Abstract
ナノメディシンは、生物医学アプリケーションのスケールでナノメートルの粒子の独特の特性を活かした治療の新たな形です。治療結果を最大にするために、薬剤に関連する副作用を軽減するための薬物送達を向上させる現代のナノ医療の基礎の一部です。特に、ナノ粒子は、癌治療に広く応用されています。デザイン、アプリケーション、および腫瘍の微小環境に基づいて、生産の高度な柔軟性を提供するナノ粒子は、臨床診療への迅速な翻訳をより効果的であることが予測されています。高分子ミセル、ナノキャリアは、薬物送達用途のために人気があります。
この記事では、我々は明確に定義された両親媒性の線状の樹状共重合体（telodendrimer、TD）の自己組織化に基づく薬物負荷、ジスルフィド架橋されたミセルを合成するためのシンプルで効果的なプロトコルを記述します。 TDは、ポリエチレンGLから構成されています親水性セグメントおよび溶液ベースのペプチド化学を用いて、アミン末端PEGに段階的に取り付けられたコア用疎水性部分としてチオール化コール酸クラスタとしてycol（PEG）。例えば、パクリタキセル（PTX）のような化学療法剤は、標準的な溶媒蒸発法を使用してロードすることができます。 O 2媒介性酸化は、以前のTD上の遊離チオール基からイントラミセルジスルフィド架橋を形成するために利用されました。しかし、反応が遅く、大量生産のために実行可能ではなかったです。最近、H 2 O 2媒介酸化法は、より実現可能かつ効率的な方法として調査し、それが以前に報告された方法よりも96倍高速でした。このアプローチを用いて、PTX装填、ジスルフィド架橋されたナノ粒子50gを正常に狭い粒度分布および高い薬物負荷効率で製造されています。得られたミセル溶液の安定性は、共培養Wなどの破壊条件を用いて分析します還元剤を伴うまたは伴わない洗剤、ドデシル硫酸ナトリウム、第i。その非架橋対応物と比較した場合、薬物負荷、ジスルフィド架橋されたミセルは、以下の溶血活性を示しました。
Introduction
ナノテクノロジーは、生物医学分野1の数を恩恵を受けている高速新興分野です。ナノ粒子は、従来の治療法の他の種類と実現不可能な特性を設計およびチューニングのための機会を提供しています。ナノキャリアは、生分解に対する薬物の安定性を向上させる、薬物の循環時間を延長、薬物の溶解度の問題を克服し、および標的薬物送達のために、1,2-同時送達造影剤のために微調整することができます。ナノ粒子ベースの送達システムは、癌の画像化および治療に有望です。腫瘍血管系は、巨大分子への漏出性であり、強化された透過性および保持（EPR）効果3を介して腫瘍部位でのナノ粒子の循環の優先的な蓄積につながることができます。積極的に抗がん剤の担体として追求されているいくつかのナノキャリア（ 例えば、リポソーム、ヒドロゲル、および高分子ミセル）の中でも、高分子ミセルは、番目の上に広い人気を得ています電子十年間4,5。
高分子ミセルは、静脈内投与には、潜在的にユニマーにそれらの解離をもたらす、臨界ミセル濃度（CMC）以下に希釈することができる、熱力学的システムです。架橋戦略はユニマーにミセル解離を最小化するために使用されてきました。しかし、過度に安定化されたミセルは、それによって全体的な治療効果を低下させる、標的部位での放出の薬物を防止することができます。いくつかの化学的アプローチが作るために検討されている架橋酸化還元に応答して、または、そのような還元可能なジスルフィド結合6,7およびpH-切断可能な8または加水分解可能なエステル結合の9,10などの外部刺激に分解可能。
我々は以前11-15 telodendrimers（TD）と呼ばれる樹状コール酸（CA）ブロック、直鎖ポリエチレングリコール（PEG）コポリマーからなるミセル、ナノ粒子の設計および合成が報告されていますNK -CAyとして表現されている（キロダルトンではn =分子量（K）、yはコール酸（CA）単位の数を=）。それらは、疎水性コア中のパクリタキセル（PTX）およびドキソルビシン（DOX）などのカプセル化薬剤におけるそれらの小さなサイズ、長い貯蔵寿命、及び高い効率によって特徴付けられます。例えばPEG、リジン、およびCAなどTDのビルディングブロックは、生体適合性であり、そしてPEGコロナの存在は、細網内皮系によってミセル化ナノ粒子の非特異的な取り込みを防止する、「ステルス」ナノ粒子特性を付与することができます。
チオール化線形樹枝状ポリマーは、簡単に私たちの標準のTDの樹状オリゴリジン骨格にシステインを導入することによって生成することができます。この記事では、のTDの疎水性コア（ 図1）にジスルフィド架橋を導入することによって、可逆的に架橋されたミセル薬物送達システムを製造するための容易なプロトコルを提示します。
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Protocol
倫理の声明：メス無胸腺ヌードマウス（ニュー/ニュー株）、6〜8週齢は、購入した後、AAALACガイドラインに従って病原体を含まない条件下で飼育し、任意の実験の前に、少なくとも4日間順化させたれました。全ての動物実験は、機関のガイドラインに準拠して行われ、プロトコル番号07から13119と第09から15584によると、カリフォルニア大学デービス校での動物の使用およびケア管理諮問委員会によって承認されました。
TD PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8の1の合成
- 丸底フラスコに、無水ジメチルホルムアミド（DMF）、氷上で寒さの10〜20 ml中のMeO-PEG 5K -NH 2（2グラム、0.4ミリモル）を溶解。
- ガラスビーカー中で、3当量を溶解します。 1-ヒドロキシ-6-クロロ - ベンゾトリアゾール（HOBt）とのエステル、3当量の。 N、N N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、および3当量の。無水D中のカルボニル（Fmoc）2のLys-OHMF（10-15 ml）を。磁気撹拌プレート上で15〜20分間攪拌します。
- 氷浴を外し、室温で一晩反応混合物を攪拌のMeO-PEG 5K -NH 2を含む反応フラスコに混合物を追加します。
- 薄層クロマトグラフィー（TLC）16とカイザーテスト17（黄色が遊離NH 2が存在しないことを示している）との反応の完了を確認します。反応フラスコを氷冷エーテル約200 mlで添加することによって、（2のMeO-PEG 5K -Lys（NH-Fmocの）1）ポリマー生成物を沈殿させます。遠心分離（6,000×gで、4℃で6分）を経由して沈殿したポリマーを分離します。
- TLCを行うために、シリカゲルでコーティングされたTLCプレート上のサンプルを見つけます。ジクロロメタン/メタノールを使用し（9：1）を移動相として。 TLCプレートを展開した後、UVランプの下でスポットを観察します。 1つはまた、ホットプレート上のアミンスポットを可視化するために染色試薬をニンヒドリン使用することができます。
- カイのためにSERのテスト、カイザーの試薬を含有するガラス管にサンプルを少し置きます。 5分間、100℃でこれを加熱して（溶液の色が黄色のままであれば、反応が完了した）色の変化を見ます。
- 再溶解する（ステップ1.4を参照）の無水DMF中の製品（10〜20 ml）を、沈殿、遠心分離を繰り返します。
- その後、繰り返しステップ1.5、および氷冷エーテルでポリマー沈殿物を3回洗浄します。
- クリーンな反応フラスコにポリマー沈殿物1を移し、残留エーテルを除去するために、高真空源にフラスコを接続します。
- 1中間体をポリマーにDMF中の20％の約20〜30ミリリットル（v / v）の4メチルピペリジンを準備して追加します。完全に溶解するまで撹拌します。 3時間の反応を実行します。
- completioを確認するためにTLC 16とカイザーのテストを（青色が遊離NH 2の存在を確認）17（ステップ1.4を参照）を実行反応のn個。反応が完了した場合、（1.4〜1.6ステップ）製品1で述べたように、エーテル沈殿に進みます。
- 真空下でポリマー生成物2（のMeO-PEG 5K -Lys（NH 2）2）を乾燥させます。
- （1.1から1.7ステップ）製品3を生成する中間体2の上にカルボニル（Fmoc）2のLys-OH結合の1以上のラウンドを行う（のMeO-PEG 5K -Lys（リジン（NH-のFmoc）2）2）。脱保護（1.8から1.10ステップ）のFmoc基（4、のMeO-PEG 5K -Lys（リス（NH 2）2）2）と夫婦（1.1から1.7ステップ）カルボニル（Fmoc）のLys（BOC）-OHへ第三世代の樹枝状ポリリジン生成（5、のMeO-PEG 5K -Lys-Lysの2 - （カルボニル（Fmoc）のLys（BOC））4）PEG鎖の一方の端部にある4つのBocおよびFmoc基で終端。
- 反応フラスコに得られたポリマー中間体5を転送します。以下のように、ジクロロメタン（DCM）中の1（v / v）のトリフルオロ酢酸（TFA）：eparate反応フラスコに、1を準備します。ポリマー5の中間に1 TFA / DCM（v / v）の混合物：1 15-20 mlを加え。ポリマーが完全に溶解するまで混合物を撹拌しました。さらに3時間撹拌。
- 反応の完了を確認するために（青色が遊離NH 2の存在を確認）17（ステップ1.4を参照）TLC 16とカイザーのテストを実行します。反応が完了した場合、粘性溶液が得られるまで、空気とポリマー型TFA / DCM混合物を蒸発させます。 （1.4から1.6ステップ）製品1で述べたように、エーテル沈殿に進んでください。真空下で- （（（のFmoc）のLys（NH 2））4 -Lys-Lysの2のMeO-PEG 5K）ポリマー生成物6を乾燥させます。
- 反応フラスコに6中間転写ポリマー。 8当量を含む無水DMFの約40ミリリットルを使用してください。 Nの、N個の -diisopropylethylamiNE（DIEA）は、ポリマー中間体6を溶解しました。ガラスビーカー中で、12当量を溶解します。 HOBt、12当量。 DIC、および12当量の。無水DMF 20〜25ミリリットル中にカルボニル（Fmoc）のCys（Trtの）-OHの。 10〜15分間振盪し、次いで6を含む反応フラスコに反応混合物に加えます。一晩反応を実行します。
- TLC 16とカイザーのテストとの反応の完了を確認し（ステップ1.4を参照してください。黄色は遊離NH 2が存在しないことを示している）17。 （カルボニル（Fmoc）のLys - - （カルボニル（Fmoc）のCys反応が完了した場合、（のMeO-PEG 5K -Lys-Lysの2生成物7を単離するために、生成物1（ステップ1.4〜1.6）で述べたように、エーテル沈殿に進み（Trtの）））4。
- ステップ1.8で概説したように、7上のFmoc脱保護を行い、生成物8を得るために、（PEG 5K -Lys-Lysの2 - （Lysの（NH 2） - （Cysを（NH 2）（Trtの）））4）。カップルカルボニル（Fmoc）-PEG 2 -Suc-OH（「EBES「リンカー、24当量）ポリマー中間体上の中間9（のMeO-PEG 5K -Lys-Lysの2 -Lys 4得るためのHOBt / DIC媒介カップリングのために上に概説した手順を使用して- （システイン（Trtのを） ）4（EBES（NH-のFmoc））8）。
- Fmocの脱保護の1以上のラウンドを実行します（1.6から1.8ステップ）中間体10を取得する（のMeO-PEG 5K -Lys-Lysの2 -Lys 4 - （システイン（Trtの））4（EBES（NH 2））8）。
- 反応フラスコにポリマー中間体10を転送し、それを溶解させ、無水DMF（30〜40 ml）を追加します。別の反応フラスコに、24当量を溶解します。無水DMF中の（以前に公開された手順に従って調製）CAOSu（20〜ml）を18。 48当量を追加します。 N、N-ジイソプロピルエチルアミンの、それは10〜15分間攪拌しましょう。 10を含有する反応フラスコに内容物を移し、反応はO実行してみましょうvernight。
- TLC 16とカイザーのテストとの反応の完了を確認し（ステップ1.4を参照してください。黄色は遊離NH 2が存在しないことを示している）17。 （のCys（Trtの））4 -Ebes -反応が完了した場合、製品11（のMeO-PEG 5K -Lys-Lysの2 -Lys 4を分離するために（1.4から1.6ステップ）製品1で述べたように、エーテル沈殿に進みます8 -CA 8）。脱イオン水の中に透析し、白色粉末を得た試料を凍結乾燥。
- 反応フラスコに中間体ポリマー11を配置します 。準備し、ポリマー溶液にTFA / 1,2-エタンジチオール（EDT）/トリエチルシラン（TIS）の20ミリリットル/ H 2 O（94 / 2.5 / 1 / 2.5、v / v）の混合物を追加します。完全に溶解するまで混合物を攪拌します。 4時間の反応を実行します。 TLC 16により反応の完了を確認してください。
- ヒュームフードの下では、ポリマー-TFA / EDT / TIS / H 2に空気を吹き込みますOの混合溶液が粘性になるまで。最終製品、12（PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8）を単離するために、（1.4〜1.6ステップ）製品1で述べたように、エーテル沈殿に進んでください。アセトニトリル中に溶解し、白色粉末を得、それを凍結乾燥。
PTX装填ミセルの調製
- 標準的な蒸着法を用いて、PTX-ロードPEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8ミセルを準備します。
- クロロホルムの1ミリリットル（のCHCl 3）でPTXの異なる量（1-9 mg）を用いてTD 20mgを溶解させます。均質、乾燥ポリマーフィルムを得るために、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去します。薬物負荷ミセルの形成を可能にするために、必要に応じて、40 kHzで30分間超音波処理に続いて、ボルテックスによってリン酸緩衝食塩水（PBS）1mlでフィルムを再構成します。
- 3％の6μlの（w / w）のH 2 O 2（1当量を追加します。FRにTD上のチオール基を酸化する）チオール基をEE。エルマン試験19で示すように、遊離チオール基のレベルは、一定の低い値のままで一度、さらなる特徴付けのためのミセル溶液を使用してください。
- サンプルを滅菌するために0.22μmのフィルターでソリューションをフィルタリングします。 9回のアセトニトリルを添加し、超音波処理の10分を実行することによって、ミセルからの薬物を解放した後、HPLC 20システムにミセルに装填された薬物の量を分析します。移動相としてアセトニトリル/水を用いてHPLC用C18カラムを使用してください。
- HPLC面積値と11の標準的な薬剤の濃度の間の検量線による薬物負荷を計算します。
注：充填効率が初期薬物含量のミセルに装填薬の比として定義されます。
ミセルの3キャラクタリゼーション
- メートルのサイズとサイズ分布を測定動的光散乱（DLS）測定器29でicelles。室温で測定を行い、1mg / mlのでミセル濃度を保ちます。
注：粒度分析を行うブランクとしてPBSを使用し、実際のサンプルについて粒子サイズを記録します。サンプルのための三連で測定値を取り、その後、測定値を平均します。 - 以前に13,21説明したように、疎水性蛍光プローブとしてピレンとの架橋の前と後のPEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8の臨界ミセル濃度（CMC）を測定する蛍光スペクトルを使用してください。
注：一般的に、ミセル濃度は、5×10 -7〜5×10 -4 Mの範囲であります
4. SDS中のミセルの安定性を持つか、エージェントを低下させることなく、
- PBS中のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）溶液（7.5 mg / mlで）およびジスルフィド架橋ミセル（1.5 mg / mlで）のストック溶液を調製します。次に、U最終SDS濃度がである、混合溶液を作り、原液を歌う2.5ミリリットルミリグラム/及びミセル濃度が1.0 mg / mlでです。
- 10mMのグルタチオン（GSH）の存在の有無にかかわらず、所定の時間間隔でミセル溶液の（段階3.1で述べたように）サイズおよびサイズ分布を測定します。
5.溶血アッセイ
- PTX-ロードされ、非架橋ミセル（PTX-NCMS）の溶血可能性を評価する以前に公開された手順11に従って製造から収集ヌードマウスから新鮮なクエン酸処理血液を用いて、PTX-ロード架橋されたミセル（PTX-のDCM）テールベール。
- 2％の最終濃度まで、10分間1000×gで血液試料（1.0 ml）を、遠心分離によって赤血球を収集するPBSでそれらを3回洗浄し、次いでPBSで再懸濁細胞ペレット。
- 異なる濃度（0.2および1.0で赤血球懸濁液200μlを混ぜますそれぞれPTX-NCMSとPTX-のDCMのmg / mlで）、およびインキュベーターシェーカー中で37℃で4時間インキュベートします。
- 5分間、3000×gでミセル - 赤血球混合物を遠心します。 96ウェルプレートに、すべてのサンプルの上清100μlを移します。マイクロプレートリーダーを用いて540nmで上清中の遊離ヘモグロビンの吸光度を測定します。
注：トリトン-100（2％）とPBSとインキュベートしたRBCを、それぞれ、陽性対照および陰性対照として使用されます。 - /（OD ポジティブコントロール - OD ネガティブコントロール ）×100％RBC溶血=（OD ネガティブコントロール OD サンプル ）：RBCの溶血パーセントは以下の式で計算されます。
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Representative Results
薬物ロードされ、ジスルフィド架橋ミセルの調製とキャラクタリゼーション
両親媒性ポリマーPEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8は、癌薬物送達のためのジスルフィド架橋ミセル系を形成することができる樹枝状ポリマーです。構造的には、分枝状ポリ（リジン - システインEBES）バックボーンを介して線状PEG分子（親水性ドメイン、分子量5K）の一端に連結されたコール酸（疎水性ドメイン）の樹枝状オリゴマーとして定義されます。他の報告されたミセル系のこれらのブロックコポリマーを使用することのいくつかの利点があります。まず、それは容易に段階的な溶液相縮合反応を介して合成することができます。第二に、十分に確立された液相の段階的なFmocペプチド化学によって調製いくつかの他の報告された両親媒性ポリマー、チオール化ポリマー系と比較して、明確に定義されたstructuを有します再。これは、凍結乾燥粉末の形態で保存し、長期貯蔵寿命を有することができます。
いくつかの技術は、最終生成物を特徴付けるために使用することができます。 TDに取り付けられたコール酸の量は、1 H NMRスペクトルにおけるコール酸の3個のメチル基のものとPEGのプロトンのシグナルの比を比較することによって検出することができます。 TDの分子量は、MALDI-TOF質量分析およびゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）により確認することができます。定量的なエルマン試験は、分子当たりに存在する遊離のシステイン残基の数を解読するために使用することができます。
PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8は、水性媒体中でミセルを形成するために自己集合することができます。標準的な溶媒蒸発法、などPTXおよびビンクリスチンなどの疎水性薬物のさまざまな方法を使って、正常にミセル13,22内にカプセル化されています。 OxygENは、以前PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8の遊離チオール基を酸化して、イントラミセルジスルフィド架橋結合を形成するために利用されました。エルマン試験によって監視されるように、ジスルフィド結合する遊離チオール基の転化率は、酸化の48時間後に85％に達しました。 AH 2 O 2媒介性酸化は、最近、別の方法として使用しました。変換率は、以前のアプローチよりも96倍高速だった30分（ 図2）、88％に達しました。 PTX装填の五十グラム、ジスルフィド架橋されたナノ粒子は、正常にこのより効率的なアプローチ（ 図3）を使用して製造されています。粒子サイズは、狭いサイズ分布（ 図3）と、約27 nmでした。薬剤負荷効率は4.0 mg / mlでのPTXロードで100％に近づきました。ジスルフィド架橋は、CMC値に劇的な効果を持っていました。欠けている標準TD PEG 5K -CA 8と比較ジスルフィド結合は、架橋されたTDが観察CMC値（0.67μMに対して5.53μM）13の10倍の減少を示しました。
安定性試験
我々はさらに厳しいミセル撹乱条件に対するPTX-ロード、ジスルフィド架橋されたミセルの安定性を調べました。ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、それが効率的に高分子ミセルを打破することができますように、日常的にミセルの安定性を評価するために使用される強力なイオン性界面活性剤です。薬物負荷、ジスルフィド架橋されたミセル（1.0 mg / mlで）の安定性は、ミセル破壊SDS（2.5 mg / mlで）の存在下で、DLSによってモニターしました。ミセルの粒子サイズは、（ 図4、左パネル）、このような架橋されたミセルは無傷のままであることを示す、経時的に安定したままでした。還元条件はTHER、疎水性コア内のジスルフィド結合を切断することが期待されますイービ不安定化の影響を受けやすいミセルを作ります。グルタチオン（GSH）、還元剤、内因性は、多くの場合、このような研究のために使用されます。細胞外レベル（2ミクロン対10ミリメートル）と比較して、GSHの細胞内レベルでは全く対照的です。濃度のこの差は、多くの場合、刺激応答システムを生成するために使用されます。細胞内濃度（10 mm）の23にGSHを添加した後、薬物を装填し、ジスルフィド架橋されたミセルのサイズは、30分間無傷のままでした。彼らは突然、ジスルフィド結合、ミセル（ 図4、右パネル）の急速な解離の前提条件の重要な数の減少を意味する、1 nmまで減少しました。逆に、システムは、GSH（データは示していない）の細胞外濃度の存在下で安定なままでした。
溶血研究
フィギュア5は、ジスルフィド架橋の有無にかかわらず、PTX-ロードミセルの観察された溶血活性の違いを示しています。血流中にこれらの粒子を投与する場合、それは彼らの治療上の利点を損なうよう血球の溶血は、避けなければなりません。ヘマト互換性は、脂質を可溶化するか、原形質膜の破裂につながる、リン脂質膜に自身を挿入する可能性を有する両親媒性のTDとしてポリマー系薬物担体のin vivoでの適用のために非常に重要です。 図5に示すように、PTX-NCMSはPTX-NCMSの濃度が0.2ミリグラムから増加として溶血の割合は14.2％と8.1％の増加に伴って用量依存性赤血球（RBC）溶解数を有することが見出されました/ 1.0ミリグラム/ mlの。しかし、PTX-のDCMジスルフィド架橋を持って同じ実験条件下でのRBCで観察可能な溶血活動（<1.0％）を示しませんでした。 hemolysの差この傾向は、両親媒性のTDを形成するために解離からPTX-DCMを防ぐ疎水性コアに存在するイントラミセルジスルフィド架橋に起因することができますされています。
図1： 架橋されたミセルを形成する工程。自己集合した後、チオール化telodendrimer PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8の酸化により形成されるジスルフィド架橋されたミセルの模式図。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： 架橋されたミセルを形成するための酸化方法。トンの変換率彼は2つの酸化方法のための酸化時間の関数として、ジスルフィド結合するためのTD上のチオール基。ミセルの総濃度は、20 mg / mlで維持しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： 薬物負荷、架橋ミセル。左パネル：PTX-ロード、ジスルフィド架橋されたミセルのバッチの絵。スケールバー：1インチ。右パネル：粒径、動的光散乱（DLS）によって決定されます。ミセルの総濃度は、20 mg / mlで維持しました。 PTXの負荷は4 mg / mlでした。粒径データは、3つの測定値に基づいて、SD±平均粒径として示されました。 SD：標準偏差は、測定された粒度分布の幅を記述する。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： 安定性研究。 DLSによって測定されるようになし（左）または（右）GSH（10 mM）の2.5 mg / mlとSDSの存在下でのPTX-ロード、ジスルフィド架橋されたミセルの粒子サイズ。粒径データは、3つの測定値に基づいて、SD±平均粒径として示されました。 SD：標準偏差は、測定された粒度分布の幅を記述する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5： 溶血アッセイ。赤血球（RBC）の非架橋型ミセルと比較しPTX装填、ジスルフィド架橋されたミセルのインビトロの溶血活性。トリトン-100（2％）およびPBSを、それぞれ、陽性対照および陰性対照として使用しました。報告された値は、3つのサンプルの平均±SDです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
いくつかのナノ粒子は、薬物送達におけるそれらの潜在的使用のために検討されています。リポソームドキソルビシンおよびパクリタキセル（PTX）は、ヒト血清アルブミンナノ凝集物は、癌治療のためにFDAによって承認さnanotherapeutics間にある-loaded。臨床的に有効なものの、これらnanotherapeuticsの両方のサイズが比較的「大」であり、それらは肝臓および肺に蓄積する傾向があります。比較的小さい粒子サイズおよびより高い薬物負荷能力を持つ高分子ミセルは、薬物送達のためのナノキャリアを浮上しています。独自のコア - シェル構造は、「物理的なカプセル化によって水性条件下で「疎水性薬物分子を「可溶化」。高分子ミセルは、薬物を封入で長い貯蔵寿命、高効率で私たちの研究室の形単分散ナノ粒子（10-50 nmの粒子サイズ）で製造した、明確に定義されたのTDで構成される。堅牢なTDプラットフォームの多くの利点の一つは、ポリマーの多様性です。多数の薬物、蛍光色素、および標的リガンドを容易TDプラットフォーム13,15,24に組み込むことができます。
プロトコル内の重要なステップ
我々は、27ナノメートルの周りの粒子サイズを有する、明確に定義されているPTXの送達のための強固な、可逆的ジスルフィド架橋ミセルシステムを開発し、そして狭いサイズ分布を有しています。 TDは、段階的な液相ペプチド化学により合成しました。これらのTDの明確に定義された化学構造は、所望の特性を有するナノ粒子を生成するための重要な要因です。したがって、TLCとカイザーのテストとの反応の完了を確認することは非常に重要です。 H 2 O 2酸化は、TD上のチオール基が大幅ミセルの安定性を向上させるジスルフィド架橋を形成するために酸化され、また、重要なステップです。我々の以前の酸素系酸化法に比べて、H 2 O 2 -ベース酸化法は、このようにより短い時間で架橋されたミセルを提供し、96倍高速です。さらに、GSH、チオール含有トリペプチドは、細胞によって産生される重要な抗酸化剤であり、フリーラジカルおよび反応性酸素化合物の捕捉に重要な役割を果たしています。これは、細胞の酸化還元ホメオスタシスを維持することにより、主要な貢献をして。 GSHの細胞内濃度は、薬物設計の興味深い側面です。 GSHの細胞内濃度は、今しっかりと細胞外濃度（それぞれ2μM、対10 mM）の25よりも実質的に高いことが確立されています。さらに重要なことは、上昇した細胞内GSHレベルは、多くの場合、多くの薬剤耐性ヒトおよびマウス腫瘍細胞26に報告されています。 GSHの高い細胞内分布は、薬物ペイロードの放出および蓄積中でミセルと結果のジスルフィド架橋の破壊を促進します。ジスルフィド架橋されたナノ粒子でありますSDSの存在下で安定。しかし、GSHの豊富な細胞内環境は、それによって、システムを不安定に、ジスルフィド結合を破壊することにより、薬物の放出を誘発します。ポリマー誘発性溶血は赤血球などの血液成分と高分子ミセルの有害な相互作用に起因します。架橋されたミセルは、非架橋類似体と比較してはるかに少ない溶血を示しました。
修正およびトラブルシューティング
以前に報告され、酸素に基づく方法13と比較した場合、酸化剤としてH 2 O 2を利用して、より効率的なジスルフィド架橋形成を可能にします。 H 2 O 2は水に安価で高溶解性であり、いくつかの他の既知の酸化剤（ 例えば、クロムやマンガン）と比較して、高品質の製品を与える強力な酸化剤27です。しかし、酸化時間がfurtheする必要があるかもしれません合成の規模に基づいてrを最適化。
テクニックの制限事項
H 2 O 2は、強力な酸化剤です。 H 2 O 2の低濃度は、ジスルフィド架橋の形成を行うために使用されていても、ケアは、望ましくない薬物の劣化を防止するために、「酸化に敏感な」薬物を装填のTDで使用する際に注意しなければなりません。
既存の/代替方法に関して技術の意義
記載された技術は、容易に標準的な実験室で複製することができる簡単な実験です。例えば、標準的な蒸着法を用いて、薬物負荷は、透析法と比較して、より少ない時間がかかります。酸化剤としてH 2 O 2を使用してコア内のジスルフィド形成が速くoxyg用いて以前に報告酸化法より96倍13アン。薬物ローディング工程の再現性は、容易に粒径（DLS法）および薬物含量（HPLC）を測定することによって評価することができます。
このテクニックをマスターした後、将来のアプリケーションや行き方
小分子薬と比較して、ナノ医療の前に克服する必要がある主要な障害の一つが主流がん治療の設定を入力することができ、製造28のスケールアップの技術的課題です。この新しく開発された技術を習得した後、人は簡単に大規模にジスルフィド架橋されたミセルを合成することができます。これは、ヒト患者におけるこのナノ製剤の臨床試験のために非常に望ましいです。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MeO-PEG5K-NH2 | Rapp Polymere | 125000-2 | |
| Fmoc-Lys(Fmoc)-OH | Aaptec | AFK107 | |
| Fmoc-Lys(Boc)-OH | Anaspec | AS-20132 | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | Aapptec | AAC105 | |
| Dimethylformamide | Fisher Scientific | BP1160-4 | |
| Ethyl ether | Fisher Scientific | E134-20 | |
| N,N-Diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | T6508 | Corrosive, handle with care |
| 4-methyl piperidine | Alfa-Aesar | L-02709 | |
| Ebes linker | Anaspec | AS-61924 | |
| Cholic acid | Sigma Aldrich | C1129 | |
| 1,2-Ethanedithiol | Sigma Aldrich | 02390 | Handle inside fume hood. Bleach gloves after usage. |
| Triisopropylsilane | Sigma Aldrich | 233781 | |
| Chloroform (anhydrous) | Sigma Aldrich | 288306 | |
| Hydrogen peroxide solution 30% | Aaron Industries | NA | |
| HoBt-Cl | Aaptec | CXZ096 | |
| DIC | Sigma Aldrich | D125407 | |
| Female athymic nude mice (Nu/Nu strain), 6–8 weeks age | Harlan (Livermore, CA) |
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