Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Döner disülfür Çapraz bağlı misellerin Üretimi için basit ve etkin Yaklaşım

Published: December 23, 2016 doi: 10.3791/54722
Automatic Translation
1,2, 1, 3
1Department of Biochemistry & Molecular Medicine, University of California, Davis, 2UC Davis Comprehensive Cancer Center, University of California, Davis, 3Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of California, Davis

Abstract

Nanotıp biyomedikal uygulama için ölçek nanometre parçacıkların eşsiz özelliklerini sürdürür terapi yükselen bir şeklidir. Tedavi sonuçları maksimize etmek ve ilaç ilişkili yan etkileri azaltmak için ilaç dağıtım geliştirilmesi bugünkü Nanotıp taşlarından bazılarıdır. Özellikle nanopartiküller kanser tedavisinde geniş bir kullanım alanı bulmuştur. tasarım, uygulama ve tümör mikro dayalı üretimde esneklik yüksek derecesi Nanoparçacıklar klinik uygulamaya hızlı çeviri daha etkili olduğu tahmin edilmektedir. polimerik misel nano taşıyıcı ilaç verme uygulamaları için popüler bir seçimdir.

Bu makalede, iyi tanımlanmış bir amfifilik lineer dendritik kopolimer (telodendrimer, TD) kendini düzenlemesinden göre ilaç yüklü, disülfid çapraz bağlanmış miseller sentezlenmesi için basit ve etkili bir protokol açıklar. TD polietilen gl oluşurHidrofilik segmenti ve çözelti esaslı peptid kimyası kullanılarak bir amin ile sona eren PEG çekirdek oluşturucu hidrofobik yarı parça eklenmiş adım adım bir Tiollenmiş kolik asit küme olarak ycol (PEG). Böyle paklitaksel (PTX) olarak kemoterapi ilaçları, standart bir çözücü buharlaştırma yöntemi kullanılarak yüklenebilir. O 2 aracılı oksidasyon önce TDS ile ilgili serbest tiyol grupları içi misel disülfit çapraz bağlantı oluşturulması için kullanılmıştır. Bununla birlikte, reaksiyon yavaş ve büyük ölçekli üretim için uygun değildi. Son zamanlarda, bir H 2 O 2 aracılı oksidasyon yöntemi daha uygun ve verimli bir yaklaşım olarak araştırılan ve 96 kat daha hızlı daha önce bildirilen yönteme göre daha oldu. Bu yaklaşımı kullanarak, PTX-yüklü, disülfid çapraz bağlanmış nanopartiküller 50 g başarılı dar parçacık boyutu dağılımı ve yüksek ilaç yüklemeli verimle imal edilmiştir. Elde edilen misel çözeltisi stabilitesi örneğin W birlikte kuluçkaya olarak kesintiye koşullar kullanılarak çözümlendiya da indirgeyici bir madde olmayan bir deterjan, sodyum dodesil sülfat, i. bunların olmayan çapraz bağlı karşılıkları ile karşılaştırıldığında ilaç yüklü, disülfid çapraz bağlanmış miseller az hemolitik aktivite göstermiştir.

Introduction

Nanoteknoloji biyomedikal alanlarda 1 bir dizi yararlandı hızlı gelişen bir alandır. Nanopartiküller geleneksel terapötik diğer türleri ile mümkün değildir özellikleri tasarımı ve ayarlama için fırsatlar sağlar. Nano taşıyıcılar, ilaç dolaşım süresini uzatmak, biyolojik ayrışma karşı ilaçların istikrarı geliştirmek ilaç çözünürlüğü sorunları aşmak ve ince ayarlı hedefli ilaç dağıtım ve ko-teslim görüntüleme maddeleri 1,2 için olabilir. Nanopartikül bazlı verme sistemleri Kanser görüntüleme ve tedavisi ümit vaat etmektedir. Tümör vaskülatürlerden makromoleküllere sızan ve gelişmiş geçirgenlik ve tutma (EPR) etkisi 3 ile, tümör bölgelerinde nano-tanecikleri, dolaşımdaki birikmesidir yol açabilir. Aktif bir anti-kanser ilaç taşıyıcılar olarak izlenmektedir birçok nano taşıyıcı (örneğin, lipozomlar, hidrojeller ve polimerik misel) arasında, bir polimerik miseller th geniş bir popülarite kazanmışe son on 4,5.

Polimerik miseller, intravenöz uygulama ile ilgili potansiyel unimers içine ayrışma yol kritik misel konsantrasyonu (CMC) altına seyreltilebilen bir termodinamik sistemdir. Çapraz bağlanma stratejileri unimers içine misel ayrışmasını en aza indirmek için istihdam edilmiştir. Ancak, aşırı stabilize miseller böylece genel terapötik etkinlik azaltarak, hedef bölgelerde bırakmadan gelen ilaç engelleyebilir. Çeşitli kimyasal yaklaşımlar yapmak için araştırılmıştır çapraz bağlama redoks yanıt olarak ya da indirgenebilir disülfid bağlarının 6,7 ve pH-parçalanabilen 8 veya hidrolize ester bağları 9,10 olarak dış uyaranlara, için parçalanabilir.

Daha önce telodendrimers (TD) olarak adlandırılır tasarım ve dendritik kolik asit (CA) blok ve doğrusal polietilen glikol (PEG) kopolimerleri, aşağıdakilerden oluşan misel nanopartiküllerin sentezi 11-15 bildirmiştir nK -CAy olarak temsil edilir. Bunlar hidrofobik çekirdekte paklitaksel (PTX) ile doksorubisin (DOX) halinde kapsül ilaç küçük olmaları, uzun bir raf ömrü ve yüksek verimlilik ile karakterize edilir. PEG, lisin, ve CA gibi TD yapı blokları, biyolojik olarak uyumlu olan, ve bir PEG korona varlığı retiküloendotelyal sistemleri tarafından misel nanopartiküllerin spesifik olmayan soğurulma engelleyen bir "gizli" Nanopartikül karakteri kazandırabilmektedir.

Tiollenmiş doğrusal dendritik polimerler kolaylıkla standart TDS dendritik oligo-lisin omurgasına sistein sokulmasıyla üretilebilir. Bu makalede, TDS hidrofobik çekirdeğin içine disülfit çapraz bağlantı (Şekil 1) verilmesi ile tersine çevrilebilir çapraz bağlanmış miselar ilaç verme sistemi üretimi için, basit bir protokol sunulur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik ifadesi: Dişi atimik çıplak fareler (Nu / Nu suşu), 6-8 haftalık, satın alınan ve AAALAC yönergelerine göre patojensiz şartlar altında tutulur ve herhangi bir deney öncesinde en az 4 gün boyunca ortama alışmaları sağlandı edildi. Tüm hayvan deneyleri kurumsal kurallarına uygun olarak gerçekleştirilir ve California, Davis Üniversitesi'nde Hayvan Kullanım ve Bakım Yönetim Danışma Kurulu tarafından onaylanan protokol sayılı 07-13119 ve sayılı 09-15584 göre edildi.

TD PEG 5K Cys 1. sentezi 4 -Ebes 8 -CA 8

  1. Yuvarlak tabanlı bir şişe içinde, buz üzerinde, susuz dimetilformamid (DMF) ve soğuk 10-20 ml MeO-PEG 5K -NH 2 (2 g, 0.4 mmol) çözülür.
  2. Bir cam kabın içinde, 3 eşdeğer çözülür. 1-hidroksi-6-kloro-benzotriazol (HOBt), 3 eşd. N, N 'diizopropilkarbodiimid (DIC) ve 3 eşdeğer. Susuz D içinde (Fmoc) 2 Lys-OH,MF (10-15 mi). Manyetik bir karıştırma plakası üzerinde 15-20 dakika karıştırılır.
  3. MeO-PEG 5K -NH 2. buz banyosu alınır ve oda sıcaklığında gece boyunca, reaksiyon karışımı karıştırıldı içeren reaksiyon balonuna karışımı ekleyin.
  4. Ince tabaka kromatografisi (TLC) 16 ve Kaiser testi 17, reaksiyonun tamamlandığını teyit (san renkli serbest NH2 olmadığını gösterir). Reaksiyon şişesine buz soğukluğunda eter 200 ml ekleyerek polimer ürün 1 (MeO-PEG 5K -Lys (nH-Fmoc) 2) çökelmesi. santrifüj yoluyla çöktürülmüş polimer (6 6,000 xg'de dk ve 4 ° C) ayırın.
    1. TLC gerçekleştirmek için, silika jel ile kaplanmış TLC plakaları ile ilgili örnekleri nokta. diklorometan / metanol kullanarak (9: 1) mobil faz olarak. TLC plakaları gelişmekte sonra UV lamba altında noktalar dikkate alınmalıdır. Bir de sıcak bir plaka üzerinde amin noktalar görselleştirmek için boyama reaktif ninhidrin kullanabilirsiniz.
    2. Kaiser test, Kaiser reaktifi içeren cam tüp numune biraz yerleştirin. 5 dakika boyunca 100 ° C'de ısı ve renk değişimi (çözeltinin rengi san kalırsa, daha sonra reaksiyon tamamlandı) arayın.
  5. Susuz DMF (10-20 mL) içinde bir ürün yeniden çözülür ve çöktürme ve santrifüjleme (adım 1.4) tekrar edin.
  6. daha sonra tekrar adım 1.5 ve buz soğukluğunda eter ile polimerin çökeltilmesi üç kez yıkayın.
  7. Temiz bir tepkime şişesine, polimer çökelti 1 transferi ve kalıntı eter uzaklaştırılmış yüksek vakum kaynağına şişesi bağlayın.
  8. Hazırlama ve% 20, yaklaşık 20-30 ml ekleyin (h / h) DMF içinde 4-metil-piperidin 1 ara polimer için. Tam çözünme gerçekleşene kadar karıştırılır. 3 saat reaksiyondan.
  9. TLC 16 gerçekleştirin ve Kaiser testi (mavi renk ücretsiz NH 2 varlığını onaylar) 17 (adım 1.4) completio onaylamak içinReaksiyonun n. Reaksiyon tamamlandıktan ise ürünün 1 (1.4-1.6 adımlar) için belirtildiği gibi, eter yağış geçin.
  10. Polimer ürünü 2 (MeO-PEG 5K-Lys (NH2) 2), bir vakum altında kurutulur.
  11. (1.1-1.7 adımlar) ürünü 3 oluşturmak için ara 2 üzerine (Fmoc) 2 Lys-OH-kavrama bir tur daha yürütmek (MeO-PEG 5K Lys (Lys (NH-Fmoc) 2) 2). (1.8-1.10 adım) Fmoc grupları (4, MeO-PEG 5K-Lys (Lys (NH2) 2) 2) ve bir çift (Fmoc) Lys (Boc) (1.1-1.7 adım) -OH de korumak üçüncü nesil dendritik polilisin oluşturur (5, MeO-PEG 5k -Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys (Boc)) 4) PEG zincirinin bir ucunda dört Boc ve Fmoc grubu ile sona erdirildi.
  12. Bir reaksiyon şişesine, ara elde edilen polimeri 5 aktarın. olarakdiklorometan (DCM), 1 (h / h) trifloroasetik asit (TFA): eparate Reaksiyon şişesi, 1 hazırlayın. Polimer 5, ara 1 TFA / DCM (h / h) karışımı bir 1: 15-20 ml ilave edilir. Polimer tamamen eriyene kadar karışım karıştırılır. ilave bir 3 saat daha karıştırılır.
  13. TLC 16 gerçekleştirin ve Kaiser testi reaksiyonun tamamlandığını teyit etmek için 17 (adım 1.4) (mavi renk ücretsiz NH 2 varlığını onaylar). Reaksiyon tamamlandıktan Bir zor akışlı bir çözelti elde edilene kadar hava ile polimerin in TFA / DCM karışımı buharlaşır. Ürünün 1 (1.4-1.6 adımlar) için belirtildiği gibi, eter yağış devam edin. Vakum altında - (((Fmoc) Lys (NH2)) 4 -Lys-Lys 2 MeO-PEG 5k) polimerik ürünün 6 kurutun.
  14. Bir tepkime şişesi içine 6 ara transfer polimeri. 8 eşdeğer ihtiva eden susuz DMF yaklaşık 40 ml kullanın. N, N--diisopropylethylamiNE (DIEA) polimeri 6 ara madde çözülmesi için. Bir cam kabın içinde, 12 eşdeğer çözülür. HOBt, 12 eşd. DIC, 12 eşd. susuz DMF 20-25 ml arasında (Fmoc) Cys (Trt) -OH. 10-15 dakika boyunca sallayın ve 6 içeren reaksiyon balonuna Reaksiyon karışımı ekleyin. Gecede reaksiyonu çalıştırın.
  15. TLC 16 ve Kaiser testi ile reaksiyonun tamamlandığını teyit (adım 1.4 bkz sarı bir renk bilgilerini NH2 olmadığını gösterir) 17. ((Fmoc) Lys - - ((Fmoc) Cys Reaksiyon tamamlandıktan halinde ürün 1 (adım 1.4-1.6) için tarif edilen şekilde, ürün 7 (MeO-PEG 5K -Lys-Lys 2 izole etmek için, eter çökelmeye devam (Trt))) 4.
  16. Ürünü 8 elde etmek için, adım 1.8'de de belirtildiği gibi, on 7 Fmoc de-koruma gerçekleştirin (- (Lys (NH 2) - PEG 5K Lys-Lys 2 (Cys (NH 2) (Trt))) 4). Çift (Fmoc) -PEG 2 -Suc-OH ( "Ebes" bağlayıcı, 24 eşi.), Bir HOBt için yukarıda belirtilen prosedür kullanılarak ara polimer / DIC aracılı bağlanma ile ilgili ara madde 9 (MeO-PEG 5K -Lys-Lys-Lys 2 4 elde etmek için - (Cys (trt) ) 4 (Ebes (NH-Fmoc)) 8).
  17. Ara 10 almak için Fmoc de koruma bir tur daha (1.6-1.8 adımlar) gerçekleştirin (MeO-PEG 5K Lys-Lys 2 Lys 4 - (Cys (Trt)) 4 (Ebes (NH 2)) 8).
  18. Bir tepkime şişesi içine polimerin ara madde 10 aktarılır ve çözünmesi susuz DMF (yaklaşık 30-40 mi) ilave edin. Başka bir reaksiyon şişesine ise 24 eşdeğer çözülür. Susuz DMF (daha önce yayınlanmış prosedüre göre hazırlandı) CAOSu (20-30 mi), 18. 48 eşdeğer ekleyin. ve N, N-diizopropiletilamin ve 10-15 dakika boyunca karışmaya bırakıldı. 10 içeren reaksiyon balonuna içine içeriğini aktarın ve reaksiyon çalıştırmak o izinvernight.
  19. TLC 16 ve Kaiser testi ile reaksiyonun tamamlandığını teyit (adım 1.4 bkz sarı bir renk bilgilerini NH2 olmadığını gösterir) 17. (Cys (Trt)) 4 -Ebes - Reaksiyon tamamlandıktan ise ürünün 1 (1.4-1.6 adımlar) ürünü 11 izole etmek (MeO-PEG 5K Lys-Lys 2 Lys 4 belirtildiği gibi, eter yağış devam 8 -CA 8). de-iyonize su içinde diyaliz ve beyaz bir toz elde etmek için örnek liyofilize.
  20. Bir tepkime şişesi içine, ara polimerin 11 yerleştirin. Hazırlama ve polimer çözeltisi içine, TFA / 1,2-etanditiol (EDT) / trietilsilan (TIS) 20 ml / H2O (94 / 2.5 / 1 / 2.5, v / v) karışımı ekleyin. Tam çözünme gerçekleşene kadar karışım karıştırılır. 4 saat reaksiyondan. TLC 16 ile reaksiyonun tamamlandığını onaylayın.
  21. Davlumbaz altında, içine hava üflemek polimer-TFA / EDT / TIS / H 2çözelti kadar Ç karışımı viskoz hale gelir. Ürünün 1 (1.4-1.6 adımlar) için tarif edilen şekilde nihai ürün, 12 (PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8) izole etmek için, eter çökeltme geçin. asetonitril içinde çözülür ve beyaz bir toz elde etmek için bu liyofilize edin.

PTX-yüklü misellerin 2. Hazırlık

  1. Standart buharlaştırma yöntemi kullanılarak bir PTX yüklü PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 misel hazırlayın.
    1. Kloroform, 1 ml (CHCI3) 'de PTX farklı bir miktarda (1-9 mg) ile TD 20 mg eritin. Homojen kuru polimer film elde edilmesi için bir döner buharlaştırıcı kullanılarak çözücüyü çıkarın. gerektiğinde ilaç yüklü misellerin oluşumunu sağlamak için, 40 kHz, 30 dakika süreyle sese tabi tutularak ve ardından girdap fosfat-tamponlu salin (PBS) ile 1 ml film sulandırın.
    2. % 3 (a / a) H2O 2 (1 eşdeğer 6 ul ekle. FRTD'de tiol grupları oksitleyebileceğini) tiyol gruplar ee. Ellman testi 19 ile gösterildiği gibi serbest tiol gruplarının seviyesi, sabit bir düşük değerli kalır kez daha fazla karakterizasyon için misel solüsyonu kullanın.
    3. örnek sterilize etmek için 0.22 mikron filtre ile çözüm Filtre. 9 kez asetonitril eklenmesi ve sonikasyon 10 dakika gerçekleştirerek miseller uyuşturucu serbest bıraktıktan sonra, bir HPLC sistemine 20 miseller yüklenen ilaç miktarını analiz edin. mobil faz olarak asetonitril / su ile HPLC için bir C18 sütunu kullanın.
    4. HPLC alan değerleri ve 11, standart ilaç konsantrasyonları arasındaki kalibrasyon eğrisine göre ilaç yüklemesine hesaplayın.
      NOT: yükleme verimliliği ilk ilaç içeriğine miseller yüklenen ilaç oranı olarak tanımlanır.

Misellerin 3. Karakterizasyonu

  1. m büyüklüğü ve büyüklük dağılımını ölçmekdinamik ışık saçılımı (DLS) alet 29 icelles. oda sıcaklığında ölçümleri gerçekleştirmek ve 1 mg / ml olarak misel konsantrasyonu tutun.
    NOT: parçacık boyut analizi gerçekleştirmek boş olarak PBS kullanın ve sonra gerçek örnekler için partikül büyüklüğü kaydetmek için. numuneler için üç nüsha olarak okumaları alın ve sonra okumaları ortalama.
  2. Daha önce tarif edildiği gibi 13,21, ABD Doları, önce ve bir hidrofobik flüoresan sonda olarak piren ile çapraz bağlama sonra, PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 kritik misel konsantrasyonu (CMC) ölçmek için floresan spektrumu kullanın.
    NOT: Genellikle, misel konsantrasyonu 5 × 10 -7 5 × 10 -4 M. aralıkları

ya da indirgeme maddeleri, SDS misellerin 4. Stabilite

  1. sodyum dodesil sülfat stok çözeltileri (SDS) çözeltisi (7.5 mg / ml) ve PBS içinde disülfid çapraz bağlı miseller (1.5 mg / ml) hazırlayın. Daha sonra, uNihai SDS konsantrasyonu olan bir çözelti karışımı yapmak stok solüsyonları şarkı 2.5 mg / ml ve misel konsantrasyonu 1.0 mg / ml olan.
  2. ile ya da 10 mM glutatyon (GSH) varlığı olmadan önceden belirlenen zaman aralıklarında misel çözeltilerinin (adım 3.1 belirtildiği gibi) boyutu ve boyut dağılımı ölçülür.

5. Hemoliz tayininde

  1. Toplanan daha önce yayınlanmış prosedür 11 ve çıplak farelerde taze sitratlı kan kullanılarak PTX yüklü çapraz bağlı miseller (PTX-DCMs) göre hazırlandı PTX yüklü olmayan çapraz bağlı miseller (PTX-NCMs) hemolitik potansiyelini değerlendirir kuyruk peçe.
    1. % 2'lik bir nihai konsantrasyona PBS ile hücre pelletleri yeniden askıya daha sonra, 10 dakika boyunca 1000 x g'de kan numunesi (1.0 mi) bir santrifüj ile kırmızı kan hücreleri toplamak PBS ile uygun üç kez yıkayın ve.
  2. Farklı konsantrasyonlarda (0.2 ve 1.0 ile birlikte eritrosit süspansiyonu 200 ul karıştırınmg PTX-NCMs ve PTX-DCMS, / ml), sırasıyla, bir kuluçka çalkalayıcı içinde 37 ° C'de 4 saat inkübe edilir.
  3. 5 dakika boyunca 3.000 xg'de misel-eritrosit karışımları santrifüj. 96 oyuklu bir plakaya her numunenin süpernatant 100 ul aktarın. Bir mikro-plaka okuyucusu kullanmak sureti ile 540 nm de üstte yüzen madde içindeki serbest hemoglobin absorbansı ölçülür.
    Not: Triton-100 (% 2) ve PBS ile inkübe eritrositler sırasıyla pozitif ve negatif kontroller olarak kullanılacak. RBCs yüzde hemoliz aşağıdaki formülle hesaplanır: RBC hemoliz = (OD örneği - OD negatif kontrol) / (OD pozitif kontrol - OD negatif kontrol)% 100 ×.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İlaç yüklü disülfid Çapraz bağlanmış misellerin hazırlanışı ve Karakterizasyonu

Amfifilik polimerin PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 kanser ilaç dağıtımı için bir disülfid çapraz bağlanmış miselar sistemi oluşturabilen bir dendritik polimerdir. Yapısal olarak, bu dallı bir poli (lisin-sisteyin-Ebes) omurgası boyunca doğrusal bir PEG molekülünün (hidrofilik etki, molekül ağırlığı 5K) bir ucuna bağlanmış, kolik asit (hidrofob alan) bir dendritik oligomeri olarak tanımlanır. Diğer bildirilen misel sistemleri üzerinden bu blok kopolimerleri kullanımının bazı avantajları vardır. İlk olarak, hali hazırda kademeli çözelti fazı yoğunlaştırma reaksiyonları ile sentezlenebilir. İkinci olarak, iyi bilinen solüsyon faz aşamalı Fmoc peptid kimyası ile hazırlanmıştır birçok rapor amfifilik polimerler, Tiollenmiş polimer sistemi ile karşılaştırıldığında, iyi tanımlanmış bir structu sahipyeniden. Bu liyofilize edilmiş bir toz halinde saklanabilir ve uzun bir raf ömrüne sahip olabilir.

Çeşitli teknikler son ürün karakterize etmek için kullanılabilir. TD bağlı kolik asit miktarı 1H NMR spektrumları, kolik asit, üç metil grupları ile ilgili kişilerce PEG üzerindeki proton sinyal oranını karşılaştırarak saptanabilir. TD molekül ağırlıkları MALDI-TOF kütle spektrometrisi ve jel permeasyon kromatografisi (GPC) ile kontrol edilebilir. Kantitatif Ellman test molekülü başına mevcut serbest sistein artıklarının sayısı deşifre etmek için kullanılabilir.

PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 sulu ortamda miseller oluşturmak için kendi kendine birleşebilen olabilir. Bir solvent buharlaştırma yöntemi, örneğin PTX ve vinkristin gibi hidrofobik ilaçlar, çeşitli kullanılarak başarılı bir şekilde miseller 13,22 kapsüllenmiş edilmiştir. Oxygen geçerli PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 ait serbest tiol gruplarının oksitlenmeye ve intra-misel disülfid çapraz bağlar oluşturmak için kullanıldı. Ellman testi ile gözlenmiş olduğu gibi, bağlar disülfid serbest tiyol grupları, dönüşüm oranı oksidasyon 48 saat sonra% 85 olmuştur. AH 2 O 2 aracılı oksidasyon son zamanlarda alternatif bir yöntem olarak kullanılmıştır. Dönüşüm oranı bir önceki yaklaşıma göre 96 kat daha hızlı oldu 30 dakika (Şekil 2), 88% ulaştı. PTX-yüklü elli gram, disülfid çapraz bağlanmış nanopartiküller başarıyla daha verimli bir yaklaşım (Şekil 3) ile üretilmiştir. Parçacık büyüklüğü dar bir boyut dağılımı (Şekil 3) ile birlikte, yaklaşık 27 nm idi. ilaç yüklemesi verimi 4.0 mg / ml PTX yükleme ile% 100 oranında görülmektedir. Disülfid çapraz bağlama CMC değerine dramatik bir etkisi vardı. Eksikliği Standart bir TD PEG 5K -CA 8 ile karşılaştırıldığındadisülfid bağları, çapraz bağlanmış TD gözlenen CMC değerleri 10 kat bir azalma (0.67 uM karşılık 5.53 uM) 13 gösterdi.

Stabilite Çalışmaları

Biz daha ciddi misel kesintiye koşullarına karşı PTX yüklü, disülfid çapraz bağlanmış misellerin stabilitesi araştırılmıştır. Sodyum dodesil sülfat (SDS), verimli bir şekilde, polimerik miseller yıkmak rutin olarak, misel stabilitesini değerlendirmek için kullanılan bir güçlü iyonik bir deterjandır. İlaç yüklü, disülfid çapraz bağlanmış miseller (1.0 mg / ml) stabilitesi misel kesintiye SDS (2.5 mg / ml) mevcudiyetinde DLS ile izlenmiştir. Misellerin parçacık boyutu (Şekil 4 sol paneller) çapraz bağlı miseller bozulmadan kalmıştır belirten zaman sabit kalmıştır. Indirgeyici koşullar Ther hidrofobik çekirdekte disülfid bağları ayıran beklenmektedireby istikrarsızlığa duyarlı miselleri adrestir. Glutatyon (GSH), indirgeme maddesi, bir endojen, genellikle bu tür çalışmalar için kullanılır. ekstraselüler düzeyde (2 mikron karşı 10 mm) ile karşılaştırıldığında GSH hücre içi düzeyde tezat vardır. konsantrasyonları bu fark genellikle uyarıcı yanıt veren sistemler oluşturmak için kullanılır. Bir hücre içi konsantrasyonuna (10 mm) 23 de GSH ilave edildikten sonra, ilaç yüklü, disülfid çapraz bağlanmış misellerin boyutu 30 dakika boyunca bozulmadan kalmıştır. Onlar aniden disülfür bağları, miseller (Şekil 4, sağ panel) hızlı ayrışma bir önkoşul kritik bir sayıda azalma anlamına, 1 nm düşmüştür. Aksine, sistem (veriler gösterilmemiştir) GSH hücre dışı konsantrasyonlarının varlığında sabit kalmıştır.

hemoliz Çalışması

şekil5 ya da disülfid çapraz bağlamadan PTX yüklü miseller, gözlenen hemolitik aktivitesi farklılıkları göstermektedir. kan akışı içine, bu parçacıklar uygulandığında onların terapötik avantajlar zayıflatmaktadır kan hücrelerinin Hemoliz kaçınılmalıdır. Hemato uyumluluğu gibi lipidler çözündürülmesi için veya plazma zarının çatlaması gelen fosfolipid membranların kendilerini eklemek için bir potansiyele sahip amfifilik TDs polimer bazlı ilaç taşıyıcı, in vivo uygulama için çok önemlidir. Şekil 5'te gösterildiği gibi, PTX-NCMs 0.2 mg yükselmiştir PTX-NCMs konsantrasyonu 14.2% 8.1'den% artan hemoliz yüzdesi (RBC) parçalama sayısı, doza bağımlı bir kırmızı kan hücresi bulunmuştur / 1.0 mg / ml aralığındadır. Bununla birlikte, PTX-DCMs disülfit çapraz bağlama bilgisi aynı deney koşulları altında eritrositlerde gözlenebilir hemolitik etkileri (<% 1.0) görülmüştür. hemolys bu farkeğilim amfifilik TDS oluşturmak için dissociating gelen PTX-DCMS önlemek hidrofobik özünde mevcut içi misel disülfit köprüleri, isnat edilebilir olduğunu.

Şekil 1
Şekil 1: çapraz bağlı miseller oluşturmak için adımlar. Kendi kendine montajdan sonra Tiollenmiş telodendrimer PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 oksitlenmesi ile oluşturulan disülfid çapraz bağlı miseller şematik gösterimi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: çapraz bağlı misel oluşumu için oksidasyon yöntemleri. t dönüşüm oranıO TDS ile ilgili gruplar iki oksidasyon yöntemleri oksidasyon zamanın bir fonksiyonu olarak bağlar disülfid tiyol. misellerin toplam konsantrasyonu, 20 mg / ml'de tutulmuştur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3: ilaç yüklü, çapraz-bağlanmış misel. Sol panel: PTX yüklü, disülfid çapraz bağlanmış misellerin bir toplu bir resmi. Ölçek çubuğu: 1 inç. Sağ panel: parçacık boyutu, dinamik ışık saçılımı (DLS) ile belirlenmiştir. misellerin toplam konsantrasyonu, 20 mg / ml'de tutulmuştur. PTX yükleme / ml 4 mg idi. Parçacık boyutu verileri üç ölçümün göre ± SD ortalama parçacık boyutu olarak gösterilmiştir. SD: standart sapma, ölçülen parçacık büyüklüğü dağılımının genişliği tanımlar.Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4: Kararlılık çalışma. DLS ile ölçülen (sol) olmadan ya da (sağ) GSH (10 mM) ile 2,5 mg / ml SDS mevcudiyetinde PTX-yüklü, disülfid çapraz bağlanmış miseller parçacık boyutu. Parçacık boyutu verileri üç ölçümün göre ± SD ortalama parçacık boyutu olarak gösterilmiştir. SD: standart sapma, ölçülen parçacık büyüklüğü dağılımının genişliği tanımlar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5: Hemoliz deneyi. Kırmızı kan hücreleri üzerinde çapraz bağlanmamış miseller göre PTX-yüklü, disülfid çapraz bağlanmış miseller in vitro hemolitik etkileri (RBC). Triton-100 (% 2) ve PBS sırasıyla pozitif ve negatif kontroller olarak kullanılmıştır. bildirilen değerler üçlü örneklerin ortalama ± SD vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Çeşitli nanopartiküller ilaç iletiminde potansiyel kullanım için incelenmiştir. Lipozomal doksorubisin ve paklitaksel (PTX) insan serum albümin nano-agrega kanser tedavisi için FDA tarafından onaylanmış nanotherapeutics arasındadır -yüklü. klinik olarak etkili olmasına rağmen, ancak, bu nanotherapeutics iki boyut açısmdan göreceli olarak "büyük", ve karaciğer ve akciğer birikme eğilimindedir. nispeten daha küçük partikül boyutları ve daha yüksek ilaç yükü kapasitesine sahip polimerik miseller ilaç iletimi için nanocarriers ortaya çıkmaktadır. Onların eşsiz çekirdek-kabuk yapısı 'çözünür' fiziksel kapsülleme sulu koşullarda hidrofobik ilaç molekülleri. ilaç kapsül uzun raf ömrü ve yüksek verimle laboratuar bir şekilde tekil dağılımlı nanopartiküllerin hazırlanması iyi tanımlanmış TDs (10-50 nm partikül boyutu) oluşan polimerik miseller. Sağlam TD platformunun birçok avantajlarından biri polimerin çok yönlülük olduğunu.Pek çok ilaç, floresan boyalar ve hedefleme ligandlan kolay TD platformu 13,15,24 dahil edilebilir.

Protokol çerçevesinde kritik adımlar

Biz 27 nm civarında bir parçacık boyutu olan iyi tanımlanmış bir PTX teslimat, bir sağlam, geri dönüşümlü, disülfid çapraz bağlanmış misel sistemi geliştirilmiştir ve dar bir ebat dağılımına sahip olması. TDS aşamalı çözüm fazlı peptid kimyası aracılığıyla sentezlendi. Bu TDS iyi tanımlanmış kimyasal yapının, istenen özelliklere sahip nano-tanecikleri üretmek için önemli bir faktördür. Bu nedenle, TLC ve Kaiser testi ile reaksiyonun tamamlandığını teyit kritik öneme sahiptir. H2O 2 oksidasyonu da TD'de tiol grupları büyük miseller stabilitesini arttırmak olan disülfit çapraz bağlantı oluşturmak üzere oksitlenir kritik adımdır. Önceki oksijen esaslı oksitleme yöntemi ile karşılaştırıldığında, H2O 2 -göre oksidasyon metot, böylece, daha kısa zaman dönemleri çapraz bağlı micelles sağlayan 96 defa daha hızlıdır. Ayrıca, GSH, bir tiol içeren tripeptid, hücreler tarafından üretilen bir önemli anti-oksidan ve serbest radikaller ve reaktif oksijen bileşiklerinin tutucu önemli bir rol oynar. Bu hücresel redoks homeostazisini koruyarak önemli katkılarda bulunmaktadır. GSH hücre konsantrasyonu ilaç tasarımı ilginç bir yönüdür. GSH hücre içi konsantrasyonu artık iyice dışı konsantrasyonu 25 (2 uM, sırasıyla karşı 10 mM) önemli ölçüde daha yüksek olduğu saptanmıştır. Daha da önemlisi, yüksek bir hücre içi GSH düzeyi genellikle birçok ilaca karşı dirençli insan ve kemirgen tümör hücreleri 26 bildirilmiştir. GSH yüksek hücre içi dağılımı ilacın yük serbest bırakılması ve birikimi misellerin ve sonuçların disülfit çapraz bağlanma kırılma kolaylaştırır. disülfid çapraz bağlanmış nanopartiküller olanSDS mevcudiyetinde kararlı. Ancak, GSH-zengin hücre içi ortamı dolayısıyla sistemin destabilize, disülfit bağlarını parçalayarak ilacın salınımını tetikler. Polimer-bağlı hemoliz, kırmızı kan hücreleri kan bileşenleri, polimerik miseller zararlı etkileşimden elde edilmiştir. Çapraz bağlanmış miseller olmayan çapraz bağlanmış analogları ile karşılaştırıldığında çok daha az hemoliz göstermiştir.

Değişiklikler ve Sorun Giderme

Daha önce rapor oksijen esaslı bir yöntem 13 ile karşılaştırıldığında, bir oksitleme maddesi olarak H2O 2 kullanmak daha verimli bir disülfit çapraz bağlantı oluşumunu sağlar. H 2 O 2 su içinde ucuz ve son derece çözünür ve diğer bazı bilinen oksitleyici maddeler (örneğin, kromat veya permanganat) ile karşılaştırıldığında yüksek kaliteli ürünler veren bir güçlü oksitleyici ajan 27 olduğunu. Bununla birlikte, oksidasyon süresi ilave edilen gerekebilirr sentezinin ölçeğine göre optimize.

Tekniğin Sınırlamalar

H2O 2 güçlü bir oksitleyicidir. H2O 2 gibi düşük bir konsantrasyonu, disülfid çapraz bağ oluşumunun başka şekilde gerçekleştirilmesi için kullanılan da, bakım, istenmeyen ilaç bozulmasını önlemek için "oksidasyona duyarlı" ilaç yüklü TDS ile kullanıldığında alınmalıdır.

Mevcut / Alternatif Yöntemler Göre Tekniği Önemi

açıklanan teknik kolayca standart bir laboratuarda çoğaltılmış olabilir kolay bir deney düzeneği olduğunu. Örneğin, standart bir buharlaştırma yöntemi kullanan ilaç doldurma diyaliz yöntemine göre daha az zaman alır. Oksitleyici ajan olarak H 2 O 2 kullanarak çekirdek disülfid oluşumu daha hızlı oxyg kullanarak önceden bildirilen oksidasyon yöntemine göre 96 kat13 tr. ilaç yükleme adımı tekrarlanabilirliği kolayca parçacık boyutuna (DLS yöntemi) ve ilaç içeriği (HPLC) ölçülmesiyle değerlendirilebilir.

Bu Tekniği Mastering sonra gelecek Uygulamalar veya Tarifi

Küçük molekül ilaçların karşılaştırıldığında, ihtiyaç büyük engellerden biri ana kanser bakım ayarlarını üretimi 28 kadar ölçekleme teknik zorluklar olduğunu girebilirsiniz nano tıp önce üstesinden gelinmesi gereken. Bu yeni geliştirilen tekniği hakim sonra, kolay, büyük ölçüde disülfid çapraz bağlı miseller sentezleyebilir. Bu durum, insan hastalarda, bu nano formülasyonun klinik çalışmalar için, son derece arzu edilen bir durumdur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MeO-PEG5K-NH2 Rapp Polymere 125000-2
Fmoc-Lys(Fmoc)-OH Aaptec AFK107
Fmoc-Lys(Boc)-OH Anaspec AS-20132
Fmoc-Cys(Trt)-OH Aapptec AAC105
Dimethylformamide Fisher Scientific BP1160-4
Ethyl ether Fisher Scientific E134-20
N,N-Diisopropylethylamine Sigma Aldrich D125806
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich T6508 Corrosive, handle with care
4-methyl piperidine Alfa-Aesar L-02709
Ebes linker Anaspec AS-61924
Cholic acid Sigma Aldrich C1129
1,2-Ethanedithiol Sigma Aldrich 02390 Handle inside fume hood. Bleach gloves after usage.
Triisopropylsilane Sigma Aldrich 233781
Chloroform (anhydrous) Sigma Aldrich 288306
Hydrogen peroxide solution 30% Aaron Industries NA
HoBt-Cl Aaptec CXZ096
DIC Sigma Aldrich D125407
Female athymic nude mice (Nu/Nu strain), 6–8 weeks age Harlan (Livermore, CA)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, L., et al. Nanoparticles in medicine: therapeutic applications and developments. Clin. Pharmacol. Ther. 83, 761-769 (2008).
  2. Wang, A. Z., Langer, R., Farokhzad, O. C. Nanoparticle Delivery of Cancer Drugs. Annu. Rev. Med. 63, 185-198 (2012).
  3. Iyer, A. K., Khaled, G., Fang, J., Maeda, H. Exploiting the enhanced permeability and retention effect for tumor targeting. Drug Disc. Today Targets. 11, 812-818 (2006).
  4. Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles. Pharmacol. Rev. 64, 505-519 (2012).
  5. Kamaly, N., Xiao, Z., Valencia, P. M., Radovic-Moreno, A. F., Farokhzad, O. C. Targeted polymeric therapeutic nanoparticles: design, development and clinical translation. Chem. Soc. Rev. 41, 2971-3010 (2012).
  6. Li, Y. L., et al. Reversibly stabilized multifunctional dextran nanoparticles efficiently deliver doxorubicin into the nuclei of cancer cells. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 9914-9918 (2009).
  7. Miyata, K., et al. Block catiomer polyplexes with regulated densities of charge and disulfide cross-linking directed to enhance gene expression. J. Am. Chem. Soc. 126, 2355-2361 (2004).
  8. Chan, Y., Wong, T., Byrne, F., Kavallaris, M., Bulmus, V. Acid-labile core cross-linked micelles for pH-triggered release of antitumor drugs. Biomacromolecules. 9, 1826-1836 (2008).
  9. Rijcken, C. J., Snel, C. J., Schiffelers, R. M., van Nostrum, C. F., Hennink, W. E. Hydrolysable core-crosslinked thermosensitive polymeric micelles: synthesis, characterisation and in vivo studies. Biomaterials. 28, 5581-5593 (2007).
  10. Talelli, M., et al. Core-crosslinked polymeric micelles with controlled release of covalently entrapped doxorubicin. Biomaterials. 31, 7797-7804 (2010).
  11. Xiao, K., et al. A self-assembling nanoparticle for paclitaxel delivery in ovarian cancer. Biomaterials. 30, 6006-6016 (2009).
  12. Li, Y., et al. A novel size-tunable nanocarrier system for targeted anticancer drug delivery. J. Control. Release. 144, 314-323 (2010).
  13. Li, Y., et al. Well-defined, reversible disulfide cross-linked micelles for on-demand paclitaxel delivery. Biomaterials. 32, 6633-6645 (2011).
  14. Li, Y., et al. Well-defined, reversible boronate crosslinked nanocarriers for targeted drug delivery in response to acidic pH values and cis-diols. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51, 2864-2869 (2012).
  15. Li, Y., et al. A smart and versatile theranostic nanomedicine platform based on nanoporphyrin. Nat. Commun. 5, (2014).
  16. Belenki, B. G., Gankina, E. S. Thin-Layer chromatography of polymers. J. Chromatogr. A. 141, 13-90 (1977).
  17. Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).
  18. Pandey, P. S., Rai, R., Singh, R. B. Synthesis of cholic acid-based molecular receptors: head-to-head cholaphanes. J. Chem. Soc., Perkin Trans 1. , 918-923 (2002).
  19. Riddles, P. W., Blakeley, R. L., Zerner, B. Reassessment of Ellman's reagent. Methods Enzymol. 91, 49-60 (1983).
  20. Ahuja, S., Rasmussen, H. Overview of HPLC method development for pharmaceuticals. HPLC Method Development for Pharmaceuticals. , Separation Science and Technology; 8. Elsevier Academic Press Inc. 1-11 (2007).
  21. Li, Y., Pan, S., Zhang, W., Du, Z. Novel thermo-sensitive core-shell nanoparticles for targeted paclitaxel delivery. Nanotechnology. 20 (6), 065104 (2009).
  22. Kato, J., et al. Disulfide cross-linked micelles for the targeted delivery of vincristine to B-cell lymphoma. Mol. Pharm. 9, 1727-1735 (2012).
  23. Lu, S. C. Regulation of glutathione synthesis. Mol. Aspects Med. 30, 42-59 (2009).
  24. Xiao, K., et al. "OA02" peptide facilitates the precise targeting of paclitaxel-loaded micellar nanoparticles to ovarian cancer in vivo. Cancer Res. 72, 2100-2110 (2012).
  25. Koo, A. N., et al. Disulfide-cross-linked PEG-poly(amino acid)s copolymer micelles for glutathione-mediated intracellular drug delivery. Chem. Commun. 28, 6570-6572 (2008).
  26. McLellan, L. I., Wolf, C. R. Glutathione and glutathione-dependent enzymes in cancer drug resistance. Drug. Resist. Update. 2, 153-164 (1999).
  27. Karala, A. R., Lappi, A. K., Saaranen, M. J., Ruddock, L. W. Efficient peroxide-mediated oxidative refolding of a protein at physiological pH and implications for oxidative folding in the endoplasmic reticulum. Antioxid. Redox Signal. 11, 963-970 (2009).
  28. Gabizon, A., et al. Cancer nanomedicines: closing the translational gap. Lancet. 384, 2175-2176 (2014).
  29. Nanotrac Nanotechnology Particle Size Measurement Solutions. , Available from: http://www.vahitech.com/Assets/Nano(US)Web.pdf (2006).

Tags

Biochemistry Sayı 118 nanopartikül ilaç verme miseller telodendrimer disülfid çapraz bağlanma hidrojen peroksit aracılı oksidasyon
Döner disülfür Çapraz bağlı misellerin Üretimi için basit ve etkin Yaklaşım
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Y., Bharadwaj, G., Lee, J. S. A… More

Li, Y., Bharadwaj, G., Lee, J. S. A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles. J. Vis. Exp. (118), e54722, doi:10.3791/54722 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter