Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Een Facile en efficiënte aanpak voor de productie van omkeerbare Disulfide Cross-linked micellen

Published: December 23, 2016 doi: 10.3791/54722
Automatic Translation
1,2, 1, 3
1Department of Biochemistry & Molecular Medicine, University of California, Davis, 2UC Davis Comprehensive Cancer Center, University of California, Davis, 3Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of California, Davis

Abstract

Nanogeneeskunde is een nieuwe vorm van therapie die de unieke eigenschappen van deeltjes die nanometer schaal voor biomedische toepassingen benut. Verbetering van de drug delivery om therapeutische resultaten te maximaliseren en drugs geassocieerde bijwerkingen te verminderen zijn enkele van de hoekstenen van het huidige nanomedicine. Nanodeeltjes in het bijzonder hebben een brede toepassing in de behandeling van kanker gevonden. Nanodeeltjes die een hoge mate van flexibiliteit in het ontwerp, toepassing en productie op basis van de tumor micro bieden worden geprojecteerd effectiever met snelle vertaling in de klinische praktijk. Het polymere micellaire nano-carrier is een populaire keuze voor drug delivery applicaties.

In dit artikel beschrijven we een eenvoudig en doeltreffend protocol voor het synthetiseren van met geneesmiddel beladen, disulfide verknoopte micellen basis van de zelf-assemblage van een welomschreven amfifiele dendritische lineair copolymeer (telodendrimer, TD). TD is samengesteld uit polyethyleen glycol (PEG) als hydrofiel segment en een gethioleerde cholinezuur cluster als kernvormende hydrofoob deel verbonden stapsgewijs een met amine beëindigd middels PEG-oplossing op basis peptidechemie. Geneesmiddelen voor chemotherapie, zoals paclitaxel (PTX), kunnen worden geladen met een standaard werkwijze met oplosmiddelverdamping. De O 2 gemedieerde oxidatie werd eerder gebruikt om intra-micellaire disulfide cross-links van vrije thiol groepen op de TD's te vormen. De reactie was traag en niet haalbaar voor grootschalige productie. Onlangs werd een H 2 O 2 bemiddelde oxidatiewerkwijze onderzocht als een meer haalbare en efficiënte aanpak en het was 96 keer sneller dan de eerder beschreven methode. Met deze benadering hebben 50 g PTX-loaded, disulfide verknoopte nanodeeltjes met succes geproduceerd met een smalle deeltjesgrootteverdeling en geneesmiddelbelading hoge efficiency. De stabiliteit van de verkregen miceloplossing wordt geanalyseerd met verstoren aandoeningen zoals co-incubatie wet een detergens natriumdodecylsulfaat, met of zonder een reductiemiddel. De met geneesmiddel beladen, disulfide verknoopte micellen toonde dat de hemolytische activiteit in vergelijking met hun niet-verknoopt tegenhangers.

Introduction

Nanotechnologie is een snel opkomende gebied dat een aantal biomedische gebieden 1 heeft geprofiteerd. Nanodeeltjes mogelijkheden voor het ontwerpen en afstemmen eigenschappen die niet haalbaar zijn met andere soorten conventionele therapeutica. Nano-carriers verbeteren van de stabiliteit van geneesmiddelen tegen biologische afbraak, te verlengen drug circulatie tijd, oplosbaarheid drugsproblematiek te overwinnen, en kan verfijnd voor gerichte toediening van geneesmiddelen en voor co-leveren imaging agenten 1,2 zijn. Nanodeeltjes gebaseerde afgiftesystemen houden belofte in kanker beeldvorming en behandeling. Tumor vasculatures zijn lekkende macromoleculen en kan leiden tot preferentiële ophoping van circulerende nanodeeltjes op tumorplaatsen via de verhoogde permeabiliteit en retentie (EPR) effect 3. Onder de verschillende nano-dragers (bijvoorbeeld liposomen, hydrogels, en polymere micellen) dat actief als dragers voor anti-kanker medicijnen worden nagestreefd, hebben polymere micellen opgedaan grote populariteit in the afgelopen tien jaar 4,5.

Polymere micellen een thermodynamisch systeem, op intraveneuze toediening, kan mogelijk worden onder de kritische micel concentratie (CMC) verdund, wat leidt tot de dissociatie in unimers. Verknoping strategieën zijn toegepast om dissociatie in micellaire unimers minimaliseren. Echter overmatig gestabiliseerd micellen voorkomen dat het geneesmiddel uit los op de doelwitplaatsen, waardoor de totale therapeutische werkzaamheid verminderen. Verschillende chemische middelen zijn beproefd om de verknoping afbreekbaar reactie op redox of externe stimuli, zoals reduceerbare disulfidebindingen 6,7 en pH-splitsbare 8 of hydrolyseerbare esterbindingen 9,10.

We hebben eerder gemeld het ontwerpen en synthetiseren van micellaire nanopartikels bestaande uit dendritische cholinezuur (CA) blokken en lineair polyethyleen glycol (PEG) copolymeren, hierna telodendrimers (TD) 11-15 nK -CAy (waarbij n = molecuulgewicht in kilodalton (K), y = aantal cholinezuur (CA) eenheden). Ze worden gekenmerkt door hun geringe omvang, lange houdbaarheid en een hoge efficiëntie inkapselen geneesmiddelen zoals paclitaxel (PTX) en doxorubicine (DOX) bij de hydrofobe kern. De bouwstenen van TD, zoals PEG, lysine en CA, biocompatibel, en de aanwezigheid van een corona PEG kan een "stealth" nanodeeltjes karakter geven, dat niet-specifieke opname van micellaire nanopartikels door het reticulo-endotheliale systeem.

Gethioleerde lineaire dendritische polymeren kunnen gemakkelijk worden gegenereerd door het introduceren van cysteïnen in de dendritische oligo-lysine ruggengraat van onze standaard TDS. Dit artikel een gemakkelijke protocol voor de productie van een omkeerbaar verknoopt micellaire geneesmiddelafgiftesysteem door de invoering disulfide verknopingen in de hydrofobe kern van TD (figuur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ethiek statement: Vrouwelijke athymische naakt muizen (Nu / Nu-stam), 6-8 weken oud, werden gekocht en vervolgens oder pathogeen-vrije omstandigheden volgens de AAALAC richtlijnen en liet men acclimatiseren gedurende ten minste 4 dagen voorafgaand aan de experimenten. Alle dierlijke experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en volgens het protocol No. 07-13119 en No. 09-15584, door de Animal Gebruik en onderhoud Adviescommissie Administratieve aan de Universiteit van California, Davis goedgekeurd.

1. Synthese van TD PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8

  1. In een rondbodemkolf, los MeO-PEG 5K -NH2 (2 g, 0,4 mmol) in 10-20 ml watervrij dimethylformamide (DMF) en te rusten op ijs.
  2. In een glazen beker, los 3 equiv. van 1-hydroxy-6-chloor-benzotriazool (HOBt), 3 equiv. N, N '-diisopropylcarbodiimide (DIC) en 3 equiv. van (Fmoc) 2 Lys-OH in watervrij DMF (10-15 ml). Roer voor 15-20 minuten op een magnetische roer plaat.
  3. Voeg het mengsel aan de reactiekolf bevattende de MeO-PEG 5K -NH 2. Verwijder het ijsbad en nacht roeren van het reactiemengsel bij kamertemperatuur.
  4. Bevestigt de voltooiing van de reactie met dunnelaagchromatografie (TLC) en test 16 17 Kaiser's (een gele kleur geeft de afwezigheid van vrije NH2). Precipitaat het polymere product 1 (MeO-PEG 5K Lys (NH-Fmoc) 2) Door toevoeging van ongeveer 200 ml ijskoude ether aan de reactiekolf. Scheid de geprecipiteerde polymeer via centrifugatie (6 min bij 6000 xg en 4 ° C).
    1. TLC voeren, ter plaatse van de monsters op silicagel beklede TLC-platen. Gebruik dichloormethaan / methanol (9: 1) als mobiele fase. Let op plekken onder een UV-lamp na het ontwikkelen van de TLC-platen. Men kan ook gebruik maken van ninhydrine kleuring reagens om amine plekken te visualiseren op een hete plaat.
    2. voor Kai-test ser's, plaats een klein beetje van het monster in een glazen buisje met Kaiser's reagens. Verwarmen bij 100 ° C gedurende 5 minuten en zoek de kleurverandering (als de kleur van de oplossing geel blijft, dan is de reactie voltooid).
  5. Re-oplossen van het product in watervrij DMF (10-20 ml) en herhaal de neerslag en centrifugeren (zie stap 1.4).
  6. Herhaal stap 1,5, en was daarna het polymeer neerslag driemaal met ijskoude ether.
  7. Transfer van het polymeer neerslag 1 tot en met een schone reactie kolf en sluit de kolf met een hoog vacuüm bron om de resterende ether te verwijderen.
  8. Bereiden en voeg ongeveer 20-30 ml 20% (v / v) 4-methylpiperidine in DMF polymeer intermediair 1. Roer tot volledige oplossing. Voer de reactie gedurende 3 uur.
  9. TLC voeren 16 en test Kaiser's (een blauwe kleur, de aanwezigheid van vrije NH2) 17 (zie stap 1,4) aan de completio bevestigenn van de reactie. Als de reactie voltooid is, gaat de ether neerslaan, zoals genoemd voor product 1 (stappen 1.4-1.6).
  10. Droog het polymere product 2 (MeO-PEG 5K -Lys (NH2) 2) onder een vacuüm.
  11. Voer een ronde van (Fmoc) 2 Lys-OH-koppeling op tussenproduct 2 (stappen 1.1-1.7) om product 3 te genereren (MeO-PEG 5K -Lys (Lys (NH-Fmoc) 2) 2). De-bescherming (stappen 1,8-1,10) de Fmoc groepen (4, MeO-PEG 5K-Lys (Lys (NH 2) 2) 2) en koppel (stappen 1,1-1,7) de (Fmoc) Lys (Boc) -OH aan genereren van een derde vormer van dendritische polylysine (5, MeO-PEG 5k Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys (Boc)) 4) getermineerd met vier Boc en Fmoc-groepen aan één uiteinde van de PEG-keten.
  12. Het verkregen polymeer intermediair 5 een reactiekolf. in zoalseparate reactiekolf werd bereid 1: 1 (v / v) trifluorazijnzuur (TFA) in dichloormethaan (DCM). Voeg 15-20 ml van een 1: 1 TFA / DCM (v / v) mengsel het polymeer intermediair 5. Roer het mengsel tot het polymeer volledig is opgelost. Roer nog eens 3 uur.
  13. TLC voeren 16 en test Kaiser's (een blauwe kleur, de aanwezigheid van vrije NH2) 17 (zie stap 1,4) aan de voltooiing van de reactie te bevestigen. Als de reactie is voltooid, verdampen de polymeer-in-TFA / DCM mengsel met lucht tot een viskeuze oplossing wordt verkregen. Ga verder met de ether neerslag, zoals genoemd voor product 1 (stappen 1,4-1,6). Droog het polymere product 6 (MeO-PEG 5k Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys (NH 2)) 4) onder een vacuüm.
  14. Transfer polymeertussenproduct 6 in een reactiekolf. Gebruik ongeveer 40 ml watervrij DMF dat 8 equiv. N.N -diisopropylethylamine (DIEA) het polymeer intermediair 6 lossen. In een glazen beker, los 12 equiv. HOBt, 12 equiv. DIC en 12 equiv. van (Fmoc) Cys (Trt) -OH in 20-25 ml watervrij DMF. Schud gedurende 10-15 min en voeg het reactiemengsel aan de reactiekolf bevattende 6. Voer de reactie 's nachts.
  15. Bevestig de voltooiing van de reactie met TLC 16 en test Kaiser's (zie stap 1.4, een gele kleur geeft de afwezigheid van vrije NH 2) 17. Als de reactie voltooid is, gaat de ether neerslaan, zoals genoemd voor product 1 (stap 1,4-1,6), te isoleren product 7 (MeO-PEG 5K-Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys - ((Fmoc) Cys (Trt))) 4.
  16. Uitvoeren Fmoc ontscherming op 7, zoals bepaald in stap 1,8, productgroep 8 te verkrijgen (5K PEG-Lys-Lys 2 - (Lys (NH2) - (Cys (NH2) (Trt))) 4). Stel (Fmoc) -PEG 2 -Suc-OH ( "Ebes" linker, 24 equiv.) Op een polymeer intermediair met de bovenstaande procedure voor HOBt / DIC-gemedieerde koppeling aan tussenproduct 9 (MeO-PEG 5K-Lys-Lys-Lys 2 4 verkrijgen - (Cys (Trt) ) 4 (Ebes (NH-Fmoc)) 8).
  17. Voer nog een ronde van Fmoc de-bescherming (stappen 1,6-1,8) tot gemiddeld 10 te krijgen (MeO-PEG 5K Lys-Lys 2 Lys 4 - (Cys (Trt)) 4 (Ebes (NH 2)) 8).
  18. Breng het polymeer intermediair 10 in een reactiekolf en voeg watervrij DMF (ongeveer 30-40 ml) te ontbinden. In een andere reactiekolf werd los 24 equiv. van CAOSu (bereid volgens de eerder gepubliceerde werkwijze) in watervrij DMF (20-30 ml) 18. Voeg 48 equiv. N, N-diisopropylethylamine en laat roeren gedurende 10-15 min. Breng de inhoud in de reactiekolf met 10 en laat de reactie run overnight.
  19. Bevestigt de voltooiing van de reactie met TLC 16 en test Kaiser's (zie stap 1,4, een gele kleur geeft de afwezigheid van vrije NH2) 17. Als de reactie voltooid is, gaat de ether neerslaan, zoals genoemd voor product 1 (stappen 1.4-1.6) om product 11 te isoleren (MeO-PEG 5K-Lys-Lys-Lys 2 4 - (Cys (Trt)) 4 -Ebes 8 -CA 8). Dialyseren in gedeïoniseerd water en lyofiliseren van het monster om een ​​wit poeder.
  20. Plaats het polymeer intermediair 11 in een reactiekolf. Bereiden en voeg 20 ml van TFA / 1,2-ethaandithiol (EDT) / triethylsilaan (TIS) / H2O (94 / 2,5 / 1 / 2,5, v / v) mengsel in de polymeeroplossing. Roer het mengsel tot volledige oplossing. Voer de reactie gedurende 4 uur. Bevestigt de voltooiing van de reactie door TLC 16.
  21. Onder de zuurkast, blazen lucht in de polymeer-TFA / EDT / TIS / H 2O mengsel tot de oplossing viskeus. Overgaan tot het neerslaan ether, zoals genoemd voor product 1 (stappen 1.4-1.6), hetgeen het eindproduct, 12 (PEG 5K -Cvs 4 -Ebes 8 -CA 8) te isoleren. Oplossen in acetonitril en lyofiliseren aan een wit poeder werd verkregen.

2. Bereiding van PTX-beladen micellen

  1. Bereid een PTX-geladen PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 micellen met behulp van de standaard verdamping methode.
    1. Los op 20 mg TD met een verschillende hoeveelheid PTX (1-9 mg) in 1 ml chloroform (CHCl3). Verwijder het oplosmiddel met een rotatieverdamper tot een homogene droge polymeerfilm verkregen. Reconstitueer de film met 1 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met vortex, gevolgd door sonicatie gedurende 30 minuten bij 40 kHz, indien nodig, de vorming van met geneesmiddel beladen micellen mogelijk.
    2. Voeg 6 pl 3% (w / w) H 2 O 2 (1 equiv. Tot vree de thiolgroepen) aan de thiolgroepen oxideren op de TD. Gebruik de miceloplossing voor verdere karakterisering zodra het gehalte aan vrije thiolgroepen tegen constante lage waarde blijft, zoals blijkt uit onderzoek van Ellman 19.
    3. Filtreer de oplossing door een 0,22 urn filter om het monster te steriliseren. Analyseer de hoeveelheid geneesmiddel beladen micellen in een HPLC systeem 20 na het loslaten van geneesmiddelen uit de micellen door het toevoegen van 9 maal acetonitril en uitvoeren 10 min sonicatie. Gebruik een C18 HPLC kolom met acetonitril / water als de mobiele fase.
    4. Bereken de geneesmiddelbelading volgens de kalibratiecurve tussen de HPLC-oppervlakteverhouding waarden en de concentraties van het geneesmiddel 11 standaard.
      OPMERKING: De beladingsrendement wordt gedefinieerd als de verhouding van geneesmiddel geladen in de micellen de oorspronkelijke geneesmiddelgehalte.

3. Karakteriseringen van micellen

  1. Meet de grootte en grootteverdeling van de micelles met een dynamische lichtverstrooiing (DLS) instrument 29. Voer de metingen bij kamertemperatuur en houd de micel concentratie 1 mg / ml.
    OPMERKING: Om de deeltjesgrootte analyses uit te voeren, gebruik PBS als blanco, en vervolgens de deeltjesgrootte vast te leggen voor de werkelijke monsters. Neem de metingen in drievoud voor monsters, en dan het gemiddelde van de metingen.
  2. Gebruik fluorescentiespectra de kritische micellaire concentratie (CMC) van PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 meten voor en na het vernetten met pyreen als hydrofobe fluorescente probe, zoals eerder beschreven 13,21.
    OPMERKING: Gewoonlijk is de micel concentratie varieert van 5 x 10 -7 tot 5 x 10 -4 M

4. Stabiliteit van micellen in SDS met of zonder reductiemiddelen

  1. Bereid voorraadoplossingen van natriumdodecylsulfaat (SDS) oplossing (7,5 mg / ml) en disulfide verknoopte micellen (1,5 mg / ml) in PBS. Vervolgens, uzingen voorraadoplossingen, maak een oplossing mengsel waarin de uiteindelijke concentratie SDS bij 2,5 mg / ml en de micel concentratie van 1,0 mg / ml.
  2. Meet de grootte en grootteverdeling (zoals vermeld in stap 3,1) van de micellen op vooraf bepaalde tijdsintervallen met of zonder de aanwezigheid van 10 mM glutathion (GSH).

5. Hemolyse Assay

  1. Evalueer de hemolytische potentieel van PTX-geladen, niet-verknoopte micellen (PTX-NCMS) bereid volgens eerder gepubliceerde werkwijze 11 en PTX-geladen verknoopte micellen (PTX-DCM) met verse gecitreerd bloed van naakt muizen verzameld uit de staart sluier.
    1. Verzamelen rode bloedcellen door centrifugeren bloedmonster (1,0 ml) bij 1000 g gedurende 10 minuten, wassen driemaal met PBS, en daarna resuspendeer de celpellets met PBS tot een eindconcentratie van 2%.
  2. Meng 200 pl erythrocytensuspensie met verschillende concentraties (0,2 en 1,0mg / ml) van PTX-NCMS en PTX-DCM, respectievelijk, en incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C in een incubator shaker.
  3. Centrifugeer de micel-erytrocyt mengsels bij 3000 xg gedurende 5 minuten. Breng 100 pi van het supernatant van alle monsters op een 96-wells plaat. Meet de absorptie van vrij hemoglobine in het supernatant bij 540 nm onder toepassing van een microplaat reader.
    OPMERKING: RBC geïncubeerd met Triton-100 (2%) en PBS worden gebruikt als positieve en negatieve controles, respectievelijk. Het percentage hemolyse van de rode bloedcellen wordt berekend met de volgende formule: RBC hemolyse = (OD monster - OD negatieve controle) / (OD positieve controle - OD negatieve controle) x 100%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bereiding en karakterisering van met geneesmiddel beladen, Disulfide Cross-linked micellen

Amfifiele polymeer PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 is een dendritisch polymeer staat tot het vormen van een disulfide verknoopte micellaire voor kanker geneesmiddelafgifte. Structureel wordt gedefinieerd als een dendritische oligomeer van choline zuren (hydrofoob domein) gekoppeld aan een uiteinde van de lineaire PEG-molecuul (hydrofiel domein molecuulgewicht 5K) door een vertakte poly (lysine-cysteïne-Ebes) backbone. Er zijn verschillende voordelen van het gebruik van deze blokcopolymeren boven andere gemelde micellaire systemen. Ten eerste kan deze gemakkelijk worden bereid via stapsgewijze oplossingsfase condensatiereacties. Ten tweede, in vergelijking met enkele andere gerapporteerde amfifiele polymeren, het gethioleerde polymeersysteem, bereid door middel van goed gevestigde oplossingsfase stapsgewijze Fmoc peptidechemie, heeft een goed gedefinieerde structuopnieuw. Het kan worden opgeslagen in gevriesdroogde poedervorm en heeft een lange houdbaarheid.

Verschillende technieken kunnen worden toegepast om het eindproduct te karakteriseren. De hoeveelheid van cholinezuur verbonden TD kan worden gedetecteerd door vergelijking van de signaalverhouding van de protonen op PEG met die op de drie methylgroepen cholinezuur in de 1H NMR spectra. De molecuulgewichten van de TD kan worden bevestigd door MALDI-TOF massaspectrometrie en gelpermeatiechromatografie (GPC). proef De kwantitatieve Ellman kan worden gebruikt om het aantal vrije cysteïneresten aanwezig per molecuul ontcijferen.

PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 kunnen zichzelf assembleren tot micellen in waterige media te vormen. Onder toepassing van een standaard werkwijze met oplosmiddelverdamping, diverse hydrofobe geneesmiddelen, zoals PTX en vincristine, zijn met succes ingekapseld in de micellen 13,22. z Deen was eerder gebruikt om de vrije thiolgroepen van PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 oxideren en intra-micellaire disulfide cross-koppelingen te vormen. Zoals gecontroleerd door testen Ellman's, de wisselkoers van de vrije thiolgroepen om obligaties disulfide bereikte 85% na 48 uur van oxidatie. AH 2 O 2 gemedieerde oxidatie is onlangs gebruikt als een alternatieve methode. De koers bereikte 88% in 30 min (figuur 2), die 96 keer sneller dan de vorige aanpak was. Vijftig gram PTX-loaded, disulfide verknoopte nanodeeltjes met succes geproduceerd met deze efficiëntere benadering (figuur 3). De deeltjesgrootte was ongeveer 27 nm, met een nauwe grootteverdeling (figuur 3). De geneesmiddelbelading efficiëntie benaderd 100% met PTX lading van 4,0 mg / ml. Disulfide verknoping had een dramatisch effect op de CMC waarde. In vergelijking met standaard TD PEG 5K -CA 8 dat ontbreektdisulfidebindingen, de verknoopte TD vertoonde een 10-voudige verlaging in de waargenomen waarden CMC (5,53 pM versus 0,67 uM) 13.

stabiliteitsonderzoek

We onderzochten verder de stabiliteit van PTX-loaded, disulfide verknoopte micellen tegen ernstige micel verstoren omstandigheden. Natriumdodecylsulfaat (SDS) is een sterke ionische detergens die routinematig wordt gebruikt voor de beoordeling micellaire stabiliteit, efficiënt polymere micellen kunnen afbreken. De stabiliteit van met geneesmiddel beladen, disulfide verknoopte micellen (1,0 mg / ml) werd gevolgd door DLS in aanwezigheid van de micel verstoren SDS (2,5 mg / ml). De deeltjesgrootte van de micellen bleef stabiel in de tijd, waaruit bleek dat verknoopte micellen intact bleef (Figuur 4, linker panelen). Reductieve omstandigheden wordt verwacht dat disulfide bindingen splitsen in de hydrofobe kern, therEby waardoor micellen gevoelig voor destabilisatie. Glutathion (GSH), een endogene reductiemiddel, wordt vaak gebruikt voor deze studies. Er is schril contrast in het intracellulaire niveau van GSH opzichte van het extracellulaire niveau (10 mm versus 2 pm). Dit verschil wordt vaak gebruikt om stimuli-responsieve systemen genereren. Na de toevoeging van GSH in een intracellulaire concentratie (10 mm) 23, de grootte van de met geneesmiddel beladen, disulfide verknoopte micellen bleef intact gedurende 30 min. Zij abrupt daalde tot 1 nm, betekent de reductie van een kritisch aantal disulfidebindingen die impliceren de snelle dissociatie van de micellen (figuur 4, rechter paneel). Integendeel, het systeem stabiel in aanwezigheid van extracellulaire GSH (gegevens niet getoond).

hemolyse Study

Figuur5 toont verschillen in de waargenomen hemolytische activiteit van PTX-beladen micellen, met of zonder disulfide verknoping. Hemolyse bloedcellen moeten worden vermeden bij toediening van deze deeltjes in de bloedstroom, zoals hun therapeutische voordelen ondermijnt. Hemato-compatibiliteit is zeer belangrijk voor in vivo toepassing van op polymeren gebaseerde dragers voor geneesmiddelen, zoals het amfifiele TD die het potentieel om lipiden te solubiliseren of zich voegen in fosfolipide membranen leidt tot de scheuren van plasmamembranen hebben. Zoals getoond in figuur 5 werden de PTX-NCMS bleek een dosisafhankelijke rode bloedcellen hebben (RBC) lysis telling, het percentage hemolyse steeg van 8,1% tot 14,2% en de concentratie van PTX-NCMS steeg van 0,2 mg / ml tot 1,0 mg / ml. Echter, PTX-DCM die disulfide verknoping vertoonden geen waarneembare hemolytische activiteiten (<1,0%) in de RBC's onder dezelfde experimentele omstandigheden. Dit verschil in de hemolyswordt trend kan worden toegeschreven aan de intra-micellaire disulfidebruggen bij het hydrofobe kern, die verhinderen PTX-DCM van dissociëren tot amfifiele TD vormen.

Figuur 1
Figuur 1: Stappen voor het vormen van cross-linked micellen. Schematische weergave van de disulfide verknoopte micellen gevormd door oxidatie van de gethioleerde telodendrimer PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 na zelf te monteren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Oxidatie werkwijzen voor verknoopt micelvorming. Het succespercentage van thij thiolgroepen op de TD obligaties disulfide als functie van de oxidatietijd voor de twee oxidatiemethoden. De totale concentratie van de micellen werd bij 20 mg / ml bewaard. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: met geneesmiddel beladen, verknoopt micel. Linker paneel: een beeld van een partij van PTX-loaded, disulfide verknoopte micellen. Schaal bar: 1 inch. Rechterpaneel: de deeltjesgrootte, zoals bepaald door dynamische lichtverstrooiing (DLS). De totale concentratie van micellen werd bij 20 mg / ml bewaard. Het laden van PTX was 4 mg / ml. De deeltjesgrootte gegevens zijn getoond als het gemiddelde ± SD deeltjesgrootte op basis van drie metingen. SD: standaardafwijking, wordt de breedte van de deeltjesgrootteverdeling gemeten.Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4: Stabiliteit studie. De deeltjesgrootte van PTX-loaded, disulfide verknoopte micellen in aanwezigheid van 2,5 mg / ml SDS zonder (links) en met (rechts) GSH (10 mM), zoals gemeten door DLS. De deeltjesgrootte gegevens zijn getoond als het gemiddelde ± SD deeltjesgrootte op basis van drie metingen. SD: standaardafwijking, wordt de breedte van de deeltjesgrootteverdeling gemeten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5: Hemolyse assay. De in vitro hemolytische activiteiten van PTX-loaded, disulfide verknoopte micellen in vergelijking met niet-verknoopte micellen op rode bloedcellen (RBC's). Triton-100 (2%) en PBS werden toegepast als positieve en negatieve controles, respectievelijk. De gerapporteerde waarden zijn het gemiddelde ± SD van drievoudige monsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Verscheidene nanodeeltjes zijn onderzocht op hun mogelijke toepassing in geneesmiddelafgifte. Liposomaal doxorubicine en paclitaxel (PTX) -geladen humaan serumalbumine nano-aggregaten van de door de FDA goedgekeurd voor de behandeling van kanker nanotherapeutics. Hoewel klinisch effectieve, beide nanotherapeutics relatief "grote" groot en ze hopen zich in de lever en longen. Polymere micellen met relatief kleinere deeltjes en hogere drug laadcapaciteit zijn in opkomst nanocarriers voor drug delivery. Hun unieke kern-schil structuur '' oplosbaar '' het hydrofobe geneesmiddel moleculen in aanwezigheid van water door fysische inkapseling. Polymere micellen samengesteld uit welomschreven TDs bereid in ons lab vorm monodisperse nanodeeltjes (10-50 nm deeltjesgrootte) met een lange houdbaarheid en een hoog rendement in het inkapselen van drugs. Een van de vele voordelen van de robuuste TD platform is de veelzijdigheid van het polymeer.Diverse drugs, fluorescerende kleurstoffen en targeting liganden kunnen gemakkelijk in de TD platform 13,15,24 worden opgenomen.

Kritische stappen in het protocol

We hebben een sterke, reversibele, disulfide verknoopte micellen voor PTX afgifte, die goed gedefinieerd, met een deeltjesgrootte rond 27 nm ontwikkeld, en een smalle grootteverdeling. De TD's werden gesynthetiseerd via stapsgewijze oplossing fase peptide chemie. De goed gedefinieerde chemische structuur van deze TD's is de belangrijkste factor voor het genereren van nanodeeltjes met gewenste eigenschappen. Derhalve de voltooiing van de reactie met TLC-test en Kaiser is zeer kritisch. H 2 O 2 oxidatie is een kritische stap, de thiolgroepen op de TD geoxideerd disulfide verknopingen vormen, die sterk verbeteren van de stabiliteit van de micellen. Vergelijking met onze vorige zuurstofbleekmiddelen oxidatiewerkwijze, H 2 O 2 -oxidatie gebaseerde methode 96 keer sneller, waardoor verknoopte micellen in kortere tijdsperioden. Verder GSH, een thiol-bevattend tripeptide, een belangrijke antioxidant geproduceerd door de cellen en speelt een belangrijke rol bij het wegvangen van vrije radicalen en reactieve zuurstofverbindingen. Het maakt belangrijke bijdragen door het handhaven van de cellulaire redox homeostase. De cellulaire concentratie van GSH is een interessant aspect van de drug design. De intracellulaire concentratie van GSH een gevestigde aanzienlijk hoger dan de extracellulaire concentratie (10 mM versus 2 uM, respectievelijk) 25 zijn. Nog belangrijker is dat een verhoogde intracellulair GSH niveau vaak bij talrijke resistente humane en murine tumorcellen 26. De hoge intracellulaire verdeling van GSH vergemakkelijkt het breken van de disulfide verknoping van de micellen en resulteert in de afgifte en accumulatie van het geneesmiddel lading. Het disulfide-verknoopte nanodeeltjesstabiel in aanwezigheid van SDS. Echter, een GSH-rijke intracellulaire omgeving leidt tot de afgifte van het geneesmiddel door het afbreken van de disulfidebindingen, waardoor het systeem te destabiliseren. Polymeer geïnduceerde hemolyse gevolg van de nadelige interactie van polymere micellen met bloedbestanddelen zoals rode bloedcellen. Verknoopte micellen vertoonden minder hemolyse vergelijking met niet-verknoopte analogen.

Wijzigingen en problemen oplossen

Gebruik H 2 O 2 als oxidatiemiddel maakt een meer efficiënte disulfide verknopen formatie vergeleken met de eerder gemeld, zuurstof gebaseerde methode 13. H 2 O 2 is een sterk oxidatiemiddel 27 dat goedkoop en zeer oplosbaar in water en geeft hoge kwaliteit in vergelijking met enkele andere bekende oxidatiemiddelen (bijvoorbeeld chromaat of permanganaat). Echter, kan het nodig zijn de oxidatie tijd te further geoptimaliseerd op basis van de omvang van de synthese.

Beperkingen van de Techniek

H 2 O 2 is een sterk oxidatiemiddel. Ook al is een lage concentratie van H 2 O 2 wordt gebruikt voor het uitvoeren van de disulfide verknopen formatie, zorg moet worden genomen bij het gebruik met TD's geladen met "oxidatie-gevoelige" drugs om ongewenste drug degradatie te voorkomen.

Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande / Alternative Methods

De beschreven techniek is een eenvoudige experimentele opstelling die gemakkelijk kan worden gerepliceerd in een standaard laboratorium. Bijvoorbeeld, geneesmiddelbelading met een standaard verdampingswerkwijze minder tijdrovend dan de dialysewerkwijze. De disulfide in de kern via H 2 O 2 als het oxidatiemiddel 96 keer sneller dan de eerder beschreven methode met z De oxidatienl 13. Reproduceerbaarheid van de geneesmiddelbeladingsvermogen stap kan gemakkelijk worden vastgesteld door het meten van de deeltjesgrootte (DLS methode) en geneesmiddelgehalte (HPLC).

Toekomstige toepassingen of richtingen na beheersen van deze techniek

Vergeleken met kleine molecule geneesmiddelen, één van de belangrijkste obstakels die overwonnen moet worden alvorens nanogeneeskunde moeten reguliere kanker zorgsettings de technische Uitbreiding van de productie 28 voeren. Na beheersen deze nieuw ontwikkelde techniek, kan men gemakkelijk synthetiseren disulfide verknoopte micellen op grote schaal. Dit is zeer wenselijk voor klinische studies van deze nano-formulering bij menselijke patiënten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MeO-PEG5K-NH2 Rapp Polymere 125000-2
Fmoc-Lys(Fmoc)-OH Aaptec AFK107
Fmoc-Lys(Boc)-OH Anaspec AS-20132
Fmoc-Cys(Trt)-OH Aapptec AAC105
Dimethylformamide Fisher Scientific BP1160-4
Ethyl ether Fisher Scientific E134-20
N,N-Diisopropylethylamine Sigma Aldrich D125806
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich T6508 Corrosive, handle with care
4-methyl piperidine Alfa-Aesar L-02709
Ebes linker Anaspec AS-61924
Cholic acid Sigma Aldrich C1129
1,2-Ethanedithiol Sigma Aldrich 02390 Handle inside fume hood. Bleach gloves after usage.
Triisopropylsilane Sigma Aldrich 233781
Chloroform (anhydrous) Sigma Aldrich 288306
Hydrogen peroxide solution 30% Aaron Industries NA
HoBt-Cl Aaptec CXZ096
DIC Sigma Aldrich D125407
Female athymic nude mice (Nu/Nu strain), 6–8 weeks age Harlan (Livermore, CA)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, L., et al. Nanoparticles in medicine: therapeutic applications and developments. Clin. Pharmacol. Ther. 83, 761-769 (2008).
  2. Wang, A. Z., Langer, R., Farokhzad, O. C. Nanoparticle Delivery of Cancer Drugs. Annu. Rev. Med. 63, 185-198 (2012).
  3. Iyer, A. K., Khaled, G., Fang, J., Maeda, H. Exploiting the enhanced permeability and retention effect for tumor targeting. Drug Disc. Today Targets. 11, 812-818 (2006).
  4. Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles. Pharmacol. Rev. 64, 505-519 (2012).
  5. Kamaly, N., Xiao, Z., Valencia, P. M., Radovic-Moreno, A. F., Farokhzad, O. C. Targeted polymeric therapeutic nanoparticles: design, development and clinical translation. Chem. Soc. Rev. 41, 2971-3010 (2012).
  6. Li, Y. L., et al. Reversibly stabilized multifunctional dextran nanoparticles efficiently deliver doxorubicin into the nuclei of cancer cells. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 9914-9918 (2009).
  7. Miyata, K., et al. Block catiomer polyplexes with regulated densities of charge and disulfide cross-linking directed to enhance gene expression. J. Am. Chem. Soc. 126, 2355-2361 (2004).
  8. Chan, Y., Wong, T., Byrne, F., Kavallaris, M., Bulmus, V. Acid-labile core cross-linked micelles for pH-triggered release of antitumor drugs. Biomacromolecules. 9, 1826-1836 (2008).
  9. Rijcken, C. J., Snel, C. J., Schiffelers, R. M., van Nostrum, C. F., Hennink, W. E. Hydrolysable core-crosslinked thermosensitive polymeric micelles: synthesis, characterisation and in vivo studies. Biomaterials. 28, 5581-5593 (2007).
  10. Talelli, M., et al. Core-crosslinked polymeric micelles with controlled release of covalently entrapped doxorubicin. Biomaterials. 31, 7797-7804 (2010).
  11. Xiao, K., et al. A self-assembling nanoparticle for paclitaxel delivery in ovarian cancer. Biomaterials. 30, 6006-6016 (2009).
  12. Li, Y., et al. A novel size-tunable nanocarrier system for targeted anticancer drug delivery. J. Control. Release. 144, 314-323 (2010).
  13. Li, Y., et al. Well-defined, reversible disulfide cross-linked micelles for on-demand paclitaxel delivery. Biomaterials. 32, 6633-6645 (2011).
  14. Li, Y., et al. Well-defined, reversible boronate crosslinked nanocarriers for targeted drug delivery in response to acidic pH values and cis-diols. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51, 2864-2869 (2012).
  15. Li, Y., et al. A smart and versatile theranostic nanomedicine platform based on nanoporphyrin. Nat. Commun. 5, (2014).
  16. Belenki, B. G., Gankina, E. S. Thin-Layer chromatography of polymers. J. Chromatogr. A. 141, 13-90 (1977).
  17. Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).
  18. Pandey, P. S., Rai, R., Singh, R. B. Synthesis of cholic acid-based molecular receptors: head-to-head cholaphanes. J. Chem. Soc., Perkin Trans 1. , 918-923 (2002).
  19. Riddles, P. W., Blakeley, R. L., Zerner, B. Reassessment of Ellman's reagent. Methods Enzymol. 91, 49-60 (1983).
  20. Ahuja, S., Rasmussen, H. Overview of HPLC method development for pharmaceuticals. HPLC Method Development for Pharmaceuticals. , Separation Science and Technology; 8. Elsevier Academic Press Inc. 1-11 (2007).
  21. Li, Y., Pan, S., Zhang, W., Du, Z. Novel thermo-sensitive core-shell nanoparticles for targeted paclitaxel delivery. Nanotechnology. 20 (6), 065104 (2009).
  22. Kato, J., et al. Disulfide cross-linked micelles for the targeted delivery of vincristine to B-cell lymphoma. Mol. Pharm. 9, 1727-1735 (2012).
  23. Lu, S. C. Regulation of glutathione synthesis. Mol. Aspects Med. 30, 42-59 (2009).
  24. Xiao, K., et al. "OA02" peptide facilitates the precise targeting of paclitaxel-loaded micellar nanoparticles to ovarian cancer in vivo. Cancer Res. 72, 2100-2110 (2012).
  25. Koo, A. N., et al. Disulfide-cross-linked PEG-poly(amino acid)s copolymer micelles for glutathione-mediated intracellular drug delivery. Chem. Commun. 28, 6570-6572 (2008).
  26. McLellan, L. I., Wolf, C. R. Glutathione and glutathione-dependent enzymes in cancer drug resistance. Drug. Resist. Update. 2, 153-164 (1999).
  27. Karala, A. R., Lappi, A. K., Saaranen, M. J., Ruddock, L. W. Efficient peroxide-mediated oxidative refolding of a protein at physiological pH and implications for oxidative folding in the endoplasmic reticulum. Antioxid. Redox Signal. 11, 963-970 (2009).
  28. Gabizon, A., et al. Cancer nanomedicines: closing the translational gap. Lancet. 384, 2175-2176 (2014).
  29. Nanotrac Nanotechnology Particle Size Measurement Solutions. , Available from: http://www.vahitech.com/Assets/Nano(US)Web.pdf (2006).

Tags

Biochemistry nanodeeltjes geneesmiddelafgifte micellen telodendrimer disulfide verknoping waterstofperoxide gemedieerde oxidatie
Een Facile en efficiënte aanpak voor de productie van omkeerbare Disulfide Cross-linked micellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Y., Bharadwaj, G., Lee, J. S. A… More

Li, Y., Bharadwaj, G., Lee, J. S. A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles. J. Vis. Exp. (118), e54722, doi:10.3791/54722 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter