Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

גישה קלילה ויעילה לייצור ההפיך דיסולפיד צולב Micelles

Published: December 23, 2016 doi: 10.3791/54722
Automatic Translation
1,2, 1, 3
1Department of Biochemistry & Molecular Medicine, University of California, Davis, 2UC Davis Comprehensive Cancer Center, University of California, Davis, 3Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of California, Davis

Abstract

ננו-רפואה היא צורה מתעוררת של טיפול שמנצל את המאפיינים הייחודיים של חלקיקים שהם ננומטר בקנה מידה עבור יישומים ביו. שיפור אספקת סמים על מנת למקסם את התוצאות טיפולית כדי להפחית תופעות לוואי הקשורות לתרופה כמה מאבני היסוד של ננו-רפואה של ימינו. חלקיקים בפרט מצאו יישום רחב בטיפול בסרטן. חלקיקים המציעים רמה גבוהה של גמישות בעיצוב, יישום, וייצור מבוסס על המיקרו-סביבה של הגידול מוקרנים כיעיל יותר עם תרגום מהיר לתוך הפרקטיקה הקלינית. The-המוביל ננו micellar פולימריים היא בחירה פופולרית עבור יישומי משלוח סמים.

במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול פשוט ויעיל סינתזה טעונה-סמים, מיצלות צולבות דיסולפיד מבוססות על ההרכבה העצמית של קופולימר ליניארי-הדנדריטים amphiphilic מוגדר היטב (telodendrimer, TD). TD מורכב פוליאתילן GLycol (PEG) כפלח הידרופילי אשכול חומצת thiolated cholic כמו בשלבים מצורפים מחצית הידרופובי יוצרי ליבה ל PEG אמין הסתיים באמצעות כימיה פפטיד מבוסס פתרון. תרופות כימותרפיות, כגון פקליטקסל (PTX), ניתן לטעון בשיטת אידוי ממס סטנדרטית. O 2 החמצון בתיווך נוצל בעבר כדי ליצור תוך micellar דיסולפיד צולבים קישורים מקבוצות תיאול חינם על TDS. עם זאת, התגובה היתה איטית ולא ריאלי עבור ייצור בקנה מידה גדול. לאחרונה, שיטת חמצון H 2 O 2 בתיווך שנחקרה כגישה יותר ריאלית ויעילה, וזה היה 96 פעמים מהר יותר מאשר השיטה שדווחה בעבר. בגישה זו, 50 גרם של טעון PTX, חלקיקים צולבים דיסולפיד הופק בהצלחה עם התפלגות גודל חלקיקים צרה ויעילות טעינת תרופה גבוהה. יציבות פתרון micelle וכתוצאה מנותחת באמצעות תנאים לשבש כגון שיתוף דגירה wה- i סולפט dodecyl חומרי ניקוי, נתרן, עם או בלי סוכן צמצום. שטעונים-הסמים, מיצלות הצולבות דיסולפיד הפגינו פחות פעילות המוליטית בהשוואה לעמיתיהם הלא הצולבים שלהם.

Introduction

ננוטכנולוגיה הוא תחום מהיר המתעורר כי הרוויח במספר התחומים ביו 1. חלקיקים לספק הזדמנויות לעיצוב כוונון תכונות כי הם לא ריאליים עם סוגים אחרים של תרופות קונבנציונליות. ננו-נישא לשפר את היציבות של תרופות נגד לפירוק, להאריך את זמן מחזור סמים, להתגבר על בעיות מסיסות תרופה, והוא יכול להיות מכויל עבור שיגור תרופות ועבור 1,2 סוכני הדמית אספקת שיתוף. מערכות אספקה ​​מבוססת ננו-חלקיקי הבטחה בתחום הדמיה וטיפול בסרטן. Vasculatures הסרטני הם דולפים אל מקרומולקולות יכול לגרום להצטברות מועדפת של מחזורי חלקיקים באתרי גידול באמצעות החדירות המשופרות ושימור (EPR) אפקט 3. בין ננו-נישא כמה (למשל, ליפוזומים, הידרוג, ו מיצלות פולימריות) כי הם נמשכים במרץ כנישאים לתרופות אנטי-סרטניות, מיצלות פולימריים צברו פופולריות רחבה מעל הדואר האחרון בעשור 4,5.

מיצלות פולימריים הן מערכת תרמודינמית כי, על עירוי לוריד, עלול להיות מדוללת מתחת ריכוז micelle הביקורתי (CMC), מה שמוביל דיסוציאציה שלהם לתוך unimers. אסטרטגיות Cross-linking כבר מועסק על מנת למזער דיסוציאציה micellar לתוך unimers. עם זאת, מיצלות התייצבה מדי עלולה למנוע התרופה מלשחרר באתרי היעד, ובכך להפחית את היעילות הטיפולית הכוללת. כמה גישות כימיות נחקרו על מנת להפוך את cross-linking מתכלה בתגובת חיזור או לגירויים חיצוניים, כגון אג"ח דיסולפיד לצמצום 6,7 ו- pH-cleavable 8 או אסתר hydrolysable אג"ח 9,10.

דיווחנו בעבר בעיצוב סינתזה של חלקיקים micellar המורכב חומצה כולית הדנדריטים (CA) בלוקים פוליאתילן גליקול ליניארי (PEG) קופולימרים, המכונה telodendrimers (TD) 11-15 נ"ק -CAy (כאשר n = משקל מולקולרי ב kilodaltons (K), Y = מספר חומצה כולית (CA) יחידות). הם מאופיינים בגודל הקטן שלהם, חיי מדף ארוכים, ויעילות גבוהה בסמי encapsulating כגון פקליטקסל (PTX) ודוקסורוביצין (DOX) בליבה הידרופובי. אבני הבניין של TD, כגון PEG, ליזין, ו- CA, הם ביולוגית, ואת הנוכחות של קורונה PEG יכול להקנות אופי הננו-חלקיק "התגנבות", מניעת ספיגת הלא ספציפית של חלקיקים micellar ידי מערכות reticuloendothelial.

ליניארי-הדנדריטים Thiolated פולימרים יכול להיווצר בקלות על ידי החדרת cysteines לתוך עמוד השדרה אוליגו-ליזין הדנדריטים של ניכוי מס במקור הרגילה שלנו. מאמר זה מציג פרוטוקול קליל לייצור מערכת אספקת סמים micellar צולבים הפיך על ידי החדרת צולבות קישורים דיסולפיד לתוך ליבת הידרופובי של TDS (איור 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הצהרת אתיקה: עכברים בעירום athymic נקבה (נו / נו מתח), בן 6-8 שבועות, נרכשה ולאחר מכן המשיכה בתנאים הפתוגן ללא פי הנחיות AAALAC והורשתה להתאקלם לפחות 4 ימים לפני כל ניסויים. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות מוסדיים ולפי מס 'פרוטוקול 07-13119 ומס' 09-15584, שאושר על ידי שימוש בבעלי חיים וטיפול הוועדה המייעצת מינהלי באוניברסיטת קליפורניה בדייוויס.

1. סינתזה של TD PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8

  1. בבקבוק מסביב לתחתית, לפזר מיאו-PEG 5K -NH 2 (2 גרם, 0.4 מילימול) 10-20 מ"ל של dimethylformamide נטול מים (DMF) ומקררים על קרח.
  2. בתוך כוס זכוכית, לפזר equiv 3. של 1-הידרוקסי-6-כלורו-benzotriazole (HOBt), 3 equiv. של N, -diisopropylcarbodiimide 'N (DIC), ואת equiv 3. של (Fmoc) 2 ליס-OH ב נטול מים DMF (10-15 מ"ל). מערבב במשך 15-20 דקות על צלחת ומערבבים מגנטית.
  3. מוסיפים את תערובת אל הבקבוק המכיל את התגובה מיאו-PEG 5K -NH 2. הסר את באמבט קרח ומערבבים לתערובת התגובה הלילה בטמפרטורת החדר.
  4. אשר את השלמת התגובה עם כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) 16 ובדיקה של קייזר 17 (בצבע צהוב מציין את העדר חינם NH 2). לזרז את המוצר 1 פולימריים (מיאו-PEG 5K -Lys (NH-Fmoc) 2) על ידי הוספת כ -200 מ"ל של האתר קר כקרח אל הבקבוק התגובה. הפרד את הפולימר זירז באמצעות צנטריפוגה (6 דקות ב 6000 XG ו -4 מעלות צלזיוס).
    1. כדי לבצע TLC, לזהות דגימות על צלחות TLC מצופה ג'ל סיליקה. השתמש dichloromethane / מתנול (9: 1) כשלב הנייד. שים לב כתמים תחת מנורת UV לאחר שפתח את צלחות TLC. אפשר גם להשתמש ninhydrin מגיב מכתים לדמיין כתמים אמינים על פלטה חשמלית.
    2. עבור קאיהבדיקה של ser, להציב קצת המדגם בצינור זכוכית המכיל מגיב קייזר. מחמם את זה ב 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולחפש את שינוי הצבע (אם הצבע של הפתרון נשאר צהוב, אז התגובה הושלמה).
  5. Re-לפזר את המוצר נטול מים DMF (10-20 מ"ל) וחזור על המשקעים צנטריפוגה (ראה שלב 1.4).
  6. חזור על שלב 1.5, ולאחר מכן לשטוף את משקע הפולימר שלוש פעמים עם אתר קר כקרח.
  7. מעביר את משקע פולימר 1 בבקבוק תגובה נקי ולחבר את הבקבוק למקור ואקום גבוה כדי להסיר את האתר שיורית.
  8. הכן ולהוסיף כ 20-30 מ"ל של 20% (v / v) 4-methylpiperidine ב DMF פולימרי 1 ביניים. מערבבים עד המסה מלאה. הפעל את התגובה 3 שעות.
  9. בצע 16 TLC ולבדוק של קייזר (צבע כחול מאשר את נוכחותו של חינם NH 2) 17 (ראה שלב 1.4) כדי לאשר את completion של התגובה. אם התגובה היא מלאה, המשך ממטרי האתר, כאמור עבור מוצר 1 (שלבי 1.4-1.6).
  10. יבש את המוצר 2 פולימריים (מיאו-PEG 5K -Lys (NH 2) 2) תחת ואקום.
  11. לבצע עוד סיבוב אחד של (Fmoc) 2 ליס-OH-צימוד על 2 ביניים (שלבים 1.1-1.7) כדי לייצר מוצר 3 (-Lys 5K מיאו-PEG (ליס (NH-Fmoc) 2) 2). דה-להגן (שלבים 1.8-1.10) הקבוצות Fmoc (4, מיאו-PEG 5K -Lys (ליס (NH 2) 2) 2) ו- זוג (שלבים 1.1-1.7) את (Fmoc) ליס (בוק) -OH כדי ליצור polylysine הדנדריטים הדור השלישי (5, מיאו-PEG 5k -Lys-ליס 2 - ((Fmoc) ליס (בוק)) 4) הסתיים עם ארבע קבוצות בוק ו Fmoc על קצה אחד של שרשרת PEG.
  12. מעביר את הפולימר שהתקבל ביניים 5 בבקבוק תגובה. בשנת כפיבקבוק התגובה eparate, להכין 1: 1 (V / V) חומצה trifluoroacetic (TFA) ב dichloromethane (DCM). להוסיף 15-20 מ"ל של 1: תערובת 1 TFA / DCM (V / V) כדי הפולימר ביניים 5. מערבבים את התערובת עד הפולימר נמס לגמרי. מערבב במשך שעה 3 נוספת.
  13. בצע TLC 16 והבדיקה של קייזר (צבע כחול מאשר את נוכחותו של חינם NH 2) 17 (ראה שלב 1.4) כדי לאשר את השלמת התגובה. אם התגובה היא מלאה, להתאדות פולימר-ב-TFA / DCM התערובת עם אוויר עד פתרון צמיג מתקבל. המשך אל ממטרי האתר, כאמור עבור מוצר 1 (שלבי 1.4-1.6). יבש את המוצר 6 פולימריים (מיאו-PEG 5k -Lys-ליס 2 - ((Fmoc) ליס (NH 2)) 4) תחת ואקום.
  14. העברת פולימר ביניים 6 לתוך בקבוק תגובה. השתמש כ 40 מ"ל של DMF נטול מים המכיל equiv 8. של N, N -diisopropylethylamine (DIEA) לפזר את פולימר ביניים 6. בתוך כוס זכוכית, לפזר 12 equiv. של HOBt, 12 equiv. של דסק"ש, ו -12 equiv. של (Fmoc) Cys (TRT) -OH ב 20-25 מ"ל של נטול מים DMF. Shake למשך 10-15 דקות, ולאחר מכן להוסיף את תערובת תגובת בקבוק התגובה המכיל 6. הפעל את תגובת הלילה.
  15. אשר את השלמת תגובה עם TLC 16 והבדיקה של קייזר (ראה שלב 1.4; בצבע צהוב מציין את העדר 2 חינם NH) 17. אם התגובה היא מלאה, המשך ממטרים האתר, כאמור עבור מוצר 1 (שלב 1.4-1.6), לבודד 7 מוצר (מיאו-PEG 5K -Lys-ליס 2 - ((Fmoc) ליס - ((Fmoc) Cys (TRT))) 4.
  16. בצע Fmoc דה-הגנה על 7, כפי שמתואר בשלב 1.8, כדי להשיג מוצר 8 (PEG 5K -Lys-ליס 2 - (ליס (NH 2) - (Cys (NH 2) (TRT))) 4). זוג (Fmoc) -PEG 2 -Suc-OH ( "Ebes" מקשר, 24 equiv.) על פולימר ביניים באמצעות ההליך המתואר לעיל HOBt / דסק"ש בתיווך צימוד להשיג 9 ביניים (מיאו-PEG 5K -Lys-ליס 2 -Lys 4 - (Cys (TRT) 4) (Ebes (NH-Fmoc)) 8).
  17. בצעו עוד סיבוב אחד של הגנה דה Fmoc (שלבים 1.6-1.8) כדי לקבל 10 ביניים (מיאו-PEG 5K -Lys-ליס 2 -Lys 4 - (Cys (TRT)) 4 (Ebes (NH 2)) 8).
  18. מעבירים את פולימר ביניים 10 לתוך בקבוק התגובה ולהוסיף DMF נטול מים (כ 30-40 מ"ל) כדי לפזר אותו. בעוד בקבוק תגובה, לפזר 24 equiv. של CAOSu (שהוכן על פי הנוהל שפורסם קודם לכן) נטול מים DMF (20-30 מ"ל) 18. להוסיף 48 equiv. של N, N -diisopropylethylamine ולתת לו ומערבבים במשך 10-15 דקות. מעביר את התכולה לתוך בקבוק התגובה המכיל 10 ולתת o תגובת הריצהvernight.
  19. אשר את השלמת התגובה עם TLC 16 ובדיקה של קייזר (ראה שלב 1.4; בצבע צהוב מציין את העדר 2 חינם NH) 17. אם התגובה היא מלאה, המשך ממטרים האתר, כאמור עבור מוצר 1 (שלבים 1.4-1.6) לבודד מוצר 11 (מיאו-PEG 5K -Lys-ליס 2 -Lys 4 - (Cys (TRT)) 4 -Ebes 8 -CA 8). Dialyze אותו במים דה-מיוננים Lyophilize המדגם להניב אבקה לבנה.
  20. מניח את פולימר ביניים 11 לתוך בקבוק תגובה. הכן ולהוסיף 20 מ"ל של תערובת TFA / 1,2-ethanedithiol (EDT) / triethylsilane (TIS) / H 2 O (94 / 2.5 / 1 / 2.5, V / V) לתוך התמיסה פולימר. מערבבים את התערובת עד המסה מלאה. הפעל את התגובה ל -4 שעות. אשר את השלמת התגובה ידי TLC 16.
  21. מתחת למכסה המנוע קטר, לפוצץ באוויר לתוך הפולימר-TFA / EDT / TIS / H 2תערובת O עד הפתרון הופכת צמיגה. המשך אל ממטרים האתר, כאמור עבור מוצר 1 (שלבים 1.4-1.6), כדי לבודד את המוצר הסופי, 12 (PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8). לפזר אותו אצטוניטריל ו Lyophilize זה להניב אבקה לבנה.

2. הכנת טעון PTX Micelles

  1. כן micelle PTX הטעון PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 בשיטת האידוי הסטנדרטית.
    1. ממיסים 20 מ"ג של TD עם כמות שונה של PTX (1-9 מ"ג) ב 1 מ"ל של כלורופורם (CHCl 3). הסר את הממס באמצעות מאייד רוטרי להשיג משטח פולימר הומוגנית, יבש. מחדש את הסרט עם 1 מ"ל של תמיסת מלח פוספט שנאגרו (PBS) על ידי מערבולת, ואחריו sonication למשך 30 דקות ב 40 קילוהרץ, במידת הצורך, כדי לאפשר את היווצרות מיצלות טעון בסמים.
    2. הוסף 6 μl של 3% (w / w) H 2 O 2 (1 equiv. כדי frEE הקבוצות תיאול) לחמצן הקבוצות תיאול על TD. השתמש פתרון micelle לאפיון נוסף לאחר הרמה של קבוצות תיאול פנויות נותרת בערכים נמוכים מתמיד, כפי שצוינה על ידי הבדיקה של אלמן 19.
    3. סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22-מיקרומטר לעקר המדגם. לנתח את כמות התרופה שטעון מיצלות על מערכת 20 HPLC לאחר שחרור תרופות מן מיצלות ידי הוספת אצטוניטריל 9 פעמים וביצוע 10 דקות של sonication. השתמש בעמודת C18 עבור HPLC עם אצטוניטריל / מים כשלב הנייד.
    4. חשב את טעינת סמים על פי עקומת הכיול בין הערכים באזור HPLC ועל ריכוזי התרופה 11 הסטנדרטית.
      הערה: יעילות ההעמסה מוגדרת כיחס בין תרופה והטעונה מיצלות לתוכן התרופה הראשוני.

3. אפיונים של Micelles

  1. מדוד את התפלגות גודל וגודל של מ 'icelles עם פיזור אור דינאמי (DLS) מכשיר 29. לבצע את המדידות בטמפרטורת החדר ולשמור על ריכוז micelle הוא 1 מ"ג / מ"ל.
    הערה: כדי לבצע ניתוח גודל חלקיקים, השתמש PBS כמו ריק, ולאחר מכן לרשום את גודל החלקיקים עבור דגימות בפועל. קח את הקריאות בשלושה עותקים עבור דגימות, ולאחר מכן מחשב את הממוצע של הקריאות.
  2. השתמש ספקטרום הקרינה כדי למדוד את ריכוז micellar קריטי (CMC) של PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 לפני ואחרי cross-linking עם פירן כמו בדיקה ניאון הידרופובי, כפי שתואר לעיל 13,21.
    הערה: בדרך כלל, ריכוז micelle נע בין 5 × 10 -7 עד 5 × 10 -4 מ '

4. יציבות של Micelles ב SDS עם או בלי סוכני צמצום

  1. הכינו מלאי של פתרונות סולפט dodecyl נתרן פתרון (SDS) (7.5 מ"ג / מ"ל) ו דיסולפיד מיצלות צולבים (1.5 מ"ג / מ"ל) ב PBS. לאחר מכן, uלשיר את פתרונות המניות, לעשות תערובת פתרון שבו ריכוז SDS הסופי נמצא במרחק של 2.5 מ"ג / מ"ל ​​ו ריכוז micelle הוא ברמה של 1.0 מ"ג / מ"ל.
  2. מדוד את התפלגות גודל וגודל (כאמור בשלב 3.1) של הפתרונות micelle במרווחי זמן קבועים מראש עם או ללא נוכחות של גלוטתיון 10 מ"מ (GSH).

Assay המוליזה 5.

  1. להעריך את הפוטנציאל המוליטית של מיצלות PTX טעון, הלא צולבים (PTX-NCMs) המוכן על פי נוהל שפורסם בעבר 11 ו מיצלות הצולבות הטעונות PTX (PTX-DCMS) באמצעות citrated דם טרי מעכברים בעירום הנגבים צעיף זנב.
    1. אסוף כדוריות דם אדומות על ידי צנטריפוגה של דגימת דם (1.0 מ"ל) XG ב 1000 למשך 10 דקות, לשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS, ולאחר מכן מחדש להשעות את כדורי תא עם PBS לריכוז סופי של 2%.
  2. מערבבים 200 μl של השעיה כדורית עם ריכוזים שונים (0.2 ו -1.0מ"ג / מ"ל) של PTX-NCMs ו PTX-DCMS, בהתאמה, ו דגירה של 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס שייקר אינקובטור.
  3. צנטריפוגה התערובות הכדוריות micelle ב 3000 XG במשך 5 דקות. העברת 100 μl של supernatant מכל הדגימות לצלחת 96-היטב. מדוד את ספיגת של המוגלובין חופשי supernatant ב 540 ננומטר באמצעות קורא מיקרו צלחת.
    הערה: RBCs מודגרות עם טריטון-100 (2%) והטלוויזיה הציבורית הם כדי לשמש בקרות חיוביות ושליליות, בהתאמה. המוליזה אחוז RBCs מחושב עם הנוסחה הבאה: RBC המוליזה = (מדגם OD - OD שליטה שלילי) / (OD חיובית מלאה - OD שליטה שלילי) × 100%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הכנה ואפיון של טיעון בסמים, דיסולפיד צולב Micelles

Amphiphilic פולימר PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 הוא פולימר הדנדריטים מסוגל להרכיב דיסולפיד צולב מערכת micellar למסירת תרופה לסרטן. מבחינה מבנית, הוא מוגדר בתור oligomer הדנדריטים של חומצה כולית (תחום הידרופובי) צמוד קצה אחד של מולקולת PEG ליניארי (תחום הידרופילי, משקל מולקולרי 5K) באמצעות פולי קנים (ליזין-ציסטאין-Ebes) עמוד שדרה. ישנם מספר יתרונות של שימוש קופולימרים לחסום אלה פני מערכות micellar דיווחו אחרות. ראשית, הוא יכול להיות מסונתז בקלות דרך תגובות עיבוי שלב פתרון בשלבים. שנית, לעומת מספר פולימרי amphiphilic דיווח אחרים, מערכת פולימר thiolated, שהוכנו באמצעות פתרון שלב ומבוסס כימיה של חלבונים בשלבי Fmoc, יש structu מוגדר היטבמִחָדָשׁ. זה יכול להיות מאוחסן בצורת אבקת lyophilized ויש לו חיי מדף מורחבים.

יכולות להיות מנוצלות מספר טכניקות כדי לאפיין את המוצר הסופי. כמות חומצה כולית המצורפת TD יכול להיות מזוהים על ידי השוואת יחס אות של פרוטונים על PEG לאלה על שלוש קבוצות מתיל של חומצה כולית של ספקטרום NMR H 1. המשקלים המולקולריים של TD יכול להיות מאושרת על ידי כרומטוגרפיה חלחול ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF ו ג'ל (GPC). המבחן של כמותי האלמן ניתן להשתמש כדי לפענח את מספר שאריות ציסטאין חינם נוכחיות לכל מולקולה.

PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 יכול עצמי להרכיב כדי ליצור מיצלות בהמדים מימיים. בשיטת אידוי ממס רגילה, מגוון של תרופות הידרופובי, כגון PTX ו- vincristine, כבר כמוס בהצלחת מיצלות 13,22. Oxygen נוצל בעבר לחמצן הקבוצות תיאול ללא 5K PEG -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 וליצור-קשרים צלב דיסולפיד התוך micellar. כמו פיקוח על ידי בדיקה של אלמן, יחס ההמרה מקבוצות תיאול חופשי דיסולפיד אג"ח הגיעו 85% לאחר 48 שעות של חמצון. AH 2 O 2 חמצון בתיווך הועסק לאחרונה כשיטה חלופית. שיעור ההמרה הגיע 88% ב 30 דקות (איור 2), אשר היו 96 פעמים מהר יותר מאשר הגישה הקודמת. חמישים גרם טיעון PTX, דיסולפיד חלקיקים צולבים הופקו בהצלחה באמצעות גישה יעילה יותר זה (איור 3). גודל החלקיקים היה בסביבות 27 ננומטר, עם התפלגות גודל צרה (איור 3). היעילות טעינת סמים התקרב 100% עם טעינת PTX של 4.0 מ"ג / מ"ל. דיסולפיד cross-linking היתה השפעה דרמטית על הערך CMC. לעומת TD PEG תקן 5K -CA 8 החסריםאג"ח דיסולפיד, קל TD הצולב נרשם ירידה של פי 10 בערכי CMC ציינו (5.53 מיקרומטר לעומת 0.67 מיקרומטר) 13.

מחקרי יציבות

בנוסף, אנו חקרנו את יציבות PTX טעונה, מיצלות צולבות דיסולפיד נגד תנאים-שיבוש micelle חמורים. נתרן גופרתי dodecyl (SDS) הוא חומר ניקוי יוני חזק המשמש באופן שיגרתי להערכת יציבות micellar, כפי שהוא יכול לשבור מיצלות פולימריים ביעילות. יציבות טעון סמים, מיצלות צולבים דיסולפיד (1.0 מ"ג / מ"ל) היה פיקוח על ידי DLS בנוכחות של שיבוש-micelle SDS (2.5 מ"ג / מ"ל). גודל החלקיקים של מיצלות נותר יציב לאורך זמן, המציין כי מיצלות צולבים כאלה נותרו על כנן (איור 4, לוחות שמאל). תנאי רדוקטיבי צפויים לדבוק אג"ח דיסולפיד בליבה הידרופובי, יסEby ביצוע מיצלות רגיש יציבות. גלוטתיון (GSH), גידול אנדוגני צמצום סוכן, מועסק לעתים קרובות ללימודים כאלה. יש בניגוד מוחלט ברמת תאיים של GSH לעומת רמת תאיים (10 מ"מ לעומת 2 מיקרומטר). הבדל זה בריכוזים משמש לעתים קרובות כדי ליצור מערכות גירויי תגובה. לאחר התוספת של GSH לעבר ריכוז תאי (10 מ"מימ) 23, את הגודל טעון-סמים, מיצלות הצולבות דיסולפיד נותר על כנן למשך 30 דקות. הם ירדו במפתיע 1 ננומטר, אשר מציין את הפחתת מספר קריטי של אג"ח דיסולפיד, תנאי מוקדם של דיסוציאציה המהירה של מיצלות (איור 4, פאנל מימין). נהפוך הוא, המערכת נותר יציב בנוכחות ריכוזים תאיים של GSH (מידע לא מוצג).

לימוד המוליזה

דמות5 הראה הבדלים בפעילות המוליטית הנצפית של מיצלות הטעונה PTX, עם או בלי דיסולפיד cross-linking. המוליזה של כדוריות דם יש להימנע בעת ניהול חלקיקים אלה לתוך זרם הדם, כפי שהיא מערערת היתרונות הטיפוליים שלהם. המטו-התאימות היא חיונית מאוד עבור יישום in vivo של ספקים בסמים מבוססי פולימרים, כגון TDs amphiphilic כי יש פוטנציאל solubilize שומנים או להכניס את עצמם לתוך ממברנות פוספוליפידים, שמוביל פקיעת קרומי פלזמה. כפי שניתן לראות בתרשים 5, PTX-NCMs נמצאו כבעלי תא דם אדום-תלוי-מינון (RBC) לספור תמוגה, עם אחוז המוליזה הגדלת לעומת 8.1% ל -14.2% כמו ריכוז של PTX-NCMs עלה מ 0.2 מ"ג / ml ל -1.0 מ"ג / מ"ל. עם זאת, PTX-DCMS שיש דיסולפיד cross-linking לא הראו פעילות המוליטית לצפייה (<1.0%) ב RBCs באותם תנאי הניסוי. ההבדל הזה ב hemolysהוא ניתן לייחס מגמת גשרי דיסולפיד תוך micellar שנכחו הליבה הידרופובי, המונעים PTX-DCMS מ מתנער להרכיב TDs amphiphilic.

איור 1
איור 1: צעדים לגיבוש מיצלות צולבים. ייצוג סכמטי של מיצלות דיסולפיד הצולבת שהוקמה על ידי חמצון של thiolated telodendrimer PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 לאחר הרכבה עצמית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: שיטות חמצון להיווצרות micelle צולבת. שיעור ההמרה של tהוא תיאול קבוצות על TDs כדי דיסולפיד אג"ח כפונקציה של זמן חמצון עבור שתי שיטות החמצון. הריכוז הכולל של מיצלות נשמר בטמפרטורה של 20 מ"ג / מ"ל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: טיעון בסמים, micelle הצולב. פנל משמאל: תמונה מתוך סדרה של PTX טעון, מיצלות צולבות דיסולפיד. סרגל קנה מידה: 1 אינץ '. פנל ימני: גודל החלקיקים, כפי שנקבע על ידי פיזור אור דינאמי (DLS). הריכוז הכולל של מיצלות נשמר בטמפרטורה של 20 מ"ג / מ"ל. העמסת PTX היה 4 מ"ג / מ"ל. נתוני גודל החלקיקים הוצגו כמו גודל חלקיקים הממוצע ± סטיית התקן בהתבסס על שלוש מדידות. SD: סטיית התקן, מתארת ​​את רוחב התפלגות גודל חלקיקים הנמדד.אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: מחקר יציבות. גודל החלקיקים של PTX טעון, מיצלות צולבים דיסולפיד בנוכחות של 2.5 מ"ג / מ"ל ​​SDS ללא (משמאל) או עם (מימין) GSH (10 מ"מ), כפי שהיא נמדדת על ידי DLS. נתוני גודל החלקיקים הוצגו כמו גודל חלקיקים הממוצע ± סטיית התקן בהתבסס על שלוש מדידות. SD: סטיית התקן, מתארת ​​את רוחב התפלגות גודל חלקיקים הנמדד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: assay המוליזה. פעילות המוליטית חוץ גופייה של PTX טעון, מיצלות צולבות דיסולפיד בהשוואה מיצלות הלא crosslinked על תאי דם אדומים (RBCs). Triton-100 (2%) ו- PBS שימשו בקרות חיוביות ושליליות, בהתאמה. על הערכים המדווחים הם ממוצע ± סטיית התקן של דגימות בשלושה עותקים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

חלקיקים כמה נחקרו לשימוש הפוטנציאל שלהם משלוח סמים. דוקסורוביצין ו- paclitaxel liposomal (PTX) -loaded-אגרגטים ננו אלבומין בסרום האדם הם בין באלצ'ואה אושרה על ידי ה- FDA לטיפול בסרטן. עם זאת, למרות קליני יעיל, הן של באלצ'ואה אלה הן יחסית "גדולות" בגודל, והם נוטים להצטבר בכבד והריאות. מיצלות פולימרית עם גדלים של חלקיקים קטנים יחסית ויכולות העמסת תרופה גבוהות הם מתעוררים nanocarriers עבור משלוח סמים. מבנה ליבה-הפגז הייחודי שלהם '' solubilize '' מולקולות התרופה הידרופובי בתנאים מימיים ידי אנקפסולציה פיזית. מיצלות פולימרית המורכבת TDs המוגדרת היטב ערוכה חלקיקי monodispersed טופס מעבדה שלנו (גודל חלקיקים 10-50 ננומטר) עם חיים-מדף ארוכים יעיל גבוה encapsulating תרופות. אחד היתרונות הרבים של פלטפורמת TD החזקה הוא הצדדי של הפולימר.תרופות רבות, צבעי ניאון, ו ligands מיקוד ניתן לשלב בקלות לתוך פלטפורמת TD 13,15,24.

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול

פתחנו חזקה, הפיכה, מערכת micelle צולבת דיסולפיד למסירת PTX, אשר מוגדרת היטב, עם גודל חלקיקים סביב 27 ננומטר, ויש לו התפלגות גודל צרה. TDs היו מסונתז באמצעות כימית פפטיד פתרון שלב בשלבים. המבנה הכימי המוגדר היטב של TDs אלה הוא גורם המפתח ליצירת חלקיקים עם המאפיינים הרצויים. לכן, המאשר את השלמת התגובה עם הבדיקה של TLC וקייזר הוא קריטי מאוד. חמצון H 2 O 2 הוא גם שלב קריטי, הקבוצות תיאול על TD הם מתחמצנים כדי ליצור דיסולפיד חוצה קישורים, אשר מאוד לשפר את היציבות של מיצלות. לעומת שיטת החמצון מבוסס החמצן הקודם שלנו, H 2 O 2 -שיטת חמצון מבוססת היא 96 פעמים מהר יותר, ובכך לספק מיצלות צולבים בתקופות זמן קצרות יותר. יתר על כן, GSH, tripeptide המכיל תיאול, הוא אנטי-אוקסידנט חשוב המיוצר על ידי התאים, והוא משחק תפקיד חשוב הדחה רדיקלים חופשיים ותרכובות חמצן תגובתי. זה גורם תרומות גדולות ידי שמירה על הומאוסטזיס חמזור הסלולר. ריכוז הסלולר של GSH הוא היבט מעניין של תכנון תרופות. הריכוז התאי של GSH עכשיו היא מבוסס היטב כדי להיות גבוהה במידה ניכרת בהשוואת הריכוז התאי (10 המ"מימ לעומת 2 מיקרומטר, בהתאמה) 25. יתרה מכך, רמת GSH גבוהה תאית לעתים קרובות דווחה תאים סרטניים רבים עמידות לתרופות אדם בעכברים 26. חלוקת תאיים גבוהה של GSH מקל על שבירה של cross-linking דיסולפיד של מיצלות ואת גורמת לשחרור והצטברות של מטען התרופה. החלקיקים דיסולפיד הצולבים הםיציב בנוכחות SDS. עם זאת, בסביבת תאיים העשירית GSH גורמת לשחרור של התרופה על ידי פירוק אג"ח דיסולפיד, ובכך מערער את המערכת. פולימר-induced המוליזה נבעה האינטראקציה המזיקה של מיצלות פולימריות עם מרכיבי דם, כגון תאי דם אדומים. צולבים מיצלות הראה הרבה פחות המוליזה לעומת אנלוגים הלא צולבים.

שינויים ופתרון בעיות

ניצול H 2 O 2 כסוכן חמצון מאפשר במערך קשר צולב דיסולפיד יעיל יותר בהשוואה שדווח בעבר, בשיטה המבוססת על חמצן 13. H 2 O 2 הוא סוכן חמצון חזק 27, כי הוא זול מאוד מסיס במים ונותן מוצרים באיכות גבוהה בהשוואה לכמה סוכני חמצון ידוע אחרים (למשל, כרומטי או permanganate). עם זאת, זמן החמצון ייתכן שיהיה צורך further עבר אופטימיזציה המבוסס על הסולם של הסינתזה.

מגבלות של הטכניקה

H 2 O 2 הוא מחמצן חזק. למרות ריכוז נמוך של H 2 O 2 משמש לביצוע היווצרות הקשר צולב דיסולפיד, יש טיפול שיש לנקוט בעת שימוש עם TDs עמוסה "רגיש-חמצון" תרופות כדי למנוע שפלת תרופה רצויה.

משמעות של הטכניקה ביחס קיימים / שיטות חלופיות

הטכניקה המתוארת היא הגדרת ניסוי קלה כי ניתן לשכפל בקלות במעבדה סטנדרטית. לדוגמא, טעינת סמים בשיטת אידוי סטנדרטית היא פחות זמן רב בהשוואה לשיטת הדיאליזה. היווצרות דיסולפיד בליבה באמצעות H 2 O 2 כסוכן חמצון הוא 96 פעמים מהר יותר מאשר שיטת חמצון שדווח בעבר באמצעות oxygen 13. שחזור של צעד תרופת הטעינה ניתן להעריך בקלות על ידי מדידת גודל החלקיקים (שיטת DLS) ותוכן תרופה (HPLC).

יישומים עתידיים או כיווני לאחר מאסטרינג טכניקה זו

לעומת תרופות מולקולות קטנות, אחד המכשולים העיקריים שצריך להתגבר עליהם לפני-ננו-רפואה יכולה להזין הגדרות טיפול בסרטן המיינסטרים היא על האתגרים הטכניים של דרוג את הייצור 28. כאשר ישלטו בטכניקה חדשה שפותחה זה, אפשר בקלות לסנתז דיסולפיד מיצלות צולבות בקנה מידה גדול. זה מאוד רצוי מחקרים קליניים של ננו-ניסוח זה בחולים אנושיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MeO-PEG5K-NH2 Rapp Polymere 125000-2
Fmoc-Lys(Fmoc)-OH Aaptec AFK107
Fmoc-Lys(Boc)-OH Anaspec AS-20132
Fmoc-Cys(Trt)-OH Aapptec AAC105
Dimethylformamide Fisher Scientific BP1160-4
Ethyl ether Fisher Scientific E134-20
N,N-Diisopropylethylamine Sigma Aldrich D125806
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich T6508 Corrosive, handle with care
4-methyl piperidine Alfa-Aesar L-02709
Ebes linker Anaspec AS-61924
Cholic acid Sigma Aldrich C1129
1,2-Ethanedithiol Sigma Aldrich 02390 Handle inside fume hood. Bleach gloves after usage.
Triisopropylsilane Sigma Aldrich 233781
Chloroform (anhydrous) Sigma Aldrich 288306
Hydrogen peroxide solution 30% Aaron Industries NA
HoBt-Cl Aaptec CXZ096
DIC Sigma Aldrich D125407
Female athymic nude mice (Nu/Nu strain), 6–8 weeks age Harlan (Livermore, CA)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, L., et al. Nanoparticles in medicine: therapeutic applications and developments. Clin. Pharmacol. Ther. 83, 761-769 (2008).
  2. Wang, A. Z., Langer, R., Farokhzad, O. C. Nanoparticle Delivery of Cancer Drugs. Annu. Rev. Med. 63, 185-198 (2012).
  3. Iyer, A. K., Khaled, G., Fang, J., Maeda, H. Exploiting the enhanced permeability and retention effect for tumor targeting. Drug Disc. Today Targets. 11, 812-818 (2006).
  4. Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles. Pharmacol. Rev. 64, 505-519 (2012).
  5. Kamaly, N., Xiao, Z., Valencia, P. M., Radovic-Moreno, A. F., Farokhzad, O. C. Targeted polymeric therapeutic nanoparticles: design, development and clinical translation. Chem. Soc. Rev. 41, 2971-3010 (2012).
  6. Li, Y. L., et al. Reversibly stabilized multifunctional dextran nanoparticles efficiently deliver doxorubicin into the nuclei of cancer cells. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 9914-9918 (2009).
  7. Miyata, K., et al. Block catiomer polyplexes with regulated densities of charge and disulfide cross-linking directed to enhance gene expression. J. Am. Chem. Soc. 126, 2355-2361 (2004).
  8. Chan, Y., Wong, T., Byrne, F., Kavallaris, M., Bulmus, V. Acid-labile core cross-linked micelles for pH-triggered release of antitumor drugs. Biomacromolecules. 9, 1826-1836 (2008).
  9. Rijcken, C. J., Snel, C. J., Schiffelers, R. M., van Nostrum, C. F., Hennink, W. E. Hydrolysable core-crosslinked thermosensitive polymeric micelles: synthesis, characterisation and in vivo studies. Biomaterials. 28, 5581-5593 (2007).
  10. Talelli, M., et al. Core-crosslinked polymeric micelles with controlled release of covalently entrapped doxorubicin. Biomaterials. 31, 7797-7804 (2010).
  11. Xiao, K., et al. A self-assembling nanoparticle for paclitaxel delivery in ovarian cancer. Biomaterials. 30, 6006-6016 (2009).
  12. Li, Y., et al. A novel size-tunable nanocarrier system for targeted anticancer drug delivery. J. Control. Release. 144, 314-323 (2010).
  13. Li, Y., et al. Well-defined, reversible disulfide cross-linked micelles for on-demand paclitaxel delivery. Biomaterials. 32, 6633-6645 (2011).
  14. Li, Y., et al. Well-defined, reversible boronate crosslinked nanocarriers for targeted drug delivery in response to acidic pH values and cis-diols. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51, 2864-2869 (2012).
  15. Li, Y., et al. A smart and versatile theranostic nanomedicine platform based on nanoporphyrin. Nat. Commun. 5, (2014).
  16. Belenki, B. G., Gankina, E. S. Thin-Layer chromatography of polymers. J. Chromatogr. A. 141, 13-90 (1977).
  17. Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).
  18. Pandey, P. S., Rai, R., Singh, R. B. Synthesis of cholic acid-based molecular receptors: head-to-head cholaphanes. J. Chem. Soc., Perkin Trans 1. , 918-923 (2002).
  19. Riddles, P. W., Blakeley, R. L., Zerner, B. Reassessment of Ellman's reagent. Methods Enzymol. 91, 49-60 (1983).
  20. Ahuja, S., Rasmussen, H. Overview of HPLC method development for pharmaceuticals. HPLC Method Development for Pharmaceuticals. , Separation Science and Technology; 8. Elsevier Academic Press Inc. 1-11 (2007).
  21. Li, Y., Pan, S., Zhang, W., Du, Z. Novel thermo-sensitive core-shell nanoparticles for targeted paclitaxel delivery. Nanotechnology. 20 (6), 065104 (2009).
  22. Kato, J., et al. Disulfide cross-linked micelles for the targeted delivery of vincristine to B-cell lymphoma. Mol. Pharm. 9, 1727-1735 (2012).
  23. Lu, S. C. Regulation of glutathione synthesis. Mol. Aspects Med. 30, 42-59 (2009).
  24. Xiao, K., et al. "OA02" peptide facilitates the precise targeting of paclitaxel-loaded micellar nanoparticles to ovarian cancer in vivo. Cancer Res. 72, 2100-2110 (2012).
  25. Koo, A. N., et al. Disulfide-cross-linked PEG-poly(amino acid)s copolymer micelles for glutathione-mediated intracellular drug delivery. Chem. Commun. 28, 6570-6572 (2008).
  26. McLellan, L. I., Wolf, C. R. Glutathione and glutathione-dependent enzymes in cancer drug resistance. Drug. Resist. Update. 2, 153-164 (1999).
  27. Karala, A. R., Lappi, A. K., Saaranen, M. J., Ruddock, L. W. Efficient peroxide-mediated oxidative refolding of a protein at physiological pH and implications for oxidative folding in the endoplasmic reticulum. Antioxid. Redox Signal. 11, 963-970 (2009).
  28. Gabizon, A., et al. Cancer nanomedicines: closing the translational gap. Lancet. 384, 2175-2176 (2014).
  29. Nanotrac Nanotechnology Particle Size Measurement Solutions. , Available from: http://www.vahitech.com/Assets/Nano(US)Web.pdf (2006).

Tags

ביוכימיה גיליון 118 ננו-חלקיקים אספקת סמים מיצלות telodendrimer cross-linking דיסולפיד מימן בתיווך חמצן חמצון
גישה קלילה ויעילה לייצור ההפיך דיסולפיד צולב Micelles
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Y., Bharadwaj, G., Lee, J. S. A… More

Li, Y., Bharadwaj, G., Lee, J. S. A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles. J. Vis. Exp. (118), e54722, doi:10.3791/54722 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter