. Medir a absorvância da hemoglobina livre no sobrenadante a 540 nm usando um leitor de microplacas.
    NOTA: As hemácias incubadas com Triton-100 (2%) e PBS são para ser utilizados como os controlos positivos e negativos, respectivamente. A hemólise por cento das hemácias é calculada com a seguinte fórmula: = hemólise de RBC (amostra OD - OD de controlo negativo) / (OD controlo positivo - controlo negativo OD) x 100%.

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Representative Results

Preparação e caracterização de, micelas Disulfide Cross-linked carregado com a droga

Anfifílicos de polímero de PEG-Cys 5K 4 -Ebes -CA 8 8 é um polímero dendrítico, capaz de formar um sistema micelar dissulfureto reticulado para a entrega de drogas do cancro. Estruturalmente, que é definido como um oligómero dendrítica de ácidos eólicos (domínio hidrofóbico) ligadas a uma extremidade da molécula de PEG linear (domínio hidrófilo, peso molecular 5K) através de um poli ramificado (lisina-cisteína-Ebes) espinha dorsal. Há várias vantagens de usar estes copolímeros em bloco em relação a outros sistemas micelares relatados. Em primeiro lugar, pode ser facilmente sintetizados por meio de reacções de condensação em fase de solução por passos. Em segundo lugar, em comparação com vários outros polímeros anfifílicos relatado, o sistema de polímero, preparados por meio de tiolado bem estabelecida em fase de solução escalonada química de péptidos de Fmoc, tem uma estrutu bem definidaré. Ele pode ser armazenado na forma de pó liofilizado e tem uma vida útil prolongada.

Várias técnicas podem ser utilizadas para caracterizar o produto final. A quantidade de ácido eólico ligada a TD pode ser detectada através da comparação da relação sinal dos protões no PEG para aqueles nos três grupos metílicos de ácido eólico no espectro de 1 H RMN. Os pesos moleculares da TD pode ser confirmado por cromatografia de permeação de gel e espectrometria de massa MALDI-TOF (GPC). O teste de Ellman quantitativa podem ser usadas para decifrar o número de resíduos de cisteína livres presentes por molécula.

PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 pode auto-montar para formar micelas em meio aquoso. Usando um método de evaporação de solvente padrão, uma variedade de fármacos hidrófobos, tais como a PTX e vincristina, foram encapsulados com êxito nas micelas 13,22. OxygPT foi anteriormente utilizado para oxidar os grupos tiol livres de PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 e dissulfureto para formar ligações cruzadas intra-micelares. Como monitorizado pelo teste de Ellman, a taxa de conversão dos grupos tiol livres de ligações dissulfureto atingiu 85% depois de 48 horas de oxidação. AH 2 O 2 mediada por oxidação foi recentemente utilizada como um método alternativo. A taxa de conversão atingiu 88% em 30 min (Figura 2), que foi 96 vezes mais rápido do que a abordagem anterior. Cinquenta gramas de PTX-carregado, dissulfureto nanopartículas reticulados foram produzidas com sucesso utilizando esta abordagem mais eficiente (Figura 3). O tamanho de partícula era de cerca de 27 nm, com uma distribuição de tamanhos estreita (Figura 3). A eficiência de carga de droga se aproximou de 100% com PTX carga de 4,0 mg / ml. Dissulfureto de reticulação teve um efeito dramático sobre o valor de CMC. Em comparação com o padrão TD PEG 5K -CA 8 que carecemligações dissulfureto, o DT de ligação cruzada mostraram uma redução de 10 vezes nos valores observados CMC (5,53 uM em comparação com 0,67 ^ M) 13.

Estudos de estabilidade

Nós investigamos ainda mais a estabilidade da PTX-carregados, micelas reticulados dissulfeto contra condições severas de desregulação micelas. dodecilsulfato de sódio (SDS) é um forte detergente iónico que é normalmente utilizado para avaliar a estabilidade micelar, como pode eficientemente quebrar micelas poliméricas. A estabilidade das micelas, reticuladas de dissulfureto carregadas com fármaco (1,0 mg / ml) foi monitorizada por DLS na presença de SDS-perturbar micelar (2.5 mg / ml). O tamanho das partículas das micelas manteve-se estável ao longo do tempo, indicando que tais micelas reticuladas permaneceu intacta (Figura 4, painéis esquerdos). espera-se que as condições redutoras para clivar ligações persulfureto no núcleo hidrófobo, terapeby fazendo micelas sensíveis à desestabilização. A glutationa (GSH), um agente de redução endógenos, é muitas vezes empregada para tais estudos. Há grande contraste no nível intracelular de GSH em comparação com o nível extracelular (10 mm versus 2 uM). Esta diferença nas concentrações é muitas vezes usado para gerar sistemas de estímulos responsivos. Após a adição de GSH a uma concentração intracelular (10 mm), 23, o tamanho das micelas, reticuladas de dissulfureto carregadas com fármaco permaneceram intactas durante 30 min. Eles abruptamente diminuiu para 1 nM, indicando a redução de um número crítico de ligações dissulfureto, um pré-requisito para a rápida dissociação das micelas (Figura 4, painel da direita). Pelo contrário, o sistema manteve-se estável na presença de concentrações extracelulares de GSH (dados não mostrados).

Estudo hemólise

Figura5 mostra as diferenças na atividade hemolítica observada de micelas PTX-carregados, com ou sem dissulfeto de cross-linking. A hemólise dos glóbulos devem ser evitados quando se administram estas partículas para a corrente sanguínea, uma vez que prejudica as suas vantagens terapêuticas. Hemato-compatibilidade é muito importante para a aplicação in vivo de transportadores de fármacos à base de polímeros, tais como o TDS anfifílicos que têm o potencial para solubilizar os lípidos ou para inserir-se em membranas de fosfolípidos, levando à ruptura das membranas plasmáticas. Como mostrado na Figura 5, a PTX-NCMs foram encontrados a ter uma célula de sangue vermelho, dependente da dose (RBC) contagem de lise, com a percentagem de hemólise aumento de 8,1% a 14,2% como sendo a concentração de PTX-NCMs aumentou de 0,2 mg / ml a 1,0 mg / ml. No entanto, a PTX-DCMs que têm dissulfureto de reticulação não mostraram actividades observáveis ​​hemolíticas (<1,0%) nos glóbulos vermelhos sob as mesmas condições experimentais. Esta diferença nos hemolysé tendência pode ser atribuído às pontes dissulfureto intra-micelar presentes no núcleo hidrofóbico, que impedem que a PTX-DCMs de dissociação para formar DT anfifílico.

figura 1
Figura 1: Passos para formar micelas reticulados. Representação esquemática das micelas reticulados dissulfureto formadas por oxidação dos tiolado telodendrimer PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 após a auto-montagem. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: métodos de oxidação para formação de micelas de ligação cruzada. A taxa de conversão de tele tiol grupos sobre o TDS de dissulfureto títulos como uma função do tempo de oxidação para os dois métodos de oxidação. A concentração total das micelas foi mantida a 20 mg / ml. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3:, micelas reticulado carregado com a droga. Painel esquerdo: uma imagem de um lote de PTX-carregados, micelas reticulados dissulfeto. Barra de escala: 1 polegada. Painel da direita: o tamanho de partícula, tal como determinado por dispersão de luz dinâmica (DLS). A concentração total de micelas foi mantida a 20 mg / ml. O carregamento de PTX foi de 4 mg / ml. Os dados de tamanho de partícula foi mostrado como o tamanho de partícula médio ± SD com base em três medições. DP: desvio padrão, descreve a largura da distribuição do tamanho de partícula medido.Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: Estudo de estabilidade. O tamanho de partícula de PTX-carregadas, micelas reticuladas de dissulfureto na presença de 2,5 mg / ml de SDS sem (esquerda) ou com (direita) de GSH (10 mM), tal como medido por DLS. Os dados de tamanho de partícula foi mostrado como o tamanho de partícula médio ± SD com base em três medições. DP: desvio padrão, descreve a largura da distribuição do tamanho de partícula medido. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5: Ensaio de hemólise. As actividades in vitro hemolíticas de PTX-carregadas, micelas reticuladas de dissulfureto em comparação com micelas não reticulados nas células vermelhas do sangue (RBC). Triton-100 (2%) e PBS foram usados ​​como controlos positivos e negativos, respectivamente. Os valores relatados são a média ± desvio padrão de amostras em triplicado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Vários nanopartículas têm sido investigados por seu uso potencial na entrega da droga. doxorrubicina lipossomal e paclitaxel (PTX) -loaded de albumina de soro de nano-agregados humanos estão entre os Nanotherapeutics aprovados pela FDA para o tratamento do cancro. No entanto, embora clinicamente eficaz, ambos estes Nanotherapeutics são relativamente "grande" em tamanho, e que tendem a acumular-se no fígado e pulmões. As micelas poliméricas com tamanhos de partículas relativamente menores e capacidades de carga de droga mais elevadas são nanocarriers para entrega da droga emergente. A sua estrutura original de núcleo-revestimento '' solubilizar '' das moléculas de droga hidrofóbica em condições aquosas por encapsulamento física. As micelas poliméricas compostas de DT bem definidas preparados no Formulário laboratório nanopartículas monodispersas (10-50 nm de tamanho de partícula) com um período de vida longo e elevada eficiência em que encapsulam fármacos. Uma das muitas vantagens da plataforma TD robustos é a versatilidade do polímero.Numerosas drogas, corantes fluorescentes, e ligandos de segmentação pode ser facilmente incorporado na plataforma TD 13,15,24.

Passos críticos dentro do Protocolo

Nós desenvolvemos um sistema robusto, reversível, o dissulfureto reticulado micela para entrega PTX, o qual é bem definido, com um tamanho de partícula de cerca de 27 nm, e tem uma distribuição de tamanho estreita. As DTs foram sintetizados por meio de solução gradual da química de péptidos em fase. A estrutura química bem definida destes TDS é o factor-chave para gerar nanopartículas com as propriedades desejadas. Portanto, o que confirma a conclusão da reacção com o teste de Kaiser e TLC é muito crítico. O H 2 O 2 a oxidação também é um passo crítico, os grupos tiol na TD são oxidados para formar as ligações dissulfureto cruzadas, que aumentam grandemente a estabilidade das micelas. Em comparação com o nosso método de oxidação à base de oxigénio anterior, o H 2 O 2 -método de oxidação com base é 96 vezes mais rápido, proporcionando, assim, micelas reticuladas em períodos de tempo mais curtos. Além disso, a GSH, um tripéptido que contém tiol, é um importante anti-oxidante produzido pelas células, e que desempenha um papel importante na eliminação de radicais livres e os compostos reactivos de oxigénio. Faz grandes contribuições de manutenção da homeostase redox celular. A concentração celular da GSH é um aspecto interessante da concepção de fármacos. A concentração intracelular de GSH é agora firmemente estabelecida como sendo substancialmente maior do que a concentração extracelular (10 mM versus 2 uM, respectivamente) 25. Mais importante ainda, um nível de GSH intracelular elevada tem sido frequentemente relatado em muitas células de tumores humanos e de murino resistentes a drogas 26. A elevada distribuição intracelular de GSH facilita a quebra do dissulfureto de reticulação das micelas e resulta na libertação e a acumulação da carga útil de droga. As nanopartículas reticulados são dissulfuretoestável na presença de SDS. No entanto, um ambiente intracelular rica em GSH provoca a libertação do fármaco por quebrar as ligações dissulfureto, desestabilizando assim o sistema. hemólise induzida por polímero resultante da interacção prejudicial de micelas poliméricas com os constituintes do sangue, tais como as células vermelhas do sangue. micelas de ligação cruzada mostraram muito menos hemólise em comparação com os análogos não-reticulados.

Modificações e resolução de problemas

Utilizando H 2 O 2 como um agente oxidante permite um dissulfureto mais eficiente formação de ligações cruzadas, quando comparado com o, método à base de oxigénio anteriormente relatado 13. H 2 O 2 é um agente oxidante forte 27 que é de baixo custo e altamente solúvel em água e dá produtos de alta qualidade em comparação com alguns outros agentes de oxidação conhecidos (por exemplo, cromato ou permanganato). No entanto, o tempo de oxidação podem necessitar de ser furtheR optimizada com base na escala da síntese.

Limitações da técnica

H 2 O 2 é um oxidante forte. Mesmo que uma baixa concentração de H 2 O 2 é utilizado para a realização da formação de dissulfureto inter-ligação, cuidado deve ser tomado quando se utiliza com DT carregadas com drogas "sensíveis à oxidação" para evitar a degradação de drogas indesejável.

Importância da Técnica em Matéria de Existentes / Métodos Alternativos

A técnica descrita é uma instalação experimental simples que podem ser facilmente replicadas num laboratório padrão. Por exemplo, a carga de fármaco utilizando um processo de evaporação de padrão consome menos tempo em comparação com o método de diálise. A formação de dissulfureto no núcleo utilizando H 2 O 2 como o agente de oxidação é 96 vezes mais rápido do que o método de oxidação anteriormente relatado usando Oxygen 13. A reprodutibilidade da etapa de droga-carregamento pode ser facilmente avaliada através da medição do tamanho das partículas (método DLS) e teor de fármaco (HPLC).

Aplicações futuras ou chegar depois de dominar esta técnica

Comparado com drogas de pequenas moléculas, um dos principais obstáculos que precisam ser superados antes nano-medicamento pode digitar as configurações de cuidados de câncer mainstream é os desafios técnicos da expansão da produção 28. Depois de dominar esta técnica recentemente desenvolvida, pode-se facilmente sintetizar dissulfureto micelas reticuladas em grande escala. Isto é extremamente desejável para os estudos clínicos do presente nano-formulação em pacientes humanos.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
MeO-PEG5K-NH2 Rapp Polymere 125000-2
Fmoc-Lys(Fmoc)-OH Aaptec AFK107
Fmoc-Lys(Boc)-OH Anaspec AS-20132
Fmoc-Cys(Trt)-OH Aapptec AAC105
Dimethylformamide Fisher Scientific BP1160-4
Ethyl ether Fisher Scientific E134-20
N,N-Diisopropylethylamine Sigma Aldrich D125806
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich T6508 Corrosive, handle with care
4-methyl piperidine Alfa-Aesar L-02709
Ebes linker Anaspec AS-61924
Cholic acid Sigma Aldrich C1129
1,2-Ethanedithiol Sigma Aldrich 02390 Handle inside fume hood. Bleach gloves after usage.
Triisopropylsilane Sigma Aldrich 233781
Chloroform (anhydrous) Sigma Aldrich 288306
Hydrogen peroxide solution 30% Aaron Industries NA
HoBt-Cl Aaptec CXZ096
DIC Sigma Aldrich D125407
Female athymic nude mice (Nu/Nu strain), 6–8 weeks age Harlan (Livermore, CA)

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References

  1. Zhang, L., et al. Nanoparticles in medicine: therapeutic applications and developments. Clin. Pharmacol. Ther. 83, 761-769 (2008).
  2. Wang, A. Z., Langer, R., Farokhzad, O. C. Nanoparticle Delivery of Cancer Drugs. Annu. Rev. Med. 63, 185-198 (2012).
  3. Iyer, A. K., Khaled, G., Fang, J., Maeda, H. Exploiting the enhanced permeability and retention effect for tumor targeting. Drug Disc. Today Targets. 11, 812-818 (2006).
  4. Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles. Pharmacol. Rev. 64, 505-519 (2012).
  5. Kamaly, N., Xiao, Z., Valencia, P. M., Radovic-Moreno, A. F., Farokhzad, O. C. Targeted polymeric therapeutic nanoparticles: design, development and clinical translation. Chem. Soc. Rev. 41, 2971-3010 (2012).
  6. Li, Y. L., et al. Reversibly stabilized multifunctional dextran nanoparticles efficiently deliver doxorubicin into the nuclei of cancer cells. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 9914-9918 (2009).
  7. Miyata, K., et al. Block catiomer polyplexes with regulated densities of charge and disulfide cross-linking directed to enhance gene expression. J. Am. Chem. Soc. 126, 2355-2361 (2004).
  8. Chan, Y., Wong, T., Byrne, F., Kavallaris, M., Bulmus, V. Acid-labile core cross-linked micelles for pH-triggered release of antitumor drugs. Biomacromolecules. 9, 1826-1836 (2008).
  9. Rijcken, C. J., Snel, C. J., Schiffelers, R. M., van Nostrum, C. F., Hennink, W. E. Hydrolysable core-crosslinked thermosensitive polymeric micelles: synthesis, characterisation and in vivo studies. Biomaterials. 28, 5581-5593 (2007).
  10. Talelli, M., et al. Core-crosslinked polymeric micelles with controlled release of covalently entrapped doxorubicin. Biomaterials. 31, 7797-7804 (2010).
  11. Xiao, K., et al. A self-assembling nanoparticle for paclitaxel delivery in ovarian cancer. Biomaterials. 30, 6006-6016 (2009).
  12. Li, Y., et al. A novel size-tunable nanocarrier system for targeted anticancer drug delivery. J. Control. Release. 144, 314-323 (2010).
  13. Li, Y., et al. Well-defined, reversible disulfide cross-linked micelles for on-demand paclitaxel delivery. Biomaterials. 32, 6633-6645 (2011).
  14. Li, Y., et al. Well-defined, reversible boronate crosslinked nanocarriers for targeted drug delivery in response to acidic pH values and cis-diols. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51, 2864-2869 (2012).
  15. Li, Y., et al. A smart and versatile theranostic nanomedicine platform based on nanoporphyrin. Nat. Commun. 5, (2014).
  16. Belenki, B. G., Gankina, E. S. Thin-Layer chromatography of polymers. J. Chromatogr. A. 141, 13-90 (1977).
  17. Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).
  18. Pandey, P. S., Rai, R., Singh, R. B. Synthesis of cholic acid-based molecular receptors: head-to-head cholaphanes. J. Chem. Soc., Perkin Trans 1. , 918-923 (2002).
  19. Riddles, P. W., Blakeley, R. L., Zerner, B. Reassessment of Ellman's reagent. Methods Enzymol. 91, 49-60 (1983).
  20. Ahuja, S., Rasmussen, H. Overview of HPLC method development for pharmaceuticals. HPLC Method Development for Pharmaceuticals. , Separation Science and Technology; 8. Elsevier Academic Press Inc. 1-11 (2007).
  21. Li, Y., Pan, S., Zhang, W., Du, Z. Novel thermo-sensitive core-shell nanoparticles for targeted paclitaxel delivery. Nanotechnology. 20 (6), 065104 (2009).
  22. Kato, J., et al. Disulfide cross-linked micelles for the targeted delivery of vincristine to B-cell lymphoma. Mol. Pharm. 9, 1727-1735 (2012).
  23. Lu, S. C. Regulation of glutathione synthesis. Mol. Aspects Med. 30, 42-59 (2009).
  24. Xiao, K., et al. "OA02" peptide facilitates the precise targeting of paclitaxel-loaded micellar nanoparticles to ovarian cancer in vivo. Cancer Res. 72, 2100-2110 (2012).
  25. Koo, A. N., et al. Disulfide-cross-linked PEG-poly(amino acid)s copolymer micelles for glutathione-mediated intracellular drug delivery. Chem. Commun. 28, 6570-6572 (2008).
  26. McLellan, L. I., Wolf, C. R. Glutathione and glutathione-dependent enzymes in cancer drug resistance. Drug. Resist. Update. 2, 153-164 (1999).
  27. Karala, A. R., Lappi, A. K., Saaranen, M. J., Ruddock, L. W. Efficient peroxide-mediated oxidative refolding of a protein at physiological pH and implications for oxidative folding in the endoplasmic reticulum. Antioxid. Redox Signal. 11, 963-970 (2009).
  28. Gabizon, A., et al. Cancer nanomedicines: closing the translational gap. Lancet. 384, 2175-2176 (2014).
  29. Nanotrac Nanotechnology Particle Size Measurement Solutions. , Available from: http://www.vahitech.com/Assets/Nano(US)Web.pdf (2006).

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Uma abordagem fácil e eficiente para a produção de micelas reversível Disulfide Cross-linked
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Li, Y., Bharadwaj, G., Lee, J. S. A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles. J. Vis. Exp. (118), e54722, doi:10.3791/54722 (2016).

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