Summary
نقدم هنا طريقة العزلة والثقافة رواية الصف سريرية للكلى "ارتشاح الخلايا اللحمية" (كبسكس) استناداً إلى نضح الجهاز كله مع إنزيمات الجهاز الهضمي، وتخصيب اليورانيوم في NG2-الخلية. بهذه الطريقة، من الممكن الحصول على إعداد كافية من الخلايا للعلاج.
Abstract
الخلايا الوسيطة Stromal (MSCs) هي التماثل الساكن ومحصنة ضد مودولاتوري خلايا الأنسجة التي أظهرت آثار مفيدة في أمراض الكلي وزرع الأعضاء. مشاركة "ارتشاح الخلايا اللحمية" (PSCs) الخصائص مع نخاع العظام MSCs (bmMSCs). ومع ذلك، أيضا لديهم، على الأرجح نظراً لطابعة محلية، والخصائص الخاصة بالانسجة وتلعب دوراً في التوازن الأنسجة المحلية. قد يؤدي هذا التحديد الأنسجة في إصلاح الأنسجة محددة، وأيضا داخل الكلي البشرية. أظهرنا سابقا أن PSCs الكلي البشرية (كبسكس) قد عززت الكلي الظهارية الجرح الشفاء حين بمسكس لم تكن هذه الإمكانية. وعلاوة على ذلك، يمكن تحسين كبسكس إصابة الكلي في الجسم الحي. ولذلك، كبسكس تشكل مصدرا لاهتمام للعلاج بالخلايا، خاصة بالنسبة لأمراض الكلي وزراعة الكلي. هنا نعرض تفصيلاً طريقة العزلة والثقافة كبسكس من الصف زرع الكلي البشرية استناداً إلى نضح الجهاز الجامع للإنزيمات الهضمية عبر الشريان الكلوي وإثراء لعلامة ارتشاح في NG2. وبهذه الطريقة، يمكن الحصول كميات كبيرة الخلية التي تصلح للعلاج.
Introduction
الخلايا الوسيطة Stromal (MSCs) هي الخلايا المناعية مودولاتوري التي كانت أصلاً المعزولة من نخاع العظام. أنها تتميز المغزل بها تتشكل مورفولوجيا، القدرة على التفريق في الدهون والعظام والغضاريف والتقيد البلاستيك. أعرب MSCs عن علامات stromal CD73، CD90، CD105 حين يجري سلبية بالنسبة لعلامات CD31 و CD451،،من23. MSCs مرشح واعدة لخلية العلاج نظراً للتماثل الساكن الأنسجة وقدرات إيمونومودولاتوري. وتجري حاليا دراسة بمسكس في التجارب السريرية للعديد من الأمراض، بما في ذلك أمراض الكلي وزراعة الكلي كما استعرضت في أماكن أخرى4.
سابقا قد اتضح أن ارتشاح الخلايا من عدة أجهزة صلبة مختلفة، بما في ذلك الأنسجة الدهنية، والمشيمة، والهيكل العظمى والعضلات مشاركة الخصائص مع MSCs9. ومع ذلك، يحمل هذه الخلايا أيضا المهام الخاصة بالانسجة التي يمكن أن تسفر عن إصلاح أورجانوتيبيك10. على سبيل المثال، الخلايا البشرية ارتشاح احتشاء عضلة القلب، وتحفز استجابات الأوعية بعد نقص ومتباينة في cardiomyocytes، بينما ارتشاح الخلايا المعزولة من الأنسجة الأخرى لم تظهر هذه الإمكانات11.
يمكن أيضا أن الخلايا اللحمية ارتشاح معزولة من الماوس12،،من1314 والكلى البشرية15،16. ونحن على نطاق واسع يتسم كبسكس ومقارنة هذه إلى بمسكس. وجدنا أن كبسكس، شبيه بمسكس، تتمتع بقدرات كآبته، ويمكن أن تدعم تشكيل ضفيرة الأوعية الدموية. ومع ذلك، هناك الأنسجة توجد بعض الاختلافات بين أنواع الخلايا، كما أظهر توقيع تعبير النسخي أورجانوتيبيك، بما في ذلك عوامل النسخ نيفروجينيك HoxD10 و HoxD11 كبسكس. لم تطرأ التحول أرومية بعد التحفيز مع TGF-β كبسكس، وعلى النقيض من بمسكس، ولم يتمكنوا من التفريق في adipocytes. وعلاوة على ذلك، تسارع كبسكس سلامة الظهارية في جرح الظهارية أنبوبي كلوي مقايسة الصفر، ظاهرة التي لم يلاحظ مع بمسكس. هذا الجرح تعزيز إصلاح تمت بوساطة من خلال الإفراج عن عامل النمو تتمثل. وعلاوة على ذلك، تحسنت كبسكس إصابة الكلي في طراز ماوس كلوي حاد إصابة15. ولذلك، يبدو أن لديها قدرات متفوقة الكلوي إصلاح كبسكس وهي مصدر جديدة مثيرة لاهتمام لعلاج الخلايا في أمراض الكلي.
ولكي تكون قادراً على استخدام كبسكس لأغراض العلاج الخليوي، ينبغي أن تكون معزولة كبسكس بطريقة الصف سريرية مع الإنزيمات السريرية الصف والبروتوكولات. وعلاوة على ذلك، أن تكون قادرة على علاج العديد من المرضى مع كبسكس من المانحين 1، إعداد كافية من الخلايا ينبغي الحصول على. هنا نعرض بالتفصيل، إجراءات عزل الصف السريرية كبسكس من الصف كله زرع الكلي، مما أسفر عن إعداد كافية من الخلايا التي سيتم استخدامها للعلاج السريري.
Representative Results
ويرد في الشكل 1طريقة العزل كبسكس الصف السريرية. خلايا الكلي الخام معزولة عن زرع الأعضاء البشرية الصف الكليتين نضح كولاجيناز. هو مثقف تعليق الخلية الناتجة حتى روافد في ليساتيس الصفائح الدموية 5%. ثم الكسر الخلية اللحمية ارتشاح يتم عزل استناداً إلى التعبير في NG2.
كبسكس بلاستيكية ملتصقة على شكل المغزل الخلايا (الشكل 2ألف) وهي إيجابية لعلامات علامات stromal CD73، CD90، CD105، وارتشاح NG2، بدجفر-ب و CD146، بينما السلبية ل CD31، CD34، CD45 وهلا-الدكتور (الشكل 2ب). عادة، يمكن التوصل إلى عدد سكان متجانسة من كبسكس في ممر 4 وتصل كبسكس إلى الشيخوخة حول مرور 9-10 (الشكل 2-ج). ولذلك فإننا ننصح بالقيام بتجارب بين سن 5-8.
لتقييم القدرة الوظيفية كبسكس معزولة، نحن إجراء في المختبر الكلي الظهارية الجرح الصفر مقايسة على كل دفعة جديدة من كبسكس، كما أظهرنا سابقا أن المتوسط مكيفة من كبسكس يمكن أن يسرع في التئام الظهارية في هذا التحليل الصفر15. المتوسط كبسك مكيفة باستزراع كبسكس عن 48 ساعة في الفاميم 5% ليساتيس الصفائح الدموية وجمع المادة طافية. المقبل، هي استزراع الخلايا الظهارية (هونج كونج-2) أنبوب الدانية مخلدة الكلي البشرية17 حتى روافد وثم يتم إجراء جرح الصفر. ثم أما المتوسطة مكيفة من متوسطة كبسكس أو عنصر تحكم إضافة إلى الآبار وتقاس سرعة التئام الجروح. عندما تتم إضافة وسيلة مكيفة كبسكس، يغلق الجرح أسرع بشكل ملحوظ (الشكل 2د).
الشكل 1 : كبسكس "السريرية الصف العزل أسلوب الإنسان". زرع الكلي الصف مقني و perfused مع كولاجيناز عبر الشريان الكلوي (أ-ز) وتعليق الخلية الناتجة يتم غسلها وأما cryopreserved أو وضع في الثقافة (ح-ك). بعد إلى الخلايا كونفلوينسي (L)، أداء NG2 تخصيب خلية (M). الخلايا هي تريبسينيزيد عندما يكونون في متموجة، أما توقفت عن آخذة في التكاثر أو عند ظهور هياكل ثلاثية الأبعاد (N-P). معايير الإفراج عن كبسكس بالعقم وعلامة التعبير والقدرة على تعزيز الظهارية أنبوبي التئام الجروح (Q). السهم: شريان كلوي. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: كبسكس "توصيف للبشرية". ) كبسكس خلايا ملتصقة على شكل عمود الدوران، والبلاستيك. كبسكس ب) إيجابية بالنسبة لعلامات mesenchymal CD73، CD90، CD105، وعلامات ارتشاح NG2، بدجفر-β و CD146، بينما السلبية CD31 و CD34 و CD45. كبسكس التعبير عن الطبقة MHC أنا (هلا-ABC) ولكن ليس من الدرجة الثانية (هلا-د). ج) خصائص النمو من ثلاث جهات مانحة مختلفة كبسك من التدفق الخلوي وأكد متجانسة السكان إيجابية NG2 (في سن 4). كبسكس تصل إلى الشيخوخة حول مرور 9-10. كبسكس د) قادرين على تعزيز إصلاح الكلي الظهارية في مقايسة الصفر جرح. صور الممثل التحكم المتوسطة والمتوسطة كبسك مكيفة في t = 0، 4، 8 وتظهر ح 12. مقياس بار في A) = 200 مليميكرون، د) = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
ارتشاح خلايا تم عزلها من كثير من البشرية الصلبة الأجهزة المختلفة، بما في ذلك البنكرياس والدهون والغضاريف والكلى9،،من1516. ومع ذلك، معظم الأساليب، تستند إلى عينات صغيرة من الأنسجة، والتي يتم تشريح وبعدها تعامل مع إنزيمات الجهاز الهضمي. وعلاوة على ذلك، وهذا عادة ما لا يتم مع منتجات الصف السريرية. وهذا يجعل من هذه الاستراتيجيات أقل ملاءمة للترجمة السريرية المباشرة يلزم فيها كميات كبيرة من خلايا الصف السريرية.
هنا نعرض طريقة عزل رواية كبسكس البشرية للأجهزة كلها تستند إلى التروية مع الإنزيمات السريرية الصف والمواد. البروتوكول مقتبس من البروتوكول العزلة السريرية جزر لانجرهانز حاليا في استخدام التطبيق السريري في المركز لدينا18.
هذا هو الأسلوب الصف السريرية الأولى التي يمكن أن يتحقق فيها كميات كبيرة من كبسكس. التغير في العائد خلية هو إلى حد كبير من المانحين التابعة. ومع ذلك، عندما يتم استقراء العائد الخلية نحصل حاليا من جزء صغير من تعليق خلية النفط الخام من ثلاث جهات مانحة مختلفة، من الناحية النظرية، يمكن تحقيق متوسط إنتاج 2.7 × 1012 كبسكس كل الجهات المانحة. كما ماجستير العلاج يتكون عادة من دفعات الخلية 2 مع 1-2 × 106 خلايا للكيلوجرام، الجسم الوزن4، تكفي هذه الأرقام الخلية allogenic علاج العديد من المرضى.
واحد خطوة حاسمة في إجراءات العزل هي مدة الهضم كولاجيناز. عند فترة الهضم قصيرة جداً، سوف تظل كتل كبيرة من الأنسجة، التي ستكون أصعب للثقافة. عند فترة نضح طويل جداً، يمكن ملاحظة موت الخلية زيادة. ولذلك، حالما يبدأ الكلي لتصبح لينة والسوائل أقل شفافية، الكلي ينبغي أن يكون تدليك بلطف ومعاملة كولاجيناز يجب أن تتوقف.
خطوة حاسمة أخرى هي ثقافة الخلايا بعد تخصيب خلية في NG2. في بعض الأحيان بعد تخصيب خلية في NG2، لا تبدأ ارتشاح الخلايا تتكاثر أو تبدأ في النمو في هياكل ثلاثية الأبعاد. عندما تريبسينيزيد الخلايا وريسيديد، في هذه الحالة، سوف عادة ما تبدأ الخلايا تنمو في ثقافة أحادي الطبقة.
واستخدمت كبداية المواد، زرع الأعضاء البشرية الصف الكلي تجاهل أساسا لأسباب جراحية. هذه هي الأجهزة الفنية دون التليف الرئيسية. أننا نعترف بأن هذا قد يكون قيداً كهذا نادر نسبيا، ومن الصعب الحصول على مصدر الجهاز. اكسبلانتيد الكلي قد يكون مصدر آخر؛ بيد اعتماداً على السبب اكسبلانتيشن الكلي، هذه الكلي قد تحتوي على أكثر من التليف وميوفيبروبلاستس وهكذا، ولذلك ينبغي الحرص منذ ميوفيبروبلاستس قد تكون معزولة ومثقف بدلاً من ارتشاح الخلايا.
كما معزولة كبسكس مع هذا المعرض بروتوكول خصائص organo تيبيك مع الكلي الظهارية الجرح الشفاء قدرات15، العلاج بالخلايا مع كبسكس في أمراض الكلي وزرع الأعضاء سيكون تطبيق مستقبل مثيرة لاهتمام. ولهذا الغرض، هناك عدة استراتيجيات لتسليم المنتج/خلية. الاستراتيجية الأولى ضخ الرابع من كبسكس، كما تستخدم حاليا في الدراسات السريرية بممسك. تطبيق آخر للاهتمام هو استخدام كبسكس أو عوامل كبسك تفرز في نضح الجهاز قبل الزرع. بهذه الطريقة، يمكن تحسين نوعية الكلي اكسبلانتيد مما قد يؤدي إلى وظيفة الكلي تحسن بعد زرع الأعضاء. لكلتا الاستراتيجيتين، كبسكس، مصدر خلية جديدة مثيرة لاهتمام لمواصلة استكشاف للأغراض السريرية.
Disclosures
D.G.L.، M.A.E.، و T.J.R. المرتبطة بتطبيق براءات الاختراع فيما يتعلق بهذا البحث. ليس لها علاقة بالكشف عن المؤلفين الآخرين.
Acknowledgments
هذا البحث تلقت تمويلاً من "الاتحاد الأوروبي البرنامج الإطاري السابع" (FP7-2007-2013) في إطار المنحة رقم اتفاقية 305436 ممتاز.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baxter bags | Fenwal | R4R-7004 | |
| Human platelets | Sanquin | hospital surplus material expired for less than 2 d is used | |
| platelet lysate | custom made | ||
| Disposable sterile bottles | Corning | 09-761-11 | |
| 500 mL PP centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| a-MEM medium | Lonza | BE12-169F | |
| glutamax | thermo fisher | 35050038 | |
| pen/strep | Invitrogen | 15070063 | |
| transfusion system | Codan | 455609 | |
| DMEM-F12 | life technologies | 11320-074 | |
| Normal Human Serum (NHS) | Sanquin | ||
| Hepes 1 M | Lonza | BE-17-737E | |
| NaHCO3 7.5% | Lonza | BE17-613E | |
| CaCl2 1 M | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| UW | Bridge to life | 32911 | |
| Heparin | Leo Pharma | ||
| collagenase NB1 GMP grade | SERVA | 17455.03 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ml | |
| surgical drapes | 3M Nederland | DH999969404 | |
| perfusion pump | metrohm | x007528300 | |
| pump head | metrohm | x077202600 | |
| perfusion tray | custom made | ||
| LS25 masterflex tubes | Masterflex | HV-96410-25 | |
| accessory spike | Gambro DASCO | 6038020 | |
| pulmozyme | Roche | ||
| culture flasks 25 cm2 | greiner | 690175 | |
| culture flask 75 cm2 | greiner | 658170 | |
| culture flask 175 cm2 | greiner | 661160 | |
| Trypsin | sigma | t4174 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500g | |
| FcR blocking reagent | miltenyi | 130-059-901 | |
| anti melanoma beads (NG2) | miltenyi | 130-090-452 | |
| cell strainer 70 µm | Corning | 352350 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS magnet | miltenyi | 130-090-976 | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | |
| CD45 APC | BD | 555485 | |
| CD146 PE | BD | 550315 | |
| NG2 APC | R&D | FAB2585A | |
| CD90 PE | BD | 555596 | |
| HLA ABC APC | BD | 555555 | |
| CD105 FITC | Ancell | 326-040 | |
| HLA DR APC | BD | 559866 | |
| CD56 PE | BD | 555516 | |
| CD73 PE | BD | 550257 | |
| CD31 FITC | BD | 555445 | |
| CD133 PE | miltenyi | 130-090-853 | |
| PDGF-r | R&D | mab 1263 | |
| mouse IgG1 FITC | BD | 345815 | |
| mouse IgG1 PE | BD | 345816 | |
| mouse IgG1 APC | BD | 345818 | |
| IgG2b PE | BD | 555743 | |
| goat anti mouse PE | Dako | R0480 | |
| sodium azide | Merck | 822335 | |
| DMEM Ham’s F12 | Gibco | 31331-028 | |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Sigma | I1884 | |
| hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
| triiodothyrinine | Sigma | T5516 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | sigma | E9644 | |
| Immortalized human renal PTEC (HK2) | courtesey of M. Ryan, university college Dublin |
References
- Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp Hematol. 2 (2), 83-92 (1974).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Leuning, D. G., Reinders, M. E., de Fijter, J. W., Rabelink, T. J. Clinical translation of multipotent mesenchymal stromal cells in transplantation. Semin Nephrol. 34 (4), 351-364 (2014).
- Reinders, M. E., et al. Autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cells for the treatment of allograft rejection after renal transplantation: results of a phase I study. Stem Cells Transl Med. 2 (2), 107-111 (2013).
- Perico, N., et al. Autologous mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: a pilot study of safety and clinical feasibility. Clin J Am Soc Nephrol. 6 (2), 412-422 (2011).
- Perico, N., et al. Mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: pretransplant infusion protects from graft dysfunction while fostering immunoregulation. Transpl Int. 26 (9), 867-878 (2013).
- Tan, J., et al. Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial. JAMA. 307 (11), 1169-1177 (2012).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Sacchetti, B., et al. No Identical "Mesenchymal Stem Cells" at Different Times and Sites: Human Committed Progenitors of Distinct Origin and Differentiation Potential Are Incorporated as Adventitial Cells in Microvessels. Stem Cell Reports. 6 (6), 897-913 (2016).
- Chen, W. C., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).
- Dekel, B., et al. Isolation and characterization of nontubular sca-1+lin- multipotent stem/progenitor cells from adult mouse kidney. J Am Soc Nephrol. 17 (12), 3300-3314 (2006).
- Li, J., et al. Collecting duct-derived cells display mesenchymal stem cell properties and retain selective in vitro and in vivo epithelial capacity. J Am Soc Nephrol. 26 (1), 81-94 (2015).
- Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Res. 8 (1), 58-73 (2012).
- Leuning, D. G., et al. Clinical-Grade Isolated Human Kidney Perivascular Stromal Cells as an Organotypic Cell Source for Kidney Regenerative Medicine. Stem Cells Transl Med. , (2016).
- Bruno, S., et al. Isolation and characterization of resident mesenchymal stem cells in human glomeruli. Stem Cells Dev. 18 (6), 867-880 (2009).
- Ryan, M. J., et al. HK-2: an immortalized proximal tubule epithelial cell line from normal adult human kidney. Kidney Int. 45 (1), 48-57 (1994).
- Nijhoff, M. F., et al. Glycemic Stability Through Islet-After-Kidney Transplantation Using an Alemtuzumab-Based Induction Regimen and Long-Term Triple-Maintenance Immunosuppression. Am J Transplant. , (2015).
