Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Легким и эффективным подходом к производству Реверсивный дисульфид поперечно-сшитого мицелл

Published: December 23, 2016 doi: 10.3791/54722
Automatic Translation
1,2, 1, 3
1Department of Biochemistry & Molecular Medicine, University of California, Davis, 2UC Davis Comprehensive Cancer Center, University of California, Davis, 3Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of California, Davis

Abstract

Наномедицина является новой формой терапии, которая использует уникальные свойства частиц, которые нанометров в масштабе для биомедицинского применения. Улучшение доставки лекарственных средств, чтобы максимизировать результаты лечения и уменьшить связанный с наркотиками побочные эффекты являются одними из краеугольных камней современного наномедицины. Наночастицы, в частности, нашли широкое применение в лечении рака. Наночастицы, которые предлагают высокую степень гибкости при проектировании, применении и производстве на основе микросреды опухоли, по прогнозам, будет более эффективным с быстрым переводом в клиническую практику. Полимерный мицеллярной нано-носитель является популярным выбором для приложений доставки лекарственных средств.

В этой статье мы опишем простой и эффективный протокол для синтеза наркотиков загруженным, дисульфид сшитых мицеллы на основе самосборки хорошо определенной амфифильного линейно-дендритных сополимера (telodendrimer, TD). ТД состоит из полиэтилена ГЛycol (ПЭГ) в качестве гидрофильного сегмента и тиолированным кластера холевой кислоты в качестве основного образующего гидрофобного фрагмента, присоединенного к ступенчато с концевыми аминогруппами ПЭГ с использованием раствора на основе пептидной химии. Химиотерапевтических средств, таких как паклитаксел (PTX), может быть загружен с помощью стандартного метода выпаривания растворителя. -опосредованного Окисления O 2 была ранее использована для формирования внутри мицеллярных дисульфидные поперечные связи из свободных тиоловых групп на TDs. Тем не менее, реакция была медленной, и не представляется возможным для крупномасштабного производства. В последнее время метод окисления H 2 O 2 -опосредованного была изучена в качестве более приемлемого и эффективного подхода, и это было в 96 раз быстрее , чем сообщалось ранее способом. Используя этот подход, 50 г PTX-нагруженных, дисульфид сшитых наночастицы были успешно получены с узким распределением частиц по размерам и эффективности погрузки высокого лекарственного средства. Стабильность полученного раствора мицелл анализировались с использованием разрушающие условий, таких как в случае совместной инкубации шIth в додецилсульфата моющее средство, натрия, с добавлением или без восстанавливающего агента. Препарат загруженным, дисульфид сшитые мицеллы продемонстрировали менее гемолитической активностью по сравнению с их не сшитый коллегами.

Introduction

Нанотехнологии является быстро развивающейся области , которая выиграла ряд медико - биологических областях 1. Наночастицы предоставляют возможности для проектирования и настройки свойств, которые не представляется возможным с другими типами обычных терапевтических средств. Нано-носители повышения стабильности лекарств против биодеградации, увеличивать время оборота наркотиков, преодолеть проблемы растворимости лекарства, и могут быть доработаны для адресной доставки лекарств и сопутствующих доставки агентов визуализации 1,2. Наночастиц на основе систем доставки перспективны в визуализации и лечения рака. Опухолевые vasculatures являются негерметичных макромолекул и может привести к преимущественному накоплению циркулирующих наночастиц в опухолевых участках через повышенной проницаемости и удерживания (EPR) эффект 3. Среди нескольких нано-носителей (например, липосомы, гидрогели, и полимерные мицеллы), которые активно преследуемых в качестве носителей для противораковых препаратов, полимерные мицеллы получили широкую популярность в течение гое последнее десятилетие 4,5.

Полимерное мицеллы представляют собой термодинамическую систему, которая, при внутривенном введении, потенциально могут быть ослаблены ниже критической концентрации мицелл (CMC), что приводит к их диссоциации в unimers. стратегии Поперечное сшивание были использованы для минимизации мицеллярный диссоциации на unimers. Тем не менее, чрезмерно Стабилизированные мицеллы могут предотвратить лекарство от высвобождения в целевых местах, тем самым уменьшая общую терапевтическую эффективность. Несколько химических подходов были изучены , чтобы сшивающий разлагаемые в ответ на окислительно - восстановительными или на внешние раздражители, такие как восстанавливаемых дисульфидных связей 6,7 и рН расщепл 8 или Гидролизуемый облигации 9,10.

Ранее мы уже сообщали конструкцию и синтез мицеллярных наночастиц , состоящих из дендритных холевой кислоты (СА) блока и линейный полиэтиленгликоль (ПЭГ) , сополимеры называют telodendrimers (TD) 11-15 нК -CAy (где п = молекулярная масса в килодальтон (К), у = количество холевой кислоты (CA) единиц). Они характеризуются малыми размерами, длительным сроком хранения, а также высокую эффективность в заключающих лекарственных средств, таких как паклитаксел (PTX) и доксорубицина (DOX) в гидрофобного ядра. Строительные блоки ТД, такие как PEG, лизин, и СА, являются биологически совместимыми, и наличие короны ПЭГ может придать "невидимости" наночастицами характер, предотвращая неспецифическую поглощение мицеллярных наночастиц ретикулоэндотелиальной системы.

Тиолированный линейно-дендритных полимеры могут быть легко сгенерирована путем введения цистеина в дендритных олиго-лизина основой нашего стандартного TDs. Данная статья представляет собой протокол для легкое производства мицеллярной системы обратимо сшитый доставки лекарственных средств путем введения дисульфидных поперечных связей в гидрофобную сердцевину TDs (Рисунок 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этика заявление: Женский бестимусных голых мышей (Nu / Nu штамм), 6-8 недель, были приобретены и затем держали под патогена условиях в соответствии с рекомендациями AAALAC и позволили акклиматизироваться в течение по крайней мере 4 дней до начала каких-либо экспериментов. Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с ведомственным руководящим принципам и в соответствии с Протоколом № 07-13119 и № 09-15584, утвержденного использования животных и Консультативного комитета по уходу административным вопросам в Университете Калифорнии, Дэвис.

1. Синтез ТД PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -ca 8

  1. В круглодонную колбу, растворяют MeO-ПЭГ 5К -NH 2 (2 г, 0,4 ммоль) в 10-20 мл безводного диметилформамида (ДМФ) и холод на льду.
  2. В стеклянном стакане растворите 3 экв. 1-гидрокси-6-хлор-бензотриазола (HOBt), 3 экв. из N, N 'диизопропилкарбодиимид (DIC), и 3 экв. из (Fmoc) 2 Lys-OH в безводном DМФ (10-15 мл). Смесь перемешивают в течение 15-20 мин на магнитной мешалке.
  3. Добавьте смесь в реакционную колбу , содержащую MeO-ПЭГ 5К -NH 2. Удалите ледяную баню и реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре.
  4. Подтвердить завершение реакции с данным тонкослойной хроматографии (ТСХ) 16 и тест Кайзера 17 (желтый цвет указывает на отсутствие свободного NH 2). Осадить полимерный продукт 1 (MeO ПЭГ-5K -Lys (NH-Fmoc) 2) путем добавления приблизительно 200 мл охлажденного на льду эфира в реакционную колбу. Отделить Осажденный полимер с помощью центрифугирования (6 мин при 6000 XG и 4 ° С).
    1. Для выполнения TLC, пятно образцы на силикагеле, покрытых пластинах ТСХ. С помощью смеси дихлорметан / метанол (9: 1) в качестве подвижной фазы. Обратите внимание пятна под УФ-лампой после разработки пластин ТСХ. Можно также использовать нингидриновая окрашивающий реагент для визуализации аминов пятен на плитке.
    2. Для КайИспытание Ser, место создания немного образца в стеклянной трубке, содержащей реагент Кайзера. Нагревают его при температуре 100 ° С в течение 5 мин и искать изменения цвета (если цвет раствора остается желтым, то реакция завершена).
  5. Повторно растворить продукт в безводном ДМФ (10-20 мл) и повторяют осаждение и центрифугирование (см шаг 1.4).
  6. Повторите шаг 1,5, а затем промывают осадок полимера, трижды ледяным эфиром.
  7. Перенести полимерный осадок 1 в чистую реакционную колбу и соединить колбу с высоким источником вакуума для удаления остаточного эфира.
  8. Подготовка и добавить примерно 20-30 мл 20% (об / об) 4-метилпиперидина в ДМФ к полимеру Промежуточное соединение 1. Перемешать до полного растворения. Запуск реакции в течение 3 ч.
  9. Выполнение TLC 16 и тест Кайзера (синий цвет подтверждает наличие свободного NH 2) 17 (см шаг 1.4) для подтверждения completioп реакции. Если реакция завершена, переходим к эфирному осаждения, как указано дл продукта 1 (шаги 1.4-1.6).
  10. Сушат полимерный продукт 2 (MeO-PEG 5K -Lys (NH 2) 2) под вакуумом.
  11. Проводят еще один раунд (Fmoc) 2 Lys-OH-соединением на промежуточный 2 (шаги 1.1-1.7) для создания продукта 3 (MeO-ПЭГ 5K -Lys (Lys (NH-Fmoc) 2) 2). Де-защиты (шаги 1.8-1.10) в Fmoc группы (4, MeO-ПЭГ 5K -Lys (Lys (NH 2) 2) 2) и пара (шаги 1.1-1.7) в (Fmoc) Lys (BOC) -OH к генерируют третьего поколения дендритных полилизин (5, MeO-ПЭГ 5К -Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys (БОК)) 4) прекращается с четырьмя Вос- и Fmoc групп на одном конце цепи ПЭГ.
  12. Перенести полученный полимер промежуточного соединения 5 в реакционную колбу. В качествеeparate реакционную колбу, готовят 1: 1 (об / об) трифторуксусной кислоты (TFA) в дихлорметане (ДХМ). Добавить 15-20 мл смеси 1: 1 TFA / ДХМ (об / об) в полимере промежуточного соединения 5. Перемешать смесь, пока полимер полностью не растворится. Перемешивают еще в течение 3 часов.
  13. Выполнение ТСХ 16 и тест Кайзера (синий цвет подтверждает наличие свободного NH 2) 17 (этап 1.4) , чтобы подтвердить завершение реакции. Если реакция завершена, выпарить смесь полимер-в-TFA / DCM с воздухом до тех пор, пока не будет получено вязкий раствор. Переходим к эфирным осаждения, как указано дл продукта 1 (шаги 1.4-1.6). Сушат полимерный продукт 6 (MeO-PEG 5k -Lys-Lys 2 - ((Fmoc) лизином (NH 2)) 4) в вакууме.
  14. Полимерпередаточные промежуточный 6 в реакционную колбу. Используйте приблизительно 40 мл безводного ДМФ, содержащего 8 экв. из N, N -diisopropylethylamiпе (DIEA) для растворения полимера промежуточного 6. В стеклянном стакане растворите 12 экв. из HOBt, 12 экв. ДВС и 12 экв. из (Fmoc) Cys (Trt) -OH в 20-25 мл безводного ДМФ. Встряхивают в течение 10-15 мин, а затем добавляют в реакционную смесь в реакционную колбу , содержащую 6. Запуск реакции в течение ночи.
  15. Подтвердите завершение реакции с TLC 16 и тестом Кайзера (см шаг 1.4; желтый цвет указывает на отсутствие свободного NH 2) 17. Если реакция завершена, переходим к эфирному осаждения, как указано дл продукта 1 (этап 1,4-1,6), чтобы изолировать продукт 7 (MeO-PEG 5K -Lys-Lys - 2 - ((Fmoc) Lys - ((Fmoc) Cys (Trt))) 4.
  16. Выполнение Fmoc снятия защиты 7, как показано на шаге 1.8, для получения продукта 8 (PEG 5K -Lys-Lys , 2 - (Lys (NH 2) - (Cys (NH 2) (ТРТ))) 4). Пара (Fmoc) -PEG 2 -Suc-OН ( "Ebes" линкер, 24 экв.) На полимерную промежуточное с использованием процедуры , описанной выше для HOBt / ДИК-опосредованной связью с получением промежуточного соединения 9 (MeO-PEG 5K -Lys-Lys 2 -Lys 4 - (Cys (Trt) ) 4 (Ebes (NH-Fmoc)) 8).
  17. Выполните еще один раунд Fmoc - де-защиты (шаги 1.6-1.8) , чтобы получить промежуточное соединение 10 (MeO-ПЭГ 5K -Lys-Lys 2 -Lys 4 - (Cys (Trt)) 4 (Ebes (NH 2)) 8).
  18. Перенести полимера промежуточного соединения 10 в реакционную колбу и добавляют безводный ДМФ (примерно 30-40 мл) , чтобы растворить его. В другой реакционной колбе, растворяют 24 эквив. из CAOSu (полученного в соответствии с ранее опубликованным способом) в безводном ДМФ (20-30 мл) 18. Добавить 48 экв. из N, N - диизопропилэтиламин и пусть перемешивают в течение 10-15 мин. Перенести содержимое в реакционную колбу , содержащую 10 , и пусть протекания реакции Overnight.
  19. Подтвердите завершение реакции с TLC 16 и тестом Кайзера (см шаг 1.4; желтый цвет указывает на отсутствие свободного NH 2) 17. Если реакция завершена, переходим к эфирному осаждения, как указано дл продукта 1 (шаги 1.4-1.6) , чтобы изолировать продукт 11 (MeO-PEG 5K -Lys-Lys 2 -Lys 4 - (Cys (Trt)) 4 -Ebes 8 -ca 8). Диализировать его в деионизованной воде и лиофилизации образец с получением белого порошка.
  20. Поместите полимер промежуточного соединения 11 в реакционную колбу. Подготовьте и добавьте 20 мл TFA / 1,2-этандитиола (EDT) / триэтилсилан (TIS) / H 2 O (94 / 2,5 / 1 / 2,5, об / об) смеси в раствор полимера. Размешайте смесь до полного растворения. Запуск реакции в течение 4 часов. Подтверждения завершения реакции по ТСХ 16.
  21. Под вытяжкой, вдувать воздух в полимер-ТФК / EDT / TIS / H 2O смесь, пока раствор становится вязким. Переходим к эфирным осаждения, как указано дл продукта 1 (шаги 1.4-1.6), чтобы изолировать конечный продукт, 12 (ПЭГ 5K -Cys 4 -Ebes 8 -ca 8). Растворите его в ацетонитриле и лиофилизации его с получением белого порошка.

2. Получение PTX-нагруженных мицелл

  1. Подготовить PTX загруженным ПЭГ 5К -Cys 4 -Ebes 8 -ca 8 мицеллы с использованием стандартного метода испарения.
    1. Растворяют 20 мг TD с различным количеством PTX (1-9 мг) в 1 мл хлороформа (CHCl 3). Растворитель удаляют с помощью роторного испарителя с получением гомогенной, сухой полимерной пленки. Развести пленку с 1 мл фосфатно-солевым буферным раствором (PBS), вихрем, с последующей обработкой ультразвуком в течение 30 мин при частоте 40 кГц, если это необходимо, чтобы обеспечить образование мицелл наркотиков загруженным.
    2. Добавить 6 мкл 3% (вес / вес) H 2 O 2 (1 экв. На FrЕ.Е. тиоловых групп), чтобы окислить тиол группы на TD. С помощью раствора мицелл для дальнейшей характеристики , как только уровень свободных тиоловых групп остается постоянным при низких значениях, как показано с помощью теста Эллмана 19.
    3. Фильтр решение с использованием фильтра 0,22 мкм для стерилизации образца. Анализ количества лекарственного средства , загруженного в мицеллах на 20 системы ВЭЖХ после высвобождения лекарства из мицелл путем добавления 9 раз ацетонитрила и выполнения 10 мин обработки ультразвуком. С помощью колонки С18 для ВЭЖХ с ацетонитрил / вода в качестве подвижной фазы.
    4. Рассчитывают загрузки лекарственного средства в соответствии с калибровочной кривой между значениями площади ЖХВД и концентрации препарата стандартного 11.
      Примечание: Эффективность нагрузки определяется как отношение лекарственного средства, загруженного в мицеллы к начальному содержанию лекарственного средства.

3. Характеризации мицелл

  1. Измерьте распределение по размерам и размер мicelles с динамического рассеяния света (DLS) прибора 29. Выполнения измерений при комнатной температуре и поддерживать концентрацию мицелл в концентрации 1 мг / мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения анализа размера частиц, используют PBS в качестве заготовки, а затем записать размер частиц для реальных образцов. Возьмите показания в трех экземплярах для образцов, а затем усреднить показания.
  2. Используйте спектры флуоресценции для измерения критическая концентрация мицеллообразования (ККМ) ПЭГ 5K -Cys 4 -Ebes 8 -ca 8 до и после сшивания с пирена в качестве гидрофобного флуоресцентного зонда, как было описано выше 13,21.
    Примечание: Как правило, концентрация мицелл в диапазоне от 5 × 10 -7 до 5 × 10 -4 М.

4. Стабильность мицелл в SDS с или без восстановителей

  1. Подготовка исходных растворов додецилсульфата натрия (SDS) (7,5 мг / мл), и дисульфиды, сшитые мицеллы (1,5 мг / мл) в PBS. Далее, Uпеть Маточные растворы, сделать смесь раствора, в которой конечная концентрация ПБС в дозе 2,5 мг / мл, а концентрация мицелл находится в 1,0 мг / мл.
  2. Измерить распределение по размерам и размер (как указано в шаге 3.1) мицеллы растворов с заранее определенными интервалами времени с использованием или без присутствии 10 мМ глутатиона (GSH).

5. Анализ Гемолиз

  1. Оценка гемолитический потенциал PTX загруженным, не сшитыми мицелл (PTX-НКМ) , приготовленный в соответствии с ранее опубликованным способом 11 и PTX-нагруженных сшитых мицелл (PTX-евроигра) с использованием свежей цитратной крови из голых мышей , собранных из хвост вуаль.
    1. Сбор красных кровяных клеток путем центрифугирования пробы крови (1,0 мл) при 1000 х г в течение 10 мин, промыть их три раза ПБС, а затем вновь приостановить гранул клеток с PBS до конечной концентрации 2%.
  2. Смешайте 200 мкл суспензии эритроцитов с различными концентрациями (0,2 и 1,0мг / мл) PTX-НКМ и PTX-евроигра, соответственно, и инкубируют в течение 4 ч при 37 ° С в инкубаторе шейкере.
  3. Центрифуга мицеллы смесей эритроцитов при 3000 х г в течение 5 мин. Перенести 100 мкл надосадочной жидкости всех проб в 96-луночный планшет. Измеряют поглощение свободного гемоглобина в надосадочной жидкости при 540 нм с помощью ридера микроплиты.
    Примечание: Эритроциты, инкубированные с Тритон-100 (2%) и PBS, должны быть использованы в качестве положительных и отрицательных контролей, соответственно. Процент гемолиза эритроцитов вычисляется по следующей формуле: RBC = гемолиз (OD образца - OD отрицательный контроль) / (OD положительного контроля - О.Д. отрицательный контроль) х 100%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Получение и определение характеристик наркотиков загруженным, дисульфид Поперечно-сшитый мицелл

Амфифильные полимерные ПЭГ 5K -Cys 4 -Ebes 8 -ca 8 представляет собой дендритный полимер , способный образовывать дисульфидную сшитый систему мицеллярный для доставки лекарств рака. Конструктивно оно определяется как дендритные олигомера желчных кислот (гидрофобный домен) соединен с одним концом линейной молекулы ПЭГ (гидрофильный домен, молекулярная масса 5K) через разветвленного поли (лизин-цистеин-Ebes) позвоночника. Есть несколько преимуществ использования этих блок-сополимеров, по сравнению с другими сообщенных мицеллярных систем. Во-первых, его можно легко синтезировать с помощью ступенчатых реакций конденсации в фазе раствора. Во-вторых, по сравнению с несколькими другими сообщенных амфифильных полимеров, тиолированного полимерной системы, подготовленные с помощью хорошо установлены в жидкой фазе ступенчатого химии пептидов Fmoc, имеет четко определенный structuчисло рейнольдса Он может храниться в форме лиофилизированного порошка и имеет более длительный срок годности.

Несколько методов могут быть использованы для характеристики конечного продукта. Количество холевой кислоты прикреплен к ТД может быть обнаружено путем сравнения отношения сигнала протонов от PEG тем , на трех метильных групп холевой кислоты в спектрах ЯМР 1 Н. Молекулярные массы ТД может быть подтверждена с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии и гель-проникающей хроматографии (ГПХ). Испытание количественного Эллмана может быть использован, чтобы расшифровать количество свободных остатков цистеина, присутствующих в молекуле.

PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -ca 8 может самостоятельно собираться , чтобы образовывать мицеллы в водной среде. С помощью стандартного растворителя метод испарения, различные гидрофобных лекарственных средств, таких как PTX и винкристин, были успешно инкапсулированы в мицеллах 13,22. Oxygен был ранее использован для окисления свободных тиоловых групп ПЭГ 5K -Cys 4 -Ebes 8 -ca 8 и с образованием внутри мицеллярных дисульфидные поперечные связи. Как контролируется с помощью теста Эллмана, скорость превращения из свободных тиоловых групп в дисульфидные связи, доходила до 85% за 48 ч окисления. AH 2 O 2 -опосредованного окислительную недавно был использован в качестве альтернативного способа. Степень конверсии достигла 88% в течение 30 мин (рисунок 2), который был в 96 раз быстрее , чем предыдущий подход. Пятьдесят граммов PTX загруженным, дисульфидные сшитые наночастицы были успешно получены с использованием этого более эффективный подход (рисунок 3). Размер частиц составлял около 27 нм, с узким распределением по размерам (рисунок 3). Эффективность загрузка лекарственного средства приближается к 100% с PTX загрузкой 4,0 мг / мл. Дисульфид сшивание оказали значительное влияние на стоимость CMC. По сравнению со стандартом TD PEG 5K -ca 8 , что отсутствиедисульфидные связи, сшитый ТД показал 10-кратное снижение наблюдаемых значений КМЦ (5,53 мкМ против 0,67 мкМ) 13.

Исследования стабильности

Кроме того, мы исследовали стабильность PTX-нагруженных, дисульфид сшитых мицеллы против тяжелых мицеллы разрушающие условиях. додецилсульфата натрия (ДСН) является сильным ионным моющее средство, которое обычно используется для оценки мицеллярный стабильности, так как она может эффективно разрушить полимерные мицеллы. Устойчивость к лекарственным препаратам загружены, дисульфид сшитых мицелл (1,0 мг / мл) контролировали с помощью СДО в присутствии мицелл разрушающие SDS (2,5 мг / мл). Размер частиц мицелл оставался стабильным в течение долгого времени, что свидетельствует о том , что такие сшитые мицеллы остались нетронутыми (рис 4, левые панели). Восстановительное условия, как ожидается, расщеплять дисульфидные связи в гидрофобной сердцевине, TherЭби делает мицеллы, восприимчивых к дестабилизации. Глутатион (GSH), эндогенного восстановителя, часто используется для таких исследований. Существует разительный контраст в внутриклеточного уровня GSH по сравнению с внеклеточным уровнем (10 мм против 2 мкм). Эта разница в концентрациях, часто используется для генерации раздражители реагирующих систем. После добавления GSH при внутриклеточной концентрации (10 мм) 23, размер препарата загруженным, дисульфид сшитых мицелл оставались нетронутыми в течение 30 мин. Они резко снизилась до 1 нм, что свидетельствует о снижении критического количества дисульфидных связей, что является предпосылкой быстрого диссоциации мицелл (рисунок 4, правая панель). Напротив, система оставалась стабильной в присутствии внеклеточных концентраций GSH (данные не показаны).

Гемолиз исследование

фигура5 показывает различия в наблюдаемой гемолитической активности PTX-нагруженных мицеллы, с или без дисульфидных поперечных связей. Гемолиз клеток крови следует избегать при введении этих частиц в поток крови, так как это подрывает их терапевтические преимущества. Гемато-совместимость очень важна для применения в естественных условиях на основе полимеров носителей лекарственных средств, таких как амфифильных TDs, которые потенциально могут солюбилизировать липиды или включить себя в фосфолипидных мембран, что приводит к разрыву плазматической мембраны. Как показано на рисунке 5, было установлено, PTX-НКМ иметь дозозависимое красных кровяных клеток (эритроцитов) подсчет лизиса, с процентом гемолиза увеличилась с 8,1% до 14,2% , как концентрация PTX-НКМ увеличилась с 0,2 мг / мл до 1,0 мг / мл. Тем не менее, PTX-евроигра, которые имеют дисульфида сшивку не показал наблюдаемых гемолитической деятельности (<1,0%) в эритроцитах при тех же экспериментальных условиях. Это различие в hemolysявляется тенденция можно отнести к внутри- мицеллярный дисульфидными мостиками, присутствующими на гидрофобного ядра, которые предотвращают PTX-евроигра от диссоциировать с образованием амфифильный TDs.

Рисунок 1
Рисунок 1: Этапы формирования сшитых мицеллы. Схематическое представление дисульфидными сшитых мицелл , образованных окислением Тиолированный telodendrimer PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -ca 8 после того, как самосборки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Методы окисления для формирования сшитой мицеллы. Степень конверсии тон тиоловых групп на ТДС к дисульфидные связи, в зависимости от времени окисления для двух способов окисления. Суммарная концентрация мицелл поддерживалась на уровне 20 мг / мл. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Drug загруженным, сшитой мицеллы. Левая панель: изображение партии PTX-нагруженных, дисульфид сшитых мицеллы. Шкала бар: 1 дюйм. Правая панель: размер частиц, как это определено с помощью динамического рассеяния света (DLS). Суммарная концентрация мицелл поддерживалась на уровне 20 мг / мл. Нагрузка PTX была 4 мг / мл. Данные размер частиц был показан средний размер частиц ± стандартное отклонение на основе трех измерений. SD: стандартное отклонение, описывает ширину измеренного распределения частиц по размерам.Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Исследование стабильности. Размер частиц PTX-нагруженных, дисульфид сшитых мицеллы в присутствии 2,5 мг / мл SDS без (слева) или с (справа) GSH (10 мМ), как измерено с помощью DLS. Данные размер частиц был показан средний размер частиц ± стандартное отклонение на основе трех измерений. SD: стандартное отклонение, описывает ширину измеренного распределения частиц по размерам. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5: Гемолиз анализ. В пробирке гемолитической активности PTX-нагруженных, дисульфид сшитых мицеллы в сравнении с несшитых мицеллы на красных кровяных телец (эритроцитов). Тритон-100 (2%) и PBS, использовались в качестве положительных и отрицательных контролей, соответственно. Сообщенные значения представляют собой средние значения ± стандартное отклонение от трех образцов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Несколько наночастиц были исследованы на предмет их потенциального использования в доставке лекарств. Липосомальных доксорубицин и паклитаксел (PTX) -loaded сывороточного альбумина человека нано-агрегаты относятся к числу nanotherapeutics, одобренных FDA для лечения рака. Тем не менее, несмотря на то клинически эффективен, обе эти nanotherapeutics относительно "больших" размеров, и они имеют тенденцию к накоплению в печени и легких. Полимерные мицеллы с относительно меньшими размерами частиц и высоких мощностей погрузки наркотиков появляются наноносителей для доставки лекарственных средств. Их уникальная структура ядро-оболочка '' солюбилизации '' гидрофобные молекулы препарата в водных условиях путем физического капсулирования. Полимерные мицеллы, состоящие из четко определенных TDs, подготовленных в нашей лаборатории форме монодисперсных наночастиц (10-50 нм размер частиц) с длительным сроком хранения и высокую эффективность инкапсулирования препаратов. Одним из многочисленных преимуществ надежной TD платформы является универсальность полимера.Многочисленные препараты, флуоресцентные красители и таргетингом лиганды могут быть легко включены в TD платформу 13,15,24.

Критические шаги в рамках Протокола

Мы разработали надежную, обратимое, дисульфид поперечно-сшитый систему мицелл для PTX доставки, который хорошо определен, с размером частиц около 27 нм, и имеет узкое распределение по размерам. ТДС были синтезированы с помощью ступенчатого раствора фазы химии пептидов. Четко определенная химическая структура этих TDs является ключевым фактором для получения наночастиц с заданными свойствами. Таким образом, подтверждая завершение реакции с тестом ТСХ и Кайзера имеет очень важное значение. H 2 O 2 Окисление также является важным шагом, тиоловых групп на ТД окисляются с образованием дисульфидных поперечных связей, что значительно повышает стабильность мицелл. По сравнению с нашим предыдущим методом окисления на основе кислорода, Н 2 О 2 -основанный метод Окисление в 96 раз быстрее, обеспечивая тем самым сшитых мицеллы в более короткие периоды времени. Кроме того, GSH, тиолсодержащим трипептид, является важным антиоксидантом, продуцируемых клетками, и он играет важную роль в очистку свободных радикалов и кислородные соединения. Это делает большой вклад за счет поддержания клеточного окислительно-восстановительного гомеостаза. Клеточная концентрация GSH является интересным аспектом дизайна лекарств. Внутриклеточной концентрации глутатиона в настоящее время твердо установлено , чтобы быть значительно выше , чем концентрации внеклеточного (10 мМ в сравнении с 2 мкМ, соответственно) 25. Что еще более важно, повышенный уровень внутриклеточного GSH часто сообщалось во многих устойчивых к лекарственным препаратам человека и мышиных опухолевых клеток 26. Высокая внутриклеточное распределение GSH облегчает разрушение дисульфидных поперечных связей мицелл и приводит к высвобождению и накопление полезной нагрузки лекарственного средства. Наночастицы сшитые дисульфидными являютсястабильным в присутствии SDS. Тем не менее, GSH богатых внутриклеточная среда вызывает высвобождение лекарственного средства путем разрушения дисульфидных связей, тем самым дестабилизировать систему. Полимерно-индуцированный гемолиз в результате вредного взаимодействия полимерных мицелл с компонентов крови, таких как эритроциты. Сшитые мицеллы показал гораздо меньше гемолиз по сравнению с не сшитых аналогов.

Модификации и устранение неисправностей

Используя H 2 O 2 в качестве окислителя позволяет образованию сшивок более эффективным дисульфида по сравнению с ранее сообщалось, на основе кислорода методом 13. H 2 O 2 является сильным окислителем 27 , который является недорогим и хорошо растворяется в воде и дает продукцию высокого качества по сравнению с некоторыми другими известными окислителями (например, хромат или перманганата). Тем не менее, время Окисление может потребоваться furtheг оптимизируется на основе шкалы синтеза.

Ограничения техники

H 2 O 2 является сильным окислителем. Несмотря на то, низкая концентрация H 2 O 2 используется для проведения образования поперечных связей дисульфида, уход должен быть принят при использовании с TDs нагруженных "чувствительных к окислению" лекарств с целью предотвращения нежелательной деградации наркотиков.

Значимость техники в отношении существующих / альтернативных методов

Описанная методика является простой экспериментальной установки, которая может быть легко воспроизведен в стандартной лаборатории. Например, загрузка лекарственного средства с использованием стандартного метода выпаривание меньше времени по сравнению с методом диализа. Образование дисульфида в ядре с помощью H 2 O 2 в качестве окислителя в 96 раз быстрее , чем сообщалось ранее методом окислительной с использованием oxygEN 13. Воспроизводимость на стадии лекарственной нагрузки может быть легко оценена с помощью измерения размера частиц (метод СДО) и содержание лекарственного средства (ВЭЖХ).

Будущие приложения или направления после освоения этой технике

По сравнению с препаратами малых молекул, одним из основных препятствий , которые необходимо преодолеть , прежде чем наномедицине можно ввести параметры основного направления по уходу за рак является технические проблемы расширения масштабов производства 28. После освоения этой новой разработанной методики, можно легко синтезировать дисульфидные поперечно-сшитые мицеллы в крупном масштабе. Это крайне желательно для клинических исследований этого нано-препарата у больных людей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MeO-PEG5K-NH2 Rapp Polymere 125000-2
Fmoc-Lys(Fmoc)-OH Aaptec AFK107
Fmoc-Lys(Boc)-OH Anaspec AS-20132
Fmoc-Cys(Trt)-OH Aapptec AAC105
Dimethylformamide Fisher Scientific BP1160-4
Ethyl ether Fisher Scientific E134-20
N,N-Diisopropylethylamine Sigma Aldrich D125806
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich T6508 Corrosive, handle with care
4-methyl piperidine Alfa-Aesar L-02709
Ebes linker Anaspec AS-61924
Cholic acid Sigma Aldrich C1129
1,2-Ethanedithiol Sigma Aldrich 02390 Handle inside fume hood. Bleach gloves after usage.
Triisopropylsilane Sigma Aldrich 233781
Chloroform (anhydrous) Sigma Aldrich 288306
Hydrogen peroxide solution 30% Aaron Industries NA
HoBt-Cl Aaptec CXZ096
DIC Sigma Aldrich D125407
Female athymic nude mice (Nu/Nu strain), 6–8 weeks age Harlan (Livermore, CA)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, L., et al. Nanoparticles in medicine: therapeutic applications and developments. Clin. Pharmacol. Ther. 83, 761-769 (2008).
  2. Wang, A. Z., Langer, R., Farokhzad, O. C. Nanoparticle Delivery of Cancer Drugs. Annu. Rev. Med. 63, 185-198 (2012).
  3. Iyer, A. K., Khaled, G., Fang, J., Maeda, H. Exploiting the enhanced permeability and retention effect for tumor targeting. Drug Disc. Today Targets. 11, 812-818 (2006).
  4. Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles. Pharmacol. Rev. 64, 505-519 (2012).
  5. Kamaly, N., Xiao, Z., Valencia, P. M., Radovic-Moreno, A. F., Farokhzad, O. C. Targeted polymeric therapeutic nanoparticles: design, development and clinical translation. Chem. Soc. Rev. 41, 2971-3010 (2012).
  6. Li, Y. L., et al. Reversibly stabilized multifunctional dextran nanoparticles efficiently deliver doxorubicin into the nuclei of cancer cells. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 9914-9918 (2009).
  7. Miyata, K., et al. Block catiomer polyplexes with regulated densities of charge and disulfide cross-linking directed to enhance gene expression. J. Am. Chem. Soc. 126, 2355-2361 (2004).
  8. Chan, Y., Wong, T., Byrne, F., Kavallaris, M., Bulmus, V. Acid-labile core cross-linked micelles for pH-triggered release of antitumor drugs. Biomacromolecules. 9, 1826-1836 (2008).
  9. Rijcken, C. J., Snel, C. J., Schiffelers, R. M., van Nostrum, C. F., Hennink, W. E. Hydrolysable core-crosslinked thermosensitive polymeric micelles: synthesis, characterisation and in vivo studies. Biomaterials. 28, 5581-5593 (2007).
  10. Talelli, M., et al. Core-crosslinked polymeric micelles with controlled release of covalently entrapped doxorubicin. Biomaterials. 31, 7797-7804 (2010).
  11. Xiao, K., et al. A self-assembling nanoparticle for paclitaxel delivery in ovarian cancer. Biomaterials. 30, 6006-6016 (2009).
  12. Li, Y., et al. A novel size-tunable nanocarrier system for targeted anticancer drug delivery. J. Control. Release. 144, 314-323 (2010).
  13. Li, Y., et al. Well-defined, reversible disulfide cross-linked micelles for on-demand paclitaxel delivery. Biomaterials. 32, 6633-6645 (2011).
  14. Li, Y., et al. Well-defined, reversible boronate crosslinked nanocarriers for targeted drug delivery in response to acidic pH values and cis-diols. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51, 2864-2869 (2012).
  15. Li, Y., et al. A smart and versatile theranostic nanomedicine platform based on nanoporphyrin. Nat. Commun. 5, (2014).
  16. Belenki, B. G., Gankina, E. S. Thin-Layer chromatography of polymers. J. Chromatogr. A. 141, 13-90 (1977).
  17. Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).
  18. Pandey, P. S., Rai, R., Singh, R. B. Synthesis of cholic acid-based molecular receptors: head-to-head cholaphanes. J. Chem. Soc., Perkin Trans 1. , 918-923 (2002).
  19. Riddles, P. W., Blakeley, R. L., Zerner, B. Reassessment of Ellman's reagent. Methods Enzymol. 91, 49-60 (1983).
  20. Ahuja, S., Rasmussen, H. Overview of HPLC method development for pharmaceuticals. HPLC Method Development for Pharmaceuticals. , Separation Science and Technology; 8. Elsevier Academic Press Inc. 1-11 (2007).
  21. Li, Y., Pan, S., Zhang, W., Du, Z. Novel thermo-sensitive core-shell nanoparticles for targeted paclitaxel delivery. Nanotechnology. 20 (6), 065104 (2009).
  22. Kato, J., et al. Disulfide cross-linked micelles for the targeted delivery of vincristine to B-cell lymphoma. Mol. Pharm. 9, 1727-1735 (2012).
  23. Lu, S. C. Regulation of glutathione synthesis. Mol. Aspects Med. 30, 42-59 (2009).
  24. Xiao, K., et al. "OA02" peptide facilitates the precise targeting of paclitaxel-loaded micellar nanoparticles to ovarian cancer in vivo. Cancer Res. 72, 2100-2110 (2012).
  25. Koo, A. N., et al. Disulfide-cross-linked PEG-poly(amino acid)s copolymer micelles for glutathione-mediated intracellular drug delivery. Chem. Commun. 28, 6570-6572 (2008).
  26. McLellan, L. I., Wolf, C. R. Glutathione and glutathione-dependent enzymes in cancer drug resistance. Drug. Resist. Update. 2, 153-164 (1999).
  27. Karala, A. R., Lappi, A. K., Saaranen, M. J., Ruddock, L. W. Efficient peroxide-mediated oxidative refolding of a protein at physiological pH and implications for oxidative folding in the endoplasmic reticulum. Antioxid. Redox Signal. 11, 963-970 (2009).
  28. Gabizon, A., et al. Cancer nanomedicines: closing the translational gap. Lancet. 384, 2175-2176 (2014).
  29. Nanotrac Nanotechnology Particle Size Measurement Solutions. , Available from: http://www.vahitech.com/Assets/Nano(US)Web.pdf (2006).

Tags

Биохимия выпуск 118 наночастица для доставки лекарственных средств мицеллы telodendrimer дисульфид сшивка окисление перекисью водорода опосредованную
Легким и эффективным подходом к производству Реверсивный дисульфид поперечно-сшитого мицелл
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Y., Bharadwaj, G., Lee, J. S. A… More

Li, Y., Bharadwaj, G., Lee, J. S. A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles. J. Vis. Exp. (118), e54722, doi:10.3791/54722 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter