Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En Facile och effektiv strategi för produktion av Vändbar disulfid Tvärbundna Miceller

Published: December 23, 2016 doi: 10.3791/54722
Automatic Translation
1,2, 1, 3
1Department of Biochemistry & Molecular Medicine, University of California, Davis, 2UC Davis Comprehensive Cancer Center, University of California, Davis, 3Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of California, Davis

Abstract

Nanomedicin är en växande form av terapi som utnyttjar de unika egenskaperna hos partiklar som är nanometer i skala för biomedicinsk tillämpning. Förbättrad läkemedelstillförsel för att maximera terapeutiska resultat och för att minska drogrelaterade biverkningar är några av hörnstenarna i dagens nanomedicin. Nanopartiklar i synnerhet har hittat en bred användning vid cancerbehandling. Nanopartiklar som ger en hög grad av flexibilitet i utformning, tillämpning och produktion baserad på tumören mikro beräknas vara mer effektiva med en snabb översättning till klinisk praxis. Det polymera micell nanobärare är ett populärt val för läkemedelsleveranstillämpningar.

I den här artikeln beskriver vi en enkel och effektiv protokoll för syntes av läkemedelsladdade, disulfid tvärbundna miceller baserade på självorganisering av en väldefinierad amfifila linjär dendritiska sampolymer (telodendrimer, TD). TD består av polyeten glycol (PEG) som den hydrofila segment och ett tiolerad cholsyra kluster som kärnan bildande hydrofob del fäst stegvis till en amin-terminerad PEG med användning av lösningsbaserad peptidkemi. Cytostatika, såsom paklitaxel (PTX), kan laddas med en vanlig lösningsmedelsindunstning metod. O 2-medierad oxidation tidigare användes för att bilda inom micellära disulfid tvärbindningar från fria tiolgrupper på TD. Emellertid var reaktionen långsam och inte är möjligt för storskalig produktion. Nyligen har en H2O 2 förmedlad oxidation metod undersökas som en mer genomförbar och effektiv strategi, och det var 96 gånger snabbare än den tidigare rapporterade metoden. Med hjälp av denna metod, 50 g PTX-laddade, disulfid tvärbundna nanopartiklar har framgångsrikt producerat med snäv partikelstorleksfördelning och hög läkemedelsladdning effektivitet. Stabiliteten hos den erhållna micellösningen analyseras med störande betingelser såsom saminkubering wed en detergent, natriumdodecylsulfat, med eller utan ett reduktionsmedel. De läkemedelsladdade, disulfid tvärbundna miceller visade mindre hemolytisk aktivitet jämfört med deras icke-tvärbundna motsvarigheter.

Introduction

Nanoteknologi är ett snabbt växande område som har gynnat ett antal biomedicinska områden 1. Nanopartiklar ger möjligheter för att utforma och tuning egenskaper som inte är möjliga med andra typer av konventionella läkemedel. Nano bärare öka stabiliteten av läkemedel mot biologisk nedbrytning, förlänga läkemedelscirkulationstiden, lösa problem läkemedlets löslighet, och kan finjusteras för målinriktad läkemedelstillförsel och för samverkande leverera avbildningsmedel 1,2. Nanopartikelbaserade leveranssystem håller löfte i canceravbildning och behandling. Tumör vasculatures är läckande till makromolekyler och kan leda till förmånliga ansamling av cirkulerande nanopartiklar vid tumörplatser via den förbättrade permeabilitet och retention (EPR) effekt 3. Bland flera nano bärare (t.ex. liposomer, hydrogeler, och polymera miceller) som håller på att aktivt som bärare för anticancerläkemedel, har polymera miceller vunnit bred popularitet under the senaste decenniet 4,5.

Polymera miceller är ett termodynamiskt system som, på intravenös administrering, potentiellt kan spädas under den kritiska micellkoncentrationen (CMC), vilket leder till deras dissociation till unimers. Tvärbindning strategier har använts för att minimera micellär dissociation till unimers. Emellertid kan överdrivet stabiliserade miceller förhindrar läkemedlet från att släppa vid målställena, vilket minskar den totala terapeutiska effekten. Flera kemiska tillvägagångssätt har utforskats för att göra tvärbindnings nedbrytbara som svar på redox- eller på yttre stimuli, såsom reducerbara disulfidbindningar 6,7 och pH-klyvbar 8 eller hydrolyserbar esterbindningar 9,10.

Vi har tidigare rapporterat konstruktion och syntes av micellära nanopartiklar som består av dendritiskt cholsyra (CA) block och linjära polyetylenglykol (PEG) sampolymerer, benämnd telodendrimers (TD) 11-15 nK -CAy (där n = molekylvikt i kilodalton (K), y = antal cholsyra (CA) enheter). De kännetecknas av sin ringa storlek, lång hållbarhet och hög effektivitet i inkapslande läkemedel såsom paklitaxel (PTX) och doxorubicin (DOX) i den hydrofoba kärnan. Byggstenarna i TD, såsom PEG, lysin, och CA, är biokompatibla, och närvaron av en PEG corona kan förläna en "stealth" nanopartikel karaktär, vilket förhindrar icke-specifik upptagning av micellära nanopartiklar av de retikuloendoteliala systemen.

Tiolerade linjära-dendritiska polymerer kan lätt genereras genom att införa cysteiner i den dendritiska oligo-lysin ryggraden i vår standard TDs. I denna artikel presenteras en enkel protokoll för framställning av ett reversibelt tvärbunden micellär läkemedelstillförselsystem genom att införa disulfid tvärbindningar i den hydrofoba kärnan av TDs (Figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik uttalande: Kvinna atymiska nakna möss (Nu / Nu-stam), 6-8 veckor gamla, köptes och hölls sedan under patogenfria betingelser enligt AAALAC riktlinjer och tilläts acklimatisera i minst 4 dagar före eventuella försök. Alla djurförsök utfördes i enlighet med institutionella riktlinjer och enligt protokoll nr 07-13119 och nr 09-15584, som godkändes av Animal Användning och skötsel administrativa rådgivande kommittén vid University of California, Davis.

1. Syntes av TD PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8

  1. I en rundbottnad kolv, lös upp MeO-PEG 5K -NH 2 (2 g, 0,4 mmol) i 10 till 20 ml vattenfri dimetylformamid (DMF) och kyla på is.
  2. I en glasbägare, upplösa 3 ekvivalenter. av 1-hydroxi-6-klor-bensotriazol (HOBt), 3 ekv. av N, N '-diisopropylcarbodiimide (DIC), och 3 ekv. av (Fmoc) 2 Lys-OH i vattenfri DMF (10-15 ml). Rör om under 15 till 20 min på en magnetisk omrörningsplatta.
  3. Tillsätt blandningen till reaktionskolven innehållande den MeO-PEG 5K -NH 2. Avlägsna isbadet och rör om reaktionsblandningen över natten vid rumstemperatur.
  4. Bekräfta fullbordandet av reaktionen med tunnskiktskromatografi (TLC) 16 och Kaiser test 17 (en gul färg indikerar frånvaron av fri NH2). Utfällning av den polymera produkten en (MeO-PEG 5K-Lys (NH-Fmoc 2)) genom att tillsätta ungefär 200 ml is-kall eter till reaktionskolven. Separera den utfällda polymeren via centrifugering (6 min vid 6000 xg och 4 ° C).
    1. För att utföra TLC, upptäcka prov på kiselgel-belagda TLC-plattor. Använda diklormetan / metanol (9: 1) som den mobila fasen. Observera fläckar under en UV-lampa efter att utveckla TLC-plattor. Man kan också använda ninhydrin färgning reagens för att visualisera amin fläckar på en värmeplatta.
    2. för Kaiser test, placera en liten bit av provet i glasrör innehållande Kaiser reagens. Värm vid 100 ° C under 5 minuter och leta efter färgförändringen (om färgen på lösningen förblir gul, då reaktionen är fullständig).
  5. Re-upplösning av produkten i vattenfri DMF (10-20 ml) och upprepa utfällning och centrifugering (se steg 1.4).
  6. Upprepa steg 1,5, och sedan tvätta polymer fällningen tre gånger med iskall eter.
  7. Överför polymer fällningen en till en ren reaktionskolv och anslut kolven till en hög vakuumkälla för att avlägsna kvarvarande eter.
  8. Förbereda och lägga till cirka 20 till 30 ml av 20% (vol / vol) 4-metylpiperidin i DMF till polymer intermediär 1. Rör om till fullständig upplösning. Genomföra reaktionen under 3 timmar.
  9. Utföra TLC 16 och Kaisers test (en blå färg bekräftar närvaro av fritt NH2) 17 (se steg 1,4) för att bekräfta den completion av reaktionen. Om reaktionen är fullbordad, gå vidare till eter nederbörd, som nämns för produkten 1 (steg 1,4-1,6).
  10. Torka den polymera produkten 2 (MeO-PEG 5K-Lys (NH2) 2) under ett vakuum.
  11. Utför ytterligare en sats med (Fmoc) 2 Lys-OH-koppling på intermediär 2 (steg 1,1-1,7) för att generera produkten 3 (MeO-PEG 5K-Lys (Lys (NH-Fmoc) 2) 2). De-skydda (steg från 1,8 till 1,10) de Fmoc-grupper (4, MeO-PEG 5K-Lys (Lys (NH2) 2) 2) och paret (steg 1,1-1,7) den (Fmoc) Lys (Boc) -OH till generera en tredje generationens dendritiska polylysin (5, MeO-PEG 5k-Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys (Boc)) 4) avslutas med fyra Boc och Fmoc-grupperna på den ena änden av PEG-kedjan.
  12. Överföra den resulterande polymeren intermediär 5 till en reaktionskolv. in somn separat reaktionskolv, förbereda ett: 1 (volym / volym) trifluorättiksyra (TFA) i diklormetan (DCM). Lägga 15-20 ml av en 1: 1 TFA / DCM (v / v) blandning till polymeren mellanprodukten 5. Rör om blandningen tills polymeren är fullständigt upplöst. Rör om under ytterligare 3 h.
  13. Utföra TLC 16 och Kaisers test (en blå färg bekräftar närvaro av fritt NH2) 17 (se steg 1,4) för att bekräfta slutförandet av reaktionen. Om reaktionen är fullständig, indunsta polymer-i-TFA / DCM blandning med luft till dess att en viskös lösning erhålles. Fortsätt till eter nederbörd, som nämns för produkten 1 (steg 1,4-1,6). Torka den polymera produkten 6 (MeO-PEG 5k-Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys (NH2)) 4) under ett vakuum.
  14. Överföring polymer intermediär 6 i en reaktionskolv. Använda ca 40 ml vattenfri DMF innehållande 8 ekv. av N, N -diisopropylethylamine (DIEA) för att lösa polymeren mellan 6. I en glasbägare, lös 12 ekvivalenter. HOBt, 12 ekv. DIC, och 12 ekvivalenter. av (Fmoc) Cys (Trt) -OH i 20 till 25 ml vattenfri DMF. Skaka om 10-15 minuter, och sedan lägga till reaktionsblandningen till reaktionskolven innehållande sex. Genomföra reaktionen över natten.
  15. Bekräfta fullbordandet av reaktionen med TLC 16 och Kaisers test (se steg 1,4, en gul färg indikerar frånvaron av fri NH 2) 17. Om reaktionen är fullbordad, gå vidare till eter nederbörd, som nämns för produkten 1 (steg 1,4-1,6), för att isolera produkten 7 (MeO-PEG 5K-Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys - ((Fmoc) Cys (Trt))) 4.
  16. Utför Fmoc de-skydd på 7, som beskrivs i steg 1,8 för att erhålla produkt 8 (PEG 5K Lys-Lys 2 - (Lys (NH 2) - (Cys (NH 2) (Trt))) 4). Par (Fmoc) -PEG 2 -Suc-OH ( "Ebes" länk, 24 ekv.) På en polymer mellanliggande vid användning av den procedur som beskrivs ovan för HOBt / DIC-medierad koppling för att erhålla mellan 9 (MeO-PEG 5K-Lys-Lys 2 Lys 4 - (Cys (Trt) ) 4 (Ebes (NH-Fmoc)) 8).
  17. Utför ytterligare en runda av Fmoc de-skydd (steg från 1,6 till 1,8) för att få intermediär 10 (MeO-PEG 5K-Lys-Lys 2 Lys 4 - (Cys (Trt)) 4 (Ebes (NH 2)) 8).
  18. Överföra polymeren mellanprodukten 10 i en reaktionskolv och tillsätt vattenfritt DMF (ca 30 till 40 ml) för att lösa upp den. I en annan reaktionskolv, upplösa 24 ekvivalenter. av CAOSu (framställd enligt tidigare publicerat förfarande) i vattenfri DMF (20-30 ml) 18. Lägg 48 ekv. av N, N-diisopropyletylamin och låt det rör om under 10-15 min. Överför innehållet i reaktionskolven innehållande 10 och låt reaktionen kördes overnight.
  19. Bekräfta fullbordandet av reaktionen med TLC 16 och Kaisers test (se steg 1,4, en gul färg indikerar frånvaron av fri NH 2) 17. Om reaktionen är fullbordad, gå vidare till eter nederbörd, som nämns för produkten 1 (steg 1,4-1,6) för att isolera produkten 11 (MeO-PEG 5K-Lys-Lys 2 Lys 4 - (Cys (Trt)) 4 -Ebes 8 -CA 8). Dialysera den i avjoniserat vatten och lyofilisera provet för att ge ett vitt pulver.
  20. Placera polymeren intermediär 11 i en reaktionskolv. Förbereda och tillsätt 20 ml TFA / 1,2-etanditiol (EDT) / trietylsilan (TIS) / H2O (94 / 2,5 / 1 / 2,5, vol / vol) blandning i polymerlösningen. Rör blandningen till fullständig upplösning. Genomföra reaktionen under 4 timmar. Bekräfta fullbordandet av reaktionen genom TLC 16.
  21. Enligt dragskåp, blåsa in luft i polymer TFA / EDT / TIS / H 2O blandningen tills lösningen blir trögflytande. Fortsätt till eter utfällning, som nämnts för produkten 1 (stegen 1,4-1,6), för att isolera den slutliga produkten, 12 (PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8). Lös den i acetonitril och lyofilisera den för att ge ett vitt pulver.

2. Framställning av PTX-laddade Miceller

  1. Förbered en PTX belastad PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 micell med standard avdunstning metoden.
    1. Lös 20 mg TD med en annan mängd PTX (1-9 mg) i 1 ml kloroform (CHCI3). Avlägsna lösningsmedlet under användning av en rotationsindunstare för erhållande av en homogen, torr polymerfilm. Rekonstituera filmen med 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom virvling, följt av sonikering under 30 min vid 40 kHz, om nödvändigt, för att tillåta bildandet av läkemedelsladdade miceller.
    2. Tillsätt 6 | il av 3% (vikt / vikt) H2O 2 (1 ekv. För att free tiolgrupperna) att oxidera tiolgrupperna på TD. Använda micell-lösning för ytterligare karakterisering när nivån på fria tiolgrupper förblir vid konstanta låga värden, såsom indikeras av Ellmans-test 19.
    3. Filtrera lösningen med en 0,22-pm filter för att sterilisera provet. Analysera mängden läkemedel som fyllts på i miceller på en HPLC 20 systemet efter att de frigjort läkemedel från micellema genom tillsats av 9 gånger acetonitril och utförande av 10 min av sonikering. Använda en C18-kolonn för HPLC med acetonitril / vatten som rörlig fas.
    4. Beräkna läkemedelsladdning enligt kalibreringskurvan mellan värdena HPLC området och koncentrationer av läkemedlet standard 11.
      OBS: Den laddningseffektivitet definieras som förhållandet mellan läkemedel laddas in i miceller till den initiala läkemedelsinnehåll.

3. Karakteriseringar av miceller

  1. Mäta storleken och storleksfördelningen av micelles med dynamisk ljusspridning (DLS) instrument 29. Utföra mätningarna vid rumstemperatur och hålla micellkoncentrationen vid 1 mg / ml.
    OBS: För att utföra partikelstorleksanalys, använda PBS som tomt, och sedan spela partikelstorleken för faktiska prover. Ta avläsningar i tre exemplar för prover, och sedan genomsnitt avläsningarna.
  2. Använda fluorescensspektra för att mäta den kritiska micellära koncentrationen (CMC) av PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 före och efter tvärbindning med pyren som en hydrofob fluorescerande sond, såsom beskrivits tidigare 13,21.
    OBS: Normalt varierar micellkoncentrationen från 5 x 10 -7 till 5 x 10 -4 M.

4. Stabilitet hos miceller i SDS med eller utan reduktionsmedel

  1. Framställa stamlösningar av natriumdodecylsulfat (SDS) -lösning (7,5 mg / ml) och disulfid-tvärbundna miceller (1,5 mg / ml) i PBS. Därefter usjunga stamlösningarna, gör en lösningsblandning, i vilken den slutliga SDS-koncentrationen är vid 2,5 mg / ml och den micellkoncentrationen är vid 1,0 mg / ml.
  2. Mäta storleken och storleksfördelningen (som nämns i steg 3,1) av micellen lösningar vid förutbestämda tidsintervall med eller utan närvaro av 10 mM glutation (GSH).

5. Hemolys Assay

  1. Utvärdera den hemolytiska potentialen hos PTX belastad, icke-tvärbundna miceller (PTX-NCMS) framställd enligt tidigare publicerat förfarande 11 och PTX-laddade tvärbundna miceller (PTX-DCMS) med användning av färskt citratbehandlat blod från nakna möss som samlats in från svans slöja.
    1. Samla in de röda blodkropparna efter centrifugering av blodprovet (1,0 ml) vid 1000 xg under 10 min, tvätta dem tre gånger med PBS, och sedan återsuspendera cellpelletar med PBS till en slutkoncentration av 2%.
  2. Blanda 200 pl erytrocytsuspension med olika koncentrationer (0,2 och 1,0mg / ml) av PTX-NCM och PTX-DCMs, respektive, och inkubera under 4 h vid 37 ° C i en inkubator-skakapparat.
  3. Centrifugera micell-erytrocyt-blandningar vid 3000 xg under 5 min. Överför 100 | il av supernatanten från samtliga prov till en platta med 96 brunnar. Mät absorbansen hos fritt hemoglobin i supernatanten vid 540 nm med användning av en mikroplattläsare.
    OBS: RBCs inkuberade med Triton-100 (2%) och PBS som skall användas som de positiva och negativa kontroller, respektive. Den procentuella hemolysen av röda blodkroppar är beräknad med följande formel: RBC hemolys = (OD prov - OD negativ kontroll) / (OD positiv kontroll - OD negativ kontroll) x 100%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Beredning och karakterisering av läkemedelsladdade, disulfid Tvärbundna Miceller

Amfifila polymer PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 är en dendritisk polymer som kan bilda en disulfid tvärbunden micellära systemet för cancer drug delivery. Strukturellt är det definieras som en dendritisk oligomer av cholsyror (hydrofob domän) är kopplade till en ände av den linjära PEG-molekyl (hydrofil domän, molekylvikt 5K) via en grenad poly (lysin-cystein-Ebes) ryggraden. Det finns flera fördelar med att använda dessa segmentsampolymerer över andra rapporterade micellära system. För det första kan det lätt syntetiseras via stegvis lösningsfas-kondensationsreaktioner. För det andra, jämfört med flera andra rapporterade amfifila polymerer, den tiolerade polymersystem, som framställts genom väletablerade lösningsfasen stegvis Fmoc peptidkemi, har en väl definierad structure. Det kan lagras i lyofiliserad pulverform och har en mycket lång hållbarhetstid.

Flera tekniker kan användas för att karaktärisera den slutliga produkten. Mängden cholsyra fäst till TD kan detekteras genom att jämföra signalförhållandet av protoner på PEG till de på de tre metylgrupperna i cholsyra i ett H-NMR-spektra. Molekylvikterna för TD kan bekräftas genom MALDI-TOF masspektrometri och gelpermeationskromatografi (GPC). Den kvantitativa Ellmans-test kan användas för att dechiffrera det antal fria cysteinrester är närvarande per molekyl.

PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 kan själv montera för att bilda miceller i vattenhaltiga medier. Med en vanlig lösningsmedelsindunstning metod, en mängd av hydrofoba läkemedel, såsom PTX och vinkristin, har framgångsrikt inkapslat i micellerna 13,22. Oxygen tidigare användes för att oxidera fria tiolgrupper av PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 och bilda intra-micellära disulfid tvärbindningar. Som övervakas av Ellman test, omräkningskursen från fria tiolgrupper till disulfidbindningar nådde 85% efter 48 timmar av oxidation. AH 2 O 2 förmedlad oxidation nyligen användes som en alternativ metod. Konverteringskursen nådde 88% i 30 minuter (Figur 2), som var 96 gånger snabbare än den tidigare strategin. Femtio gram PTX belastad, disulfid tvärbundna nanopartiklar har framgångsrikt producerat med hjälp av denna mer effektiv strategi (Figur 3). Partikelstorleken var cirka 27 nm, med en smal storleksfördelning (Figur 3). Läkemedelsladdningen verkningsgrad närmade 100% med PTX belastning av 4,0 mg / ml. Disulfid tvärbindning hade en dramatisk effekt på CMC värdet. Jämfört med standard TD PEG 5K -CA 8 som saknardisulfidbindningar, den tvärbundna TD visade en 10-faldig minskning i de observerade CMC-värden (5,53 iM kontra 0,67 M) 13.

stabilitets~~POS=TRUNC

Vi undersökte vidare stabiliteten hos PTX-laddade, disulfid tvärbundna miceller mot allvarliga micell störande förhållanden. Natriumdodecylsulfat (SDS) är en stark jonisk detergent som rutinmässigt används för att bedöma micellär stabilitet, eftersom den effektivt kan bryta ner polymera miceller. Stabiliteten hos läkemedelsladdade, disulfid tvärbundna miceller (1,0 mg / ml) övervakades genom DLS i närvaro av micellen störande SDS (2,5 mg / ml). Partikelstorleken hos micellerna förblev stabil över tiden, vilket tyder på att sådana tvärbundna miceller förblev intakt (Figur 4, vänstra panelerna). Reduktiva betingelser förväntas klyva disulfidbindningar i den hydrofoba kärnan, therEby att miceller mottagliga för destabilisering. Glutation (GSH), ett endogent reduktionsmedel, är ofta används för sådana studier. Det finns stark kontrast i den intracellulära nivån av GSH jämfört med den extracellulära nivån (10 mm kontra 2 | j, m). Denna skillnad i koncentrationer används ofta för att generera stimuli-responsiva system. Efter tillsats av GSH vid en intracellulär koncentration (10 mm) 23, storleken på de läkemedelsladdade, disulfid tvärbundna miceller förblev intakt under 30 min. De minskade plötsligt till en nm, vilket innebär en minskning av ett kritiskt antal disulfidbindningar, en förutsättning för den snabba dissociation av micellerna (Figur 4, högra panelen). Tvärtom förblev systemet stabilt i närvaro av extracellulära koncentrationer av GSH (data ej visade).

hemolys Studie

Figur5 visar skillnader i det observerade hemolytiska aktiviteten av PTX-laddade miceller, med eller utan disulfid tvärbindning. Hemolys av blodceller skall undvikas vid administrering av dessa partiklar in i blodströmmen, eftersom det undergräver deras terapeutiska fördelar. Hemato-kompatibilitet är mycket avgörande för tillämpningen av polymerbaserade läkemedelsbärare, såsom de amfifila TD som har potential att solubilisera lipider eller för att infoga sig själva i fosfolipidmembran, vilket leder till brott på plasmamembran in vivo. Som visas i figur 5, var PTX-NCM visat sig ha en dosberoende röda blodkroppar (RBC) lys räkna med andelen hemolys ökar från 8,1% till 14,2% när koncentrationen av PTX-NCM ökade från 0,2 mg / ml till 1,0 mg / ml. Men PTX-DCMs som har disulfid tvärbindning visade inga observerbara hemolytiska aktiviteter (<1,0%) i RBC under samma experimentella betingelser. Denna skillnad i de hemolysär trenden kan hänföras till de intra-micellär disulfidbryggor närvarande vid hydrofoba kärnan, som förhindrar PTX-DCMs från dissociation för att bilda amfifil TDs.

Figur 1
Figur 1: Steg för att bilda tvärbundna miceller. Schematisk representation av disulfid-tvärbundna miceller bildade genom oxidation av den tiolerade telodendrimer PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 efter självmontering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Oxidation metoder för tvärbunden micellbildning. Konverteringskursen than tiolgrupper på TDS att disulfidbindningarna som en funktion av oxidationstiden för de två oxidationsmetoder. Den totala koncentrationen av micellerna hölls vid 20 mg / ml. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: läkemedelsladdade, tvärbunden micell. Vänstra panelen: en bild av ett parti av PTX-laddade, disulfid tvärbundna miceller. Skala bar: en tum. Höger panel: partikelstorleken, bestämd genom dynamisk ljusspridning (DLS). Den totala koncentrationen av miceller hölls vid 20 mg / ml. Laddningen av PTX var 4 mg / ml. partikelstorleksdata visades som den genomsnittliga partikelstorleken ± SD baserat på tre mätningar. SD: standardavvikelse, beskriver bredden på den uppmätta partikelstorleksfördelning.Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: Stabilitets studien. Partikelstorleken för PTX-laddade, disulfid tvärbundna miceller i närvaro av 2,5 mg / ml SDS utan (vänster) eller med (höger) GSH (10 mM), mätt genom DLS. partikelstorleksdata visades som den genomsnittliga partikelstorleken ± SD baserat på tre mätningar. SD: standardavvikelse, beskriver bredden på den uppmätta partikelstorleksfördelning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5: Hemolys analys. De in vitro hemolytiska aktiviteter PTX-laddade, disulfid tvärbundna miceller i jämförelse med icke-tvärbundna miceller på röda blodkroppar (RBC). användes triton-100 (2%) och PBS som de positiva och negativa kontroller, respektive. De rapporterade värdena är medelvärden ± SD av trippelprover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flera nanopartiklar har undersökts för deras potentiella användning i läkemedelstillförsel. Liposomalt doxorubicin och paklitaxel (PTX) -loaded humana serumalbuminnano aggregat är bland de nanotherapeutics godkänts av FDA för behandling av cancer. Även om kliniskt effektiva, båda dessa nanotherapeutics är relativt "stora" i storlek, och de tenderar att ackumuleras i levern och lungorna. Polymera miceller med relativt mindre partikelstorlekar och högre kapacitet läkemedelshalten växer fram nanocarriers för läkemedelsavgivning. Deras unika kärna-skalstruktur '' lösa '' de hydrofoba läkemedelsmolekyler i vattenlösning med fysisk inkapsling. Polymera miceller sammansatta av väldefinierade TDs upprättats i vårt labb bildar monodispergerade nanopartiklar (10-50 nm partikelstorlek) med en lång hållbarhetstid och hög effektivitet i inkapsling droger. En av de många fördelarna med den robusta TD plattformen är mångsidigheten hos polymeren.Talrika läkemedel, fluorescerande färgämnen, och målsökande ligander kan lätt införlivas i TD plattformen 13,15,24.

Kritiska steg i protokollet

Vi har utvecklat en robust, reversibel, disulfid tvärbunden micell system för PTX leverans, som är väl definierade, med en partikelstorlek omkring 27 nm, och har en snäv storleksfördelning. TDS syntetiserades via stegvis lösningsfas peptidkemi. Den väl definierade kemiska strukturen hos dessa TDs är den viktigaste faktorn för att generera nanopartiklar med de önskade egenskaperna. Därför, vilket bekräftar slutförandet av reaktionen med TLC och Kaisers test är mycket kritisk. H 2 O 2 oxidization är också ett kritiskt steg, tiolgrupperna på TD är oxiderade till att bilda disulfid-tvärbindningar, vilket i hög grad öka stabiliteten i micellerna. Jämfört med vår tidigare syrebaserad oxide metoden, H2O 2 -baserat oxide metoden är 96 gånger snabbare, vilket ger tvärbundna miceller i kortare tidsperioder. Vidare GSH, en tiol-innehållande tripeptid, är en viktig antioxidant produceras av cellerna, och den spelar en viktig roll för sophantering fria radikaler och reaktiva syreföreningar. Det gör stora insatser genom att hålla den cellulära redox homeostas. Den cellulära koncentrationen av GSH är en intressant aspekt av läkemedelsutformning. Den intracellulära koncentrationen av GSH nu etablerat att vara betydligt högre än den extracellulära koncentration (10 mM jämfört med 2 ^ M respektive) 25. Ännu viktigare, har en förhöjd intracellulär GSH nivå ofta rapporterats hos många läkemedelsresistenta mänskliga och murina tumörceller 26. Den höga intracellulära fördelningen av GSH underlättar brott på disulfid tvärbindning av micellerna och resulterar i frisättning och ackumulering av läkemedlet nyttolast. De disulfid tvärbundna nanopartiklar ärstabilt i närvaro av SDS. Men utlöser en GSH-rik intracellulära miljön frisättningen av läkemedlet genom att bryta ner de disulfidbindningar, vari destabilisera systemet. Polymer-inducerad hemolys resulte från den skadliga interaktionen av polymera miceller med blodbeståndsdelar, såsom röda blodkroppar. Tvärbundna miceller visade mycket mindre hemolys jämfört med icke-tvärbundna analoger.

Ändringar och felsökning

Utnyttjar H2O 2 som oxidationsmedel möjliggör en mer effektiv disulfid tvärbinda bildning i jämförelse med den tidigare rapporterade, syre-baserad metod 13. H2O 2 är ett starkt oxidationsmedel 27 som är billigt och lättlösligt i vatten och ger produkter av hög kvalitet jämfört med vissa andra kända oxiderande medel (t.ex., kromat eller permanganat). Emellertid kan oxidering tid måste further optimeras på skalan av syntesen.

Begränsningar av tekniken

H2O 2 är ett starkt oxidationsmedel. Trots en låg koncentration av H2O 2 används för att utföra disulfid tvärbinda bildning, har att vara försiktig när man använder med TD laddade med "oxidationskänsliga" läkemedel för att förhindra oönskad läkemedelsnedbrytning.

Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga / alternativa metoder

Den teknik som beskrivs är en enkel experimentell uppställning som enkelt kan replikeras i en standard laboratorium. Till exempel, är mindre tidskrävande jämfört med dialysmetoden läkemedelsladdning med användning av en standard-förfarandet med indunstning. Den disulfidbildning i kärnan med användning av H2O 2 som oxidationsmedel är 96 gånger snabbare än den tidigare rapporterade oxidation metod med användning oxygsv 13. Reproducerbarheten av läkemedels-laddningssteg kan lätt bedömas genom mätning av partikelstorleken (DLS-metod) och läkemedelsinnehåll (HPLC).

Framtida tillämpningar eller riktningar efter Mastering denna teknik

Jämfört med småmolekylära läkemedel, ett av de största hindren som måste övervinnas innan nanomedicin kan ange vanliga inställningar cancervården de tekniska utmaningarna om att trappa upp produktionen 28. Efter maste denna nyligen utvecklad teknik, kan en lätt syntetisera disulfid tvärbundna miceller i stor skala. Detta är ytterst önskvärt för kliniska studier av denna nanoformulering i humana patienter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MeO-PEG5K-NH2 Rapp Polymere 125000-2
Fmoc-Lys(Fmoc)-OH Aaptec AFK107
Fmoc-Lys(Boc)-OH Anaspec AS-20132
Fmoc-Cys(Trt)-OH Aapptec AAC105
Dimethylformamide Fisher Scientific BP1160-4
Ethyl ether Fisher Scientific E134-20
N,N-Diisopropylethylamine Sigma Aldrich D125806
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich T6508 Corrosive, handle with care
4-methyl piperidine Alfa-Aesar L-02709
Ebes linker Anaspec AS-61924
Cholic acid Sigma Aldrich C1129
1,2-Ethanedithiol Sigma Aldrich 02390 Handle inside fume hood. Bleach gloves after usage.
Triisopropylsilane Sigma Aldrich 233781
Chloroform (anhydrous) Sigma Aldrich 288306
Hydrogen peroxide solution 30% Aaron Industries NA
HoBt-Cl Aaptec CXZ096
DIC Sigma Aldrich D125407
Female athymic nude mice (Nu/Nu strain), 6–8 weeks age Harlan (Livermore, CA)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, L., et al. Nanoparticles in medicine: therapeutic applications and developments. Clin. Pharmacol. Ther. 83, 761-769 (2008).
  2. Wang, A. Z., Langer, R., Farokhzad, O. C. Nanoparticle Delivery of Cancer Drugs. Annu. Rev. Med. 63, 185-198 (2012).
  3. Iyer, A. K., Khaled, G., Fang, J., Maeda, H. Exploiting the enhanced permeability and retention effect for tumor targeting. Drug Disc. Today Targets. 11, 812-818 (2006).
  4. Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles. Pharmacol. Rev. 64, 505-519 (2012).
  5. Kamaly, N., Xiao, Z., Valencia, P. M., Radovic-Moreno, A. F., Farokhzad, O. C. Targeted polymeric therapeutic nanoparticles: design, development and clinical translation. Chem. Soc. Rev. 41, 2971-3010 (2012).
  6. Li, Y. L., et al. Reversibly stabilized multifunctional dextran nanoparticles efficiently deliver doxorubicin into the nuclei of cancer cells. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 9914-9918 (2009).
  7. Miyata, K., et al. Block catiomer polyplexes with regulated densities of charge and disulfide cross-linking directed to enhance gene expression. J. Am. Chem. Soc. 126, 2355-2361 (2004).
  8. Chan, Y., Wong, T., Byrne, F., Kavallaris, M., Bulmus, V. Acid-labile core cross-linked micelles for pH-triggered release of antitumor drugs. Biomacromolecules. 9, 1826-1836 (2008).
  9. Rijcken, C. J., Snel, C. J., Schiffelers, R. M., van Nostrum, C. F., Hennink, W. E. Hydrolysable core-crosslinked thermosensitive polymeric micelles: synthesis, characterisation and in vivo studies. Biomaterials. 28, 5581-5593 (2007).
  10. Talelli, M., et al. Core-crosslinked polymeric micelles with controlled release of covalently entrapped doxorubicin. Biomaterials. 31, 7797-7804 (2010).
  11. Xiao, K., et al. A self-assembling nanoparticle for paclitaxel delivery in ovarian cancer. Biomaterials. 30, 6006-6016 (2009).
  12. Li, Y., et al. A novel size-tunable nanocarrier system for targeted anticancer drug delivery. J. Control. Release. 144, 314-323 (2010).
  13. Li, Y., et al. Well-defined, reversible disulfide cross-linked micelles for on-demand paclitaxel delivery. Biomaterials. 32, 6633-6645 (2011).
  14. Li, Y., et al. Well-defined, reversible boronate crosslinked nanocarriers for targeted drug delivery in response to acidic pH values and cis-diols. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51, 2864-2869 (2012).
  15. Li, Y., et al. A smart and versatile theranostic nanomedicine platform based on nanoporphyrin. Nat. Commun. 5, (2014).
  16. Belenki, B. G., Gankina, E. S. Thin-Layer chromatography of polymers. J. Chromatogr. A. 141, 13-90 (1977).
  17. Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).
  18. Pandey, P. S., Rai, R., Singh, R. B. Synthesis of cholic acid-based molecular receptors: head-to-head cholaphanes. J. Chem. Soc., Perkin Trans 1. , 918-923 (2002).
  19. Riddles, P. W., Blakeley, R. L., Zerner, B. Reassessment of Ellman's reagent. Methods Enzymol. 91, 49-60 (1983).
  20. Ahuja, S., Rasmussen, H. Overview of HPLC method development for pharmaceuticals. HPLC Method Development for Pharmaceuticals. , Separation Science and Technology; 8. Elsevier Academic Press Inc. 1-11 (2007).
  21. Li, Y., Pan, S., Zhang, W., Du, Z. Novel thermo-sensitive core-shell nanoparticles for targeted paclitaxel delivery. Nanotechnology. 20 (6), 065104 (2009).
  22. Kato, J., et al. Disulfide cross-linked micelles for the targeted delivery of vincristine to B-cell lymphoma. Mol. Pharm. 9, 1727-1735 (2012).
  23. Lu, S. C. Regulation of glutathione synthesis. Mol. Aspects Med. 30, 42-59 (2009).
  24. Xiao, K., et al. "OA02" peptide facilitates the precise targeting of paclitaxel-loaded micellar nanoparticles to ovarian cancer in vivo. Cancer Res. 72, 2100-2110 (2012).
  25. Koo, A. N., et al. Disulfide-cross-linked PEG-poly(amino acid)s copolymer micelles for glutathione-mediated intracellular drug delivery. Chem. Commun. 28, 6570-6572 (2008).
  26. McLellan, L. I., Wolf, C. R. Glutathione and glutathione-dependent enzymes in cancer drug resistance. Drug. Resist. Update. 2, 153-164 (1999).
  27. Karala, A. R., Lappi, A. K., Saaranen, M. J., Ruddock, L. W. Efficient peroxide-mediated oxidative refolding of a protein at physiological pH and implications for oxidative folding in the endoplasmic reticulum. Antioxid. Redox Signal. 11, 963-970 (2009).
  28. Gabizon, A., et al. Cancer nanomedicines: closing the translational gap. Lancet. 384, 2175-2176 (2014).
  29. Nanotrac Nanotechnology Particle Size Measurement Solutions. , Available from: http://www.vahitech.com/Assets/Nano(US)Web.pdf (2006).

Tags

Biokemi nanopartikel drug delivery miceller telodendrimer disulfid tvärbindning väteperoxid-medierad oxidation
En Facile och effektiv strategi för produktion av Vändbar disulfid Tvärbundna Miceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Y., Bharadwaj, G., Lee, J. S. A… More

Li, Y., Bharadwaj, G., Lee, J. S. A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles. J. Vis. Exp. (118), e54722, doi:10.3791/54722 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter