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Biochemistry

Une approche efficace et Facile pour la production de micelles réversible Disulfure réticulés

Published: December 23, 2016 doi: 10.3791/54722
Automatic Translation
1,2, 1, 3
1Department of Biochemistry & Molecular Medicine, University of California, Davis, 2UC Davis Comprehensive Cancer Center, University of California, Davis, 3Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of California, Davis

Abstract

Nanomédecine est une nouvelle forme de thérapie qui exploite les propriétés uniques des particules qui sont nanomètres échelle pour application biomédicale. Améliorer l'administration de médicaments pour maximiser les résultats thérapeutiques et de réduire les effets secondaires associés au médicament sont quelques-unes des pierres angulaires de la nanomédecine actuelle. Nanoparticules en particulier, ont trouvé une large application dans le traitement du cancer. Nanoparticules qui offrent un haut degré de flexibilité dans la conception, l'application et la production sur la base du microenvironnement de la tumeur devraient être plus efficaces avec la traduction rapide dans la pratique clinique. Le micellaire nano-support polymère est un choix populaire pour les applications de distribution de médicaments.

Dans cet article, nous décrivons un protocole simple et efficace pour la synthèse, des micelles réticulées disulfure drogue chargé basé sur l'auto-assemblage d'un copolymère bien défini amphiphile linéaire-dendritique (telodendrimer, TD). TD est constituée de polyéthylène glycol (PEG) comme segment hydrophile et un groupe d'acide cholique thiolé comme la fraction hydrophobe attachée par étapes de formation de noyau à un PEG de terminaison amine en utilisant la chimie des peptides à base de solutions. Les médicaments chimiothérapeutiques, tels que le paclitaxel (PTX), peuvent être chargés à l'aide d'un procédé d'évaporation de solvant standard. Le O 2 oxydation médiée a déjà été utilisé pour former disulfures liaisons transversales intra-micellaires de groupes thiol libres sur le TDs. Cependant, la réaction a été lente et pas réalisable pour la production à grande échelle. Récemment, une méthode d'oxydation de l' H 2 O 2 médiée a été explorée comme une approche plus réaliste et efficace, et il était 96 fois plus rapide que la méthode précédemment. En utilisant cette approche, 50 g de PTX-chargés, les nanoparticules réticulées disulfure ont été produits avec succès avec la distribution granulométrique étroite et une efficacité élevée de chargement de drogue. La stabilité de la solution micellaire obtenue est analysée en utilisant des conditions perturbatrices telles que la co-incubation avecvec un détergent dodécylsulfate de sodium, avec ou sans agent réducteur. Les micelles, réticulés disulfure chargés en médicament ont démontré une activité hémolytique inférieure par rapport à leurs homologues non réticulées.

Introduction

La nanotechnologie est un domaine en pleine émergence qui a bénéficié d' un certain nombre de domaines biomédicaux 1. Nanoparticules offrent des possibilités pour la conception et le réglage des propriétés qui ne sont pas réalisables avec d'autres types de traitements conventionnels. Nano-transporteurs améliorent la stabilité des médicaments contre la biodégradation, prolonger le temps de circulation de la drogue, à surmonter les problèmes de solubilité médicaments, et peuvent être ajustés pour la livraison ciblée de médicaments et pour les agents de co-distribution imagerie 1,2. systèmes de distribution à base de nanoparticules sont prometteurs dans l'imagerie et le traitement du cancer. Vasculatures tumorales sont leaky aux macromolécules et peuvent conduire à une accumulation préférentielle de circulation des nanoparticules sur les sites tumoraux par la perméabilité accrue et la rétention (EPR) Effet 3. Parmi les différents nano-supports (par exemple, des liposomes, des hydrogels, des polymères et des micelles) qui sont activement poursuivies comme supports pour des médicaments anticancéreux, des micelles polymères ont acquis une grande popularité au cours ee dernière décennie 4,5.

Les micelles polymériques sont un système thermodynamique qui, lors de l'administration par voie intraveineuse, peut éventuellement être diluée au-dessous de la concentration micellaire critique (CMC), conduisant à leur dissociation en unimères. stratégies de réticulation ont été utilisées pour réduire au minimum la dissociation micellaire en unimères. Cependant, les micelles excessivement stabilisées peuvent empêcher de libérer le médicament aux sites cibles, réduisant ainsi l'efficacité thérapeutique globale. Plusieurs approches chimiques ont été explorées pour rendre la réticulation dégradable en réponse à redox ou à des stimuli externes, tels que des liaisons disulfures réductibles 6,7 et pH-clivable 8 ou ester hydrolysable obligations 9,10.

Nous avons précédemment rapporté la conception et la synthèse de nanoparticules micellaires , comprenant de l' acide cholique dendritique (CA) et des séquences linéaires de polyéthylène glycol (PEG) , les copolymères appelés telodendrimers (TD) 15/11 nK -Cay (où n = poids moléculaire en kilodaltons (K), y = nombre d'acide cholique (CA) unités). Ils sont caractérisés par leur petite taille, longue durée de conservation, et une grande efficacité dans les médicaments encapsulant tels que le paclitaxel (PTX) et doxorubicine (DOX) dans le noyau hydrophobe. Les éléments constitutifs de la TD, tels que le PEG, la lysine, et CA, sont biocompatibles, et la présence d'une couronne de PEG peut conférer un caractère nanoparticulaire "furtif", ce qui empêche l'absorption non spécifique des nanoparticules micellaires par le système réticulo-endothélial.

polymères linéaires-dendritique thiolées peuvent facilement être générés par l'introduction de cysteines dans le squelette du oligo-lysine dendritique de notre TDs standard. Cet article présente un protocole facile pour la production d'un système de délivrance de médicament micellaire réversiblement réticulé par introduction reticulations disulfure dans le noyau hydrophobe de Tou (figure 1).

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Protocol

déclaration éthique: Femme souris nude athymiques (souche Nu / Nu), 6-8 semaines, ont été achetés et conservés dans des conditions exemptes d'agents pathogènes selon les directives AAALAC et ont été autorisés à s'acclimater pendant au moins 4 jours avant toute expérience. Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives institutionnelles et conformément au protocole n ° 07-13119 et n ° 09-15584, approuvé par l'utilisation des animaux et le Comité consultatif d'administration de soins à l'Université de Californie, Davis.

1. Synthèse de TD PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8

  1. Dans un ballon à fond rond, dissoudre MeO-PEG 5K NH2 (2 g, 0,4 mmol) dans 10-20 ml de diméthylformamide anhydre (DMF) et de froid sur la glace.
  2. Dans un récipient en verre, dissoudre 3 équiv. de 1-hydroxy-6-chloro-benzotriazole (HOBt), 3 équiv. de N, N '-diisopropylcarbodiimide (DIC) et 3 équiv. de (Fmoc) 2 Lys-OH anhydre DMF (10-15 ml). Agiter pendant 15-20 min sur une plaque d'agitation magnétique.
  3. Ajouter le mélange dans le ballon de réaction contenant le MeO-PEG 5K -NH 2. Retirer le bain de glace et on agite le mélange réactionnel pendant une nuit à température ambiante.
  4. Confirmer l'achèvement de la réaction par chromatographie sur couche mince (CCM) 16 et le test de Kaiser 17 (une couleur jaune indique l'absence de NH2 libre). Précipiter le produit polymère 1 (MeO-PEG 5 K Lys (Fmoc NH-2)) par addition d' environ 200 ml d'éther refroidi à la glace dans le ballon de réaction. Séparer le polymère précipité par centrifugation (6 min à 6000 x g et 4 ° C).
    1. Pour effectuer TLC, repérer les échantillons sur des plaques de CCM de gel de silice revêtues. En utilisant du dichlorométhane / méthanol (9: 1) comme phase mobile. Observer les taches sous une lampe UV après avoir développé les plaques de CCM. On peut également utiliser ninhydrine réactif de coloration pour visualiser les taches amine sur une plaque chauffante.
    2. Pour KaiLe test de ser, placez un peu de l'échantillon dans le tube de verre contenant le réactif de Kaiser. Faire chauffer à 100 ° C pendant 5 minutes et recherchez le changement de couleur (si la couleur de la solution reste jaune, puis la réaction est terminée).
  5. Re-dissoudre le produit dans du DMF anhydre (10-20 ml) et répéter la précipitation et centrifugation (voir étape 1.4).
  6. Répétez l'étape 1.5, puis laver le précipité de polymère à trois reprises avec de l'éther glacé.
  7. Transférer le précipité de polymère 1 à un ballon de réaction propre et raccorder le ballon à une source de vide élevé pour éliminer l'éther résiduel.
  8. Préparer et ajouter environ 20-30 ml de 20% (v / v) 4-méthylpipéridine dans le DMF en polymère intermédiaire 1. Remuer jusqu'à dissolution complète. Exécutez la réaction pendant 3 heures.
  9. Effectuer TLC 16 et le test de Kaiser (une couleur bleue confirme la présence de NH 2 libre) 17 (voir étape 1.4) pour confirmer la achèvementsn de la réaction. Si la réaction est terminée, passez à la précipitation de l' éther, tel que mentionné pour le produit 1 (étapes 1,4-1,6).
  10. Sécher le produit polymère 2 (MeO-PEG 5K - Lys (NH 2) 2) sous vide.
  11. Effectuer un tour de plus de (Fmoc) 2 Lys-OH-accouplement sur l' intermédiaire 2 (étapes 1,1-1,7) pour générer des produits 3 (MeO-PEG 5K Lys (Lys (NH-Fmoc) 2) 2). De-protéger (étapes 01.08 à 01.10) les groupes Fmoc (4, Meo-PEG 5K Lys (Lys (NH 2) 2) 2) et deux (étapes 1,1-1,7) le (Fmoc) Lys (Boc) -OH à générer une polylysine dendritique de troisième génération (5, MeO-PEG-Lys - Lys 5k 2 - ((Fmoc) Lys (Boc)) 4) terminé par quatre groupes Boc et Fmoc sur une extrémité de la chaîne de PEG.
  12. Transférer le polymère intermédiaire obtenu 5 dans un ballon de réaction. dans la mesureballon de réaction eparate, préparer 1: 1 (v / v) d'acide trifluoroacétique (TFA) dans du dichlorométhane (DCM). Ajouter 15-20 ml d'un mélange 1: 1 TFA / DCM (volume / volume) du polymère intermédiaire 5. On agite le mélange jusqu'à ce que le polymère soit complètement dissous. Agiter pendant une 3 heures supplémentaires.
  13. Effectuer TLC 16 et le test de Kaiser (une couleur bleue confirme la présence de NH 2 libre) 17 (voir l' étape 1.4) pour confirmer l'achèvement de la réaction. Si la réaction est terminée, on évapore le mélange de polymère-dans-TFA / DCM avec de l'air jusqu'à l'obtention d'une solution visqueuse. Procéder à la précipitation de l' éther, tel que mentionné pour le produit 1 (étapes 1,4-1,6). Sécher le produit polymère 6 (MeO-PEG 5k Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys (NH 2)) 4) sous vide.
  14. Polymère intermédiaire 6 dans un ballon de réaction de transfert. Utilisez environ 40 ml de DMF anhydre contenant 8 équiv. de N, N -diisopropylethylamine (DIEA) pour dissoudre le polymère intermédiaire 6. Dans un récipient en verre, dissoudre 12 équiv. de HOBt, 12 équiv. de DIC, et 12 équiv. de (Fmoc), Cys (Trt) -OH dans 20 à 25 ml de DMF anhydre. Agiter pendant 10-15 min, puis ajouter le mélange réactionnel dans le ballon de réaction contenant 6. Exécutez la réaction pendant la nuit.
  15. Confirmer l'achèvement de la réaction avec TLC 16 et le test de Kaiser (voir l' étape 1.4; une couleur jaune indique l'absence de NH2 libre) 17. Si la réaction est terminée, passez à la précipitation de l' éther, tel que mentionné pour le produit 1 (étape 1,4-1,6), pour isoler le produit 7 (MEO-PEG 5K Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys - ((Fmoc) Cys (Trt))) 4.
  16. Effectuer Fmoc de protection sur 7, comme indiqué à l' étape 1.8, pour obtenir un produit 8 (PEG 5K Lys-Lys 2 - (Lys (NH 2) - (Cys (NH 2) (Trt))) 4). Couple (Fmoc) -PEG 2 -Suc-OH (linker "Ebes", 24 équiv.) Sur un couplage polymère intermédiaire en utilisant la procédure décrite ci - dessus pour HOBt / DIC médiation pour obtenir l' intermédiaire 9 (MEO-PEG 5K Lys-Lys 2 Lys 4 - (Cys (Trt) ) 4 (Ebes (NH-Fmoc)) 8).
  17. Effectuer un tour de plus de Fmoc de protection (étapes 1,6-1,8) pour obtenir l' intermédiaire 10 (MEO-PEG 5K Lys-Lys 2 Lys 4 - (Cys (Trt)) 4 (Ebes (NH 2)) 8).
  18. Transférer le polymère intermédiaire 10 dans un ballon de réaction et ajouter du DMF anhydre (environ 30 à 40 ml) pour le dissoudre. Dans un autre ballon de réaction, dissoudre 24 équiv. de CAOSu (préparé selon le mode opératoire publié antérieurement) dans du DMF anhydre (20-30 ml) 18. Ajouter 48 équiv. de N, N - diisopropyléthylamine et laisser agiter pendant 10-15 min. Transférer le contenu dans le flacon de réaction contenant 10 et laisser la réaction run overnight.
  19. Confirmez l'achèvement de la réaction avec TLC 16 et le test de Kaiser (voir l' étape 1.4; une couleur jaune indique l'absence de NH2 libre) 17. Si la réaction est terminée, passez à la précipitation de l' éther, tel que mentionné pour le produit 1 (étapes 1,4-1,6) pour isoler le produit 11 (MEO-PEG 5K Lys-Lys 2 Lys 4 - (Cys (Trt)) 4 -Ebes 8 -CA 8). Dialyser dans de l'eau désionisée et on lyophilise l'échantillon pour donner une poudre blanche.
  20. Placer le polymère intermédiaire 11 dans un ballon de réaction. Préparer et ajouter 20 ml de TFA / 1,2-éthanedithiol (EDT) / triéthylsilane (SIT) / H 2 O (94 / 2,5 / 1 / 2,5, v / v) dans la solution de polymère. Incorporer le mélange jusqu'à dissolution complète. Exécutez la réaction pendant 4 heures. Confirmer l'achèvement de la réaction par CCM 16.
  21. Sous la hotte, souffler de l' air dans le polymère-TFA / EDT / TIS / H 2mélange O jusqu'à ce que la solution devient visqueuse. Procéder à la précipitation de l' éther, comme indiqué pour le produit 1 (étapes 1.4 à 1.6), pour isoler le produit final, 12 (PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8). Dissoudre dans de l'acétonitrile et lyophilisé pour donner une poudre blanche.

2. Préparation de micelles PTX-chargés

  1. Préparer un PTX-chargé PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 micelles en utilisant la méthode d'évaporation standard.
    1. Dissoudre 20 mg de DT avec une quantité différente de PTX (1-9 mg) dans 1 ml de chloroforme (CHCI3). Éliminer le solvant en utilisant un évaporateur rotatif pour obtenir un film de polymère homogène et sec. Reconstituer le film avec 1 ml de tampon phosphate salin (PBS) par vortex, puis par traitement aux ultrasons pendant 30 min à 40 kHz, le cas échéant, pour permettre la formation de micelles chargées de médicament.
    2. Ajouter 6 ul de 3% (p / p) H 2 O 2 (1 équiv. De free les groupes thiol) pour oxyder les groupes thiol sur le TD. Utilisez la solution micellaire pour une caractérisation plus poussée une fois que le niveau des groupes thiol libres reste à des valeurs constantes faibles, comme indiqué par le test de Ellman 19.
    3. On filtre la solution avec un filtre de 0,22 pm pour stériliser l'échantillon. Analyser la quantité de médicament chargée dans les micelles d'un 20 système HPLC après la libération des médicaments à partir des micelles en y ajoutant 9 fois l' acétonitrile et en effectuant 10 minutes de sonication. Utiliser une colonne HPLC C18 avec un mélange acétonitrile / eau comme phase mobile.
    4. Calculer la charge de médicament en fonction de la courbe d'étalonnage entre les valeurs de surface par HPLC et les concentrations du médicament standard 11.
      NOTE: L'efficacité de chargement est défini comme le rapport du médicament chargé dans les micelles de la teneur initiale en médicament.

3. Caractérisations de micelles

  1. Mesurer la répartition de la taille et de taille micelles avec une diffusion de lumière dynamique (DLS) instrument 29. Effectuer les mesures à la température ambiante et de maintenir la concentration de micelles à 1 mg / ml.
    REMARQUE: Pour effectuer l'analyse granulométrique, utilisez PBS comme vide, puis enregistrer la taille des particules pour les échantillons réels. Prenez les lectures en triple pour les échantillons, puis la moyenne des lectures.
  2. Utilisez les spectres de fluorescence pour mesurer la concentration micellaire critique (CMC) de PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 avant et après réticulation avec pyrène comme sonde fluorescente hydrophobe, comme décrit précédemment 13,21.
    NOTE: En règle générale, la concentration micellaire est comprise entre 5 × 10 -7 à 5 × 10 -4 M.

4. Stabilité des micelles en SDS avec ou sans agents réducteurs

  1. Préparer des solutions mères de dodécylsulfate de sodium (SDS) à une solution (7,5 mg / ml) et de disulfure de micelles réticulées (1,5 mg / ml) dans du PBS. Ensuite, uchanter les solutions mères, faire un mélange de solution dans laquelle la concentration finale SDS est à 2,5 mg / ml et la concentration de micelles est à 1,0 mg / ml.
  2. Mesurer la distribution de taille et la taille (comme indiqué à l'étape 3.1), des solutions micellaires, à des intervalles de temps prédéterminés, avec ou sans la présence de glutathion 10 mM (GSH).

5. hémolyse Assay

  1. Évaluer le potentiel hémolytique de micelles PTX-chargé, non-réticulés (PTX-MR) préparé selon une procédure publiée précédemment 11 et micelles réticulées PTX-chargés (PTX-RDR) en utilisant du sang frais citraté de souris nues recueillies à partir de la queue voile.
    1. Collecter des globules rouges par centrifugation des échantillons de sang (1,0 ml) à 1000 g pendant 10 min, les laver trois fois avec du PBS, puis remettre en suspension les culots cellulaires avec du PBS jusqu'à une concentration finale de 2%.
  2. Mélanger 200 pi de suspension d'érythrocytes avec des concentrations différentes (0,2 et 1,0mg / ml) de PTX-MR et PTX-DCMs, respectivement, et incuber pendant 4 heures à 37 ° C dans un agitateur incubateur.
  3. Centrifuger les mélanges micelles-érythrocytaires à 3000 xg pendant 5 min. Transférer 100 pl de surnageant de tous les échantillons dans une plaque à 96 puits. Mesurer l'absorbance de l'hémoglobine libre dans le surnageant à 540 nm en utilisant un lecteur de micro-plaque.
    NOTE: Les globules rouges incubées avec le Triton-100 (2%) et du PBS doivent être utilisées en tant que témoins positifs et négatifs, respectivement. Le pour cent de l'hémolyse des globules rouges est calculée avec la formule suivante: RBC hémolyse = (OD échantillon - OD contrôle négatif) / (contrôle positif OD - témoin négatif OD) x 100%.

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Representative Results

Préparation et caractérisation des drogues chargé, micelles Disulfure réticulés

Amphiphiles polymères PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 est un dendrimère susceptible de former un système micellaire disulfure réticulé pour la délivrance de médicaments anticancéreux. Structurellement, il est défini comme un oligomère dendritique d'acide cholique (domaine hydrophobe) reliés à une extrémité de la molécule linéaire de PEG (domaine hydrophile, le poids moléculaire 5K) par l'intermédiaire d'un poly ramifié (lysine-cystéine Ebes) squelette. Il existe plusieurs avantages de l'utilisation de ces copolymères à blocs par rapport aux autres systèmes micellaires signalés. Tout d'abord, il peut être facilement synthétisé par des réactions de condensation en phase de solution par étapes. En second lieu, par rapport à plusieurs autres polymères amphiphiles signalées, le système polymère thiolé, préparé par la phase de solution bien établie par étapes la chimie des peptides Fmoc, a une structu bien définieré. Il peut être stocké sous forme de poudre lyophilisée et a une durée de vie prolongée.

Plusieurs techniques peuvent être utilisées pour caractériser le produit final. La quantité d'acide cholique attaché à TD peut être détecté en comparant le rapport du signal des protons sur le PEG à ceux des trois groupes méthyle de l' acide cholique dans les spectres RMN 1H. Les poids moléculaires de la DT peut être confirmée par spectrométrie et chromatographie par perméation de gel en masse MALDI-TOF (GPC). Le test de Ellman quantitative peut être utilisée pour déchiffrer le nombre de résidus cystéine libres présents par molécule.

PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 peut auto-assembler pour former des micelles dans des milieux aqueux. En utilisant un procédé d'évaporation de solvant standard, une variété de médicaments hydrophobes tels que la PTX et la vincristine, ont été encapsulés avec succès dans les micelles 13,22. OXYGen a déjà été utilisé pour oxyder les groupes thiol libres de PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 et pour former disulfures liaisons transversales intra-micellaires. Comme contrôlé par le test d'Ellman, le taux de groupements thiol libres de conversion au disulfure liaisons atteint 85% après 48 h d'oxydation. AH 2 O 2 médiée oxydation a récemment été utilisé comme une méthode alternative. Le taux de conversion a atteint 88% en 30 min (figure 2), qui était 96 fois plus rapide que l'approche précédente. Cinquante grammes de PTX-chargé, disulfure nanoparticules réticulées ont été produits avec succès en utilisant cette approche plus efficace (figure 3). La taille de particule était d' environ 27 nm, avec une distribution de taille étroite (figure 3). L'efficacité de chargement de médicament a approché 100% avec PTX charge de 4,0 mg / ml. Disulfure réticulation a eu un effet dramatique sur la valeur CMC. Par rapport à la norme TD PEG 5K -CA 8 qui manquentliaisons disulfure, la TD réticulé ont montré une diminution de 10 fois les valeurs observées CMC (5,53 uM par rapport à 0,67 uM) 13.

Etudes de stabilité

Nous avons étudié davantage la stabilité du PTX-chargés, micelles réticulées disulfure contre les conditions de micelles perturbateurs graves. dodécyl sulfate de sodium (SDS) est un détergent ionique fort qui est couramment utilisé pour évaluer la stabilité micellaire, car il peut efficacement briser micelles polymériques. La stabilité des micelles, chargés de médicament disulfure réticulé (1,0 mg / ml) a été contrôlée par DLS en présence de la micelle perturbant le SDS (2,5 mg / ml). La taille des particules des micelles est restée stable au cours du temps, ce qui indique que de telles micelles réticulées sont restés intacts (figure 4, les panneaux de gauche). conditions réductrices sont attendus pour cliver les liaisons disulfure dans le noyau hydrophobe, thereby rendant micelles sensibles à la déstabilisation. Glutathione (GSH), un agent réducteur endogène, est souvent utilisé pour de telles études. Il n'y a en contraste frappant avec le taux intracellulaire de GSH par rapport au niveau extracellulaire (10 mm par rapport à 2 um). Cette différence de concentrations est souvent utilisé pour générer des systèmes stimuli-sensibles. Après l'addition de GSH à une concentration intracellulaire (10 mm) 23, la taille des micelles, réticulés disulfure chargés en médicament est resté intact pendant 30 min. Ils brusquement diminué à 1 nm, ce qui signifie la réduction d'un nombre critique de liaisons disulfure, une condition préalable de la dissociation rapide des micelles (figure 4, panneau de droite). Au contraire, le système reste stable en présence de concentrations extracellulaires de GSH (données non présentées).

Étude de l' hémolyse

FigureLa figure 5 montre des différences dans l'activité hémolytique observée des micelles chargées PTX, avec ou sans reticulation disulfure. Hémolyse des globules doit être évitée lors de l'administration de ces particules dans le flux sanguin, car elle porte atteinte à leurs avantages thérapeutiques. Hémato-compatibilité est très important pour l'application in vivo des transporteurs de médicaments à base de polymères, tels que les Tou amphiphiles qui ont le potentiel pour solubiliser les lipides ou de s'insérer dans des membranes phospholipidiques, ce qui conduit à la rupture des membranes plasmiques. Comme on le voit sur la figure 5, la PTX-MR ont été trouvés pour avoir une globule rouge dose-dépendante (RBC) , le nombre de lyse, le pourcentage d'hémolyse est passée de 8,1% à 14,2% lorsque la concentration de PTX-MR est passée de 0,2 mg / ml à 1,0 mg / ml. Cependant, PTX RDRs qui ont une reticulation disulfure n'a montré aucune activité hémolytique observable (<1,0%) dans les globules rouges, dans les mêmes conditions expérimentales. Cette différence dans les hemolysest tendance peut être attribuée aux ponts disulfure intra-micellaire présents au noyau hydrophobe, qui empêchent PTX-DCMs de dissociant pour former TDs amphiphile.

Figure 1
Figure 1: Les étapes de formation de micelles réticulées. Représentation schématique des micelles réticulées disulfure formés par oxydation des thiolé telodendrimer PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 après l' auto-assemblage. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Méthode d'oxydation pour la formation de micelles réticulé. Le taux de t de conversionil thiol sur les TDs au disulfure obligations en fonction du temps d'oxydation pour les deux procédés d'oxydation. La concentration totale des micelles a été maintenue à 20 mg / ml. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Médicament chargé, micellaire réticulé. Panneau de gauche: une image d'un lot de PTX-chargés, micelles réticulées disulfure. Barre d'échelle: 1 pouce. Panneau de droite: la taille des particules, tel que déterminé par diffusion de lumière dynamique (DLS). La concentration totale de micelles a été maintenue à 20 mg / ml. Le chargement de la PTX a été de 4 mg / ml. Les données de taille de particule a été montré que la taille de particule moyenne ± écart-type sur la base de trois mesures. SD: écart-type, décrit la largeur de la distribution mesurée de la taille des particules.S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Etude de stabilité. La taille des particules chargées PTX, des micelles réticulées disulfures en présence de 2,5 mg / ml de SDS, sans (à gauche) ou avec (à droite) en GSH (10 mM), tel que mesuré par DLS. Les données de taille de particule a été montré que la taille de particule moyenne ± écart-type sur la base de trois mesures. SD: écart-type, décrit la largeur de la distribution mesurée de la taille des particules. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5: dosage de l' hémolyse. Les activités hémolytiques in vitro de PTX-chargées, des micelles réticulées disulfures en comparaison avec les micelles non réticulé sur les globules rouges (hématies). Triton-100 (2%) et du PBS ont été utilisés comme témoins positifs et négatifs, respectivement. Les valeurs rapportées sont la moyenne ± écart-type d'échantillons en triple. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Plusieurs nanoparticules ont été étudiés pour leur utilisation potentielle dans l'administration de médicaments. doxorubicine liposomale et le paclitaxel (PTX) chargé en sérumalbumine nano-agrégats humains sont parmi les nanotherapeutics approuvés par la FDA pour le traitement du cancer. Cependant, bien que cliniquement efficace, ces deux nanotherapeutics sont relativement "grande" taille, et ils ont tendance à s'accumuler dans le foie et les poumons. micelles polymériques avec des tailles de particules relativement plus petites et plus les capacités de chargement médicaments sont nanocarriers pour l'administration de médicaments émergents. Leur structure unique core-shell '' solubiliser '' les molécules médicamenteuses hydrophobes dans des conditions aqueuses par encapsulation physique. Les micelles polymériques composées de TDs bien définis préparés dans notre formulaire de laboratoire nanoparticules monodispersées (taille de particules de 10-50 nm) avec une durée de vie longue et une efficacité élevée à encapsuler des médicaments. L'un des nombreux avantages de la plate-forme de solide TD est la polyvalence du polymère.De nombreux médicaments, des colorants fluorescents et des ligands de ciblage peuvent être facilement intégrés dans la plate - forme TD 13,15,24.

Étapes critiques dans le Protocole

Nous avons développé une réversible, un système de disulfure réticulé micellaire solide pour la livraison PTX, qui est bien définie, avec une taille de particule d'environ 27 nm et a une distribution de taille étroite. Les TDs ont été synthétisés par l'intermédiaire d'une solution par étapes de peptides en phase chimie. La structure chimique bien définie de ces TDs est le facteur clé pour générer des nanoparticules avec les propriétés souhaitées. Par conséquent, ce qui confirme l'achèvement de la réaction par le test de Kaiser CCM et est très critique. H 2 O 2 est l' oxydation en outre une étape critique, les groupes thiol sur la TD sont oxydées pour former des ponts disulfure des liaisons transversales, ce qui améliore grandement la stabilité des micelles. Par rapport à notre procédé d'oxydation à base d' oxygène précédent, le H 2 O 2 -Procédé d'oxydation à base de 96 fois plus rapide, permettant ainsi de micelles réticulées dans des périodes de temps plus courtes. En outre, GSH, un tripeptide contenant un thiol, est un anti-oxydant importante produite par les cellules, et elle joue un rôle important dans le piégeage des radicaux libres et des composés réactifs de l'oxygène. Il fait des contributions majeures en maintenant l'homéostasie redox cellulaire. La concentration cellulaire de GSH est un aspect intéressant de la conception de médicaments. La concentration intracellulaire de GSH est maintenant fermement établie pour être sensiblement supérieure à la concentration extracellulaire (10 mM contre 2 uM, respectivement) 25. Plus important encore , un taux de GSH intracellulaire élevé a souvent été rapportée dans de nombreuses cellules tumorales humaines et murines résistantes aux médicaments 26. La distribution intracellulaire de GSH élevée facilite la rupture du disulfure de réticulation des micelles et entraîne la libération et l'accumulation de la charge utile de la drogue. Les nanoparticules réticulées sont disulfuresstable en présence de SDS. Cependant, un environnement intracellulaire GSH riche déclenche la libération du médicament en brisant les liaisons disulfures, déstabilisant ainsi le système. hémolyse induite polymère résulte de l'interaction néfaste des micelles polymères avec des constituants du sang tels que les globules rouges. micelles réticulées ont montré beaucoup moins hémolyse par rapport aux analogues non-réticulés.

Modifications et dépannage

En utilisant H 2 O 2 comme agent oxydant permet une formation plus efficace de disulfure de réticulation par rapport à la méthode précédemment rapporté à base d' oxygène 13. H 2 O 2 est un agent oxydant fort 27 qui est peu coûteux et très soluble dans l' eau et donne des produits de haute qualité par rapport à d'autres agents oxydants connus (par exemple, chromate ou permanganate). Cependant, le temps d'oxydation peut être nécessaire further optimisés en fonction de l'échelle de la synthèse.

Limites de la technique

H 2 O 2 est un oxydant puissant. Même si une faible concentration de H 2 O 2 est utilisé pour effectuer la formation de disulfure de réticulation, les soins doivent être prises lors de l' utilisation avec des TDs chargés de médicaments «sensibles à l'oxydation» pour prévenir la dégradation du médicament indésirable.

Importance de la technique par rapport aux méthodes existantes / alternatives

La technique décrite est une installation expérimentale simple qui peut être facilement reproduit dans un laboratoire standard. Par exemple, le chargement de la drogue au moyen d'un procédé d'évaporation classique est moins chronophage en comparaison à la méthode de dialyse. La formation de liaisons disulfure dans le noyau à l' aide de H 2 O 2 comme agent d' oxydation est 96 fois plus rapide que le procédé d'oxydation précédemment en utilisant oxygfr 13. Reproductibilité de l'étape de chargement de médicament peut être facilement évaluée en mesurant la taille des particules (méthode DLS) et la teneur en médicament (HPLC).

Applications futures ou les directions après Maîtriser cette technique

Par rapport aux médicaments à petites molécules, l' un des principaux obstacles qui doivent être surmontés avant que la nanomédecine peut entrer intégrer les établissements de soins de cancer est les défis techniques de l' intensification de la production 28. Après la maîtrise de cette technique nouvellement développée, on peut facilement synthétiser disulfure micelles réticulées sur une grande échelle. Cela est extrêmement souhaitable pour les études cliniques de cette nano-formulation chez des patients humains.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
MeO-PEG5K-NH2 Rapp Polymere 125000-2
Fmoc-Lys(Fmoc)-OH Aaptec AFK107
Fmoc-Lys(Boc)-OH Anaspec AS-20132
Fmoc-Cys(Trt)-OH Aapptec AAC105
Dimethylformamide Fisher Scientific BP1160-4
Ethyl ether Fisher Scientific E134-20
N,N-Diisopropylethylamine Sigma Aldrich D125806
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich T6508 Corrosive, handle with care
4-methyl piperidine Alfa-Aesar L-02709
Ebes linker Anaspec AS-61924
Cholic acid Sigma Aldrich C1129
1,2-Ethanedithiol Sigma Aldrich 02390 Handle inside fume hood. Bleach gloves after usage.
Triisopropylsilane Sigma Aldrich 233781
Chloroform (anhydrous) Sigma Aldrich 288306
Hydrogen peroxide solution 30% Aaron Industries NA
HoBt-Cl Aaptec CXZ096
DIC Sigma Aldrich D125407
Female athymic nude mice (Nu/Nu strain), 6–8 weeks age Harlan (Livermore, CA)

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Une approche efficace et Facile pour la production de micelles réversible Disulfure réticulés
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Li, Y., Bharadwaj, G., Lee, J. S. A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles. J. Vis. Exp. (118), e54722, doi:10.3791/54722 (2016).

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