Summary
Aqui nós apresentamos um método de isolamento e cultura de romance grau clínico para rim perivasculares células do estroma (kPSCs) com base na perfusão de órgão inteiro com enzimas digestivas e enriquecimento de NG2-célula. Com este método, é possível adquirir o número suficiente de células para terapia celular.
Abstract
Células estromais mesenquimais (MSCs) são tecidos homeostático e imune moduladora células que têm demonstrado efeitos benéficos em transplante e doenças renais. Células do estroma perivascular (EPS) compartilham características com medula óssea MSCs (bmMSCs). No entanto, eles também possuem, provavelmente devido a impressão local, propriedades de tecido-específica e desempenhar um papel na homeostase do tecido local. Essa especificidade de tecido pode resultar em reparação de tecidos específicos, também dentro do rim humano. Mostramos anteriormente que PSCs rim humano (kPSCs) têm melhorado o ferimento epitelial renal, Considerando que bmMSCs não tem esse potencial de cura. Além disso, kPSCs amenizar de lesão renal em vivo. Portanto, kPSCs constituem uma fonte interessante para terapia celular, especialmente para doenças renais e transplante renal. Aqui nós mostramos o método de isolamento e cultura detalhado para kPSCs de transplante-grau rins humanos com base na perfusão de todo órgão de enzimas digestivas, através da artéria renal e enriquecimento para o marcador perivascular NG2. Desta forma, as quantidades de células grandes podem ser obtidas que são apropriados para terapia celular.
Introduction
Células estromais mesenquimais (MSCs) são células do sistema imunológico moduladora que foram originalmente isoladas a partir da medula óssea. Eles são caracterizados por seu eixo em forma de morfologia, capacidade de se diferenciarem em gordura, osso e cartilagem e aderência de plástico. MSCs expressam os marcadores do estroma CD73, CD90, CD105 sendo negativo para os marcadores CD31 e CD451,2,3. MSCs são um candidato promissor para terapia celular, devido ao seu tecido homeostático e capacidades de imunomoduladores. bmMSCs, atualmente, estão sendo estudados em ensaios clínicos para várias doenças, incluindo doenças renais e transplante de rim, como comentado em outro lugar4.
Anteriormente foi mostrado que perivasculares células de vários órgãos sólidos diferentes, incluindo o tecido adiposo, placenta e músculo esquelético compartilham características com MSCs9. No entanto, estas células também apresentam funções específicas do tecido, que podem resultar em reparação de organotypic10. Células humanas perivascular miocárdica, por exemplo, estimularam angiogênico respostas após hipóxia e diferenciados em cardiomyocytes, enquanto perivascular de células isoladas de outros tecidos não mostrou esses potenciais11.
Perivascular de células do estroma também podem ser isoladas do rato12,13,14 e15,de rim humano16. Nós extensivamente caracterizada kPSCs e comparei estas para bmMSCs. Descobrimos que kPSCs, semelhantes ao bmMSCs, têm capacidades de imunossupressores e pode apoiar a formação do plexo vascular. Entretanto, há tecido específicas diferenças entre os tipos de célula, como kPSCs mostrou uma assinatura de expressão transcricional de organotypic, incluindo os fatores de transcrição nefrogênico, HoxD10 e HoxD11. kPSCs, em contraste com o bmMSCs, não sofrem transformação Miofibroblasto após estimulação com TGF-β e não foram capazes de se diferenciar em adipócitos. Além disso, o kPSCs acelerado integridade epitelial em um ensaio zero ferimento epitelial tubular renal, um fenômeno que não foi observado com bmMSCs. Esta ferida reforçada reparação foi mediada através da liberação de fator de crescimento do hepatócito. Além disso, kPSCs amenizada lesão renal em um modelo do rato do15. lesão renal aguda. Portanto, kPSCs parecem ter capacidades de reparação renal superior e são uma interessante fonte nova para a terapia celular em doenças renais.
A fim de ser capaz de usar kPSCs para fins de terapia celular, kPSCs deve ser isolado de forma clínica grau com grau clínico enzimas e protocolos. Além disso, para ser capaz de tratar vários pacientes com kPSCs de 1 doador, número suficiente de células deve ser obtido. Aqui nós mostramos em detalhes, o procedimento de isolamento clínico da classe de kPSCs de rins de transplante de todo ano, produzindo um número suficiente de células a ser usado para terapia celular clínica.
Representative Results
O método de isolamento de kPSCs de grau clínico está resumido na Figura 1. Células de rim bruto são isoladas humano transplante de rins de grau por perfusão de colagenase. A suspensão resultante é cultivada até confluente em 5% plaquetas lisados. Em seguida, a fração de células estromais perivascular é isolada com base na expressão de NG2.
kPSCs são plásticas aderentes células fusiformes(Figura 2)e são positivos para os marcadores de marcadores do estroma CD73, CD90, CD105 e perivascular NG2, PDGFR-B e CD146, enquanto negativo para CD31 e CD34, CD45, HLA-DR (Figura 2B). Normalmente, uma população homogénea de kPSCs pode ser alcangada na passagem 4 e kPSCs chegar a senescência em torno de passagem 9-10 (Figura 2C). Portanto, aconselhamos a realizar experimentos entre passagem 5-8.
Para avaliar a capacidade funcional da kPSCs isolada, realizamos um em vitro rim epiteliais ferido zero ensaio sobre cada novo lote de kPSCs, como mostramos anteriormente que o meio condicionado de kPSCs pode acelerar epiteliais cicatrização neste ensaio zero15. O meio condicionado kPSC feito pelo cultivo kPSCs por 48 h em alphaMEM 5% plaquetas lysates e recolher o sobrenadante. Em seguida, o rim humano imortalizado túbulo proximal células epiteliais (HK-2)17 são cultivadas até confluente e então feita uma ferida zero. Então ou o meio condicionado de médio kPSCs ou controle é adicionado aos poços e mede-se a velocidade de cicatrização de feridas. Quando o meio condicionado de kPSCs é adicionado, a ferida fecha significativamente mais rápido (Figura 2D).
Figura 1 : Clínica grau isolamento método de humano kPSCs. Transplante de rins de grau são canulados e pintados com colagenase através da artéria renal (A - G) e a suspensão de células resultante é lavada e também criopreservadas ou colocado em cultura (H - K). Depois que as células alcançar confluência (L), NG2 célula enriquecimento é executada (M). As células são trypsinized quando eles também são confluentes, pararam de se proliferando ou quando estruturas 3D aparecem (N - P). Os critérios de liberação de kPSCs são a esterilidade, expressão do marcador e a capacidade de melhorar a cicatrização da ferida epitelial tubular (Q). Seta: artéria renal. Barra de escala = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: kPSCs caracterização de humano. Um) kPSCs são células aderentes fusiformes, plásticas. B) kPSCs são positivos para marcadores mesenquimais CD73, CD90, CD105, perivascular marcadores NG2, PDGFR-β e CD146, enquanto negativo para CD31 e CD34 CD45. kPSCs expressar o MHC-classe eu (HLA-ABC), mas não a classe II (HLA-DR). C) características de crescimento de três diferentes kPSC doadores de citometria de fluxo confirmaram homogênea NG2 populações positivas (na passagem 4). kPSCs chegar a senescência em torno de 9-10 de passagem. D) kPSCs são capazes de aumentar a reparação epitelial de rim em um ensaio de risco de ferimento. Imagens representativas de controle médio e médio kPSC condicionado em t = 0, 4, 8 e 12 h são mostrados. Barra de escala na) = 200 µm, em D) = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Perivasculares células têm sido isoladas de muitos diferentes sólidos órgãos, incluindo o rim9,15,16, cartilagem, gordura e pâncreas humanos. A maioria dos métodos, no entanto, são baseados em pequenas amostras de tecido, que são dissecados e posteriormente tratadas com enzimas digestivas. Além disso, isso geralmente não é executado com produtos grau clínico. Isto faz estas estratégias menos adequados para tradução clínica direta onde grandes quantidades de células de grau clínico são necessárias.
Aqui nós mostramos um método de isolamento de novela de kPSCs humana para órgãos inteiros, com base na perfusão com grau clínico enzimas e materiais. O protocolo é uma adaptação do protocolo de isolamento clínico ilhotas de Langerhans atualmente em uso para aplicação clínica em nosso centro de18.
Este é o primeiro método de grau clínico onde grandes quantidades de kPSCs podem ser alcançadas. A variabilidade no rendimento de célula é largamente dependente de doador. No entanto, quando o rendimento de célula que atualmente obtemos de uma fração da suspensão celular bruto de três diferentes doadores é extrapolado, em teoria, poderia ser alcançado um rendimento médio de 2,7 x 1012 kPSCs por doador. Como terapia MSC normalmente consiste de 2 infusões de célula com 1-2 x 106 células/kg corpo peso4, esses números de celular são suficientes para tratamento alogênico de vários pacientes.
Um passo crítico no processo de isolamento é a duração da digestão de colagenase. Quando o período de digestão é muito curto, grandes aglomerações de tecido continuará a ser, que será mais difícil para a cultura. Quando o período de perfusão é muito longo, pode ser observada morte celular aumentada. Portanto, quando o rim começa a se tornar macio e os fluidos menos transparentes, o rim deve ser massageado suavemente e o tratamento de colagenase deve ser interrompido.
Outro passo crítico é a cultura das células após enriquecimento de célula NG2. Às vezes após o enriquecimento de célula NG2, as células de perivascular não começam a proliferar, ou começar a crescer em estruturas 3D. Neste caso, quando as células são trypsinized e propagado novamente, as células geralmente vão começar a crescer na cultura de monocamada.
Como material de partida, rins de grau de transplante humano descartados principalmente por razões cirúrgicos foram usados. Estes são órgãos funcionais sem fibrose principal. Reconhecemos que essa poderia ser uma limitação, pois esta é uma doença relativamente rara e difícil de obter a fonte do órgão. Rins explantados podem ser outra fonte; no entanto, dependendo a razão da explantação rim, estes rins podem conter mais fibrose e, portanto, miofibroblastos e, portanto, os cuidados devem ser tomados desde myofibroblasts podem ser isoladas e cultivadas em vez de células perivasculares.
Como o kPSCs isolado com esse show de protocolo Propriedades organo-quar com rim epitelial ferida cura capacidades15, terapia celular, com kPSCs em doenças renais e transplante seria uma interessante aplicação futura. Para este efeito, existem várias estratégias de entrega de produtos de célula/célula. A primeira estratégia é a infusão IV de kPSCs, como usado atualmente nos estudos clínicos bmMSC. Outra aplicação interessante é o uso de kPSCs ou fatores kPSC-excretado na perfusão da máquina antes do transplante. Desta forma, a qualidade do rim explantado pode melhorar o que pode levar a função renal melhorou após transplante. Para ambas as estratégias, kPSCs são uma interessante fonte de novas células para explorar para fins clínicos.
Disclosures
D.G.L., M.A.E, e T.J.R. estão associados com um pedido de patente em relação esta pesquisa. Os outros autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Esta pesquisa recebeu financiamento do sétimo programa-quadro da Comunidade Europeia (FP7/2007-2013) sob o número 305436 do contrato de concessão estelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baxter bags | Fenwal | R4R-7004 | |
| Human platelets | Sanquin | hospital surplus material expired for less than 2 d is used | |
| platelet lysate | custom made | ||
| Disposable sterile bottles | Corning | 09-761-11 | |
| 500 mL PP centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| a-MEM medium | Lonza | BE12-169F | |
| glutamax | thermo fisher | 35050038 | |
| pen/strep | Invitrogen | 15070063 | |
| transfusion system | Codan | 455609 | |
| DMEM-F12 | life technologies | 11320-074 | |
| Normal Human Serum (NHS) | Sanquin | ||
| Hepes 1 M | Lonza | BE-17-737E | |
| NaHCO3 7.5% | Lonza | BE17-613E | |
| CaCl2 1 M | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| UW | Bridge to life | 32911 | |
| Heparin | Leo Pharma | ||
| collagenase NB1 GMP grade | SERVA | 17455.03 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ml | |
| surgical drapes | 3M Nederland | DH999969404 | |
| perfusion pump | metrohm | x007528300 | |
| pump head | metrohm | x077202600 | |
| perfusion tray | custom made | ||
| LS25 masterflex tubes | Masterflex | HV-96410-25 | |
| accessory spike | Gambro DASCO | 6038020 | |
| pulmozyme | Roche | ||
| culture flasks 25 cm2 | greiner | 690175 | |
| culture flask 75 cm2 | greiner | 658170 | |
| culture flask 175 cm2 | greiner | 661160 | |
| Trypsin | sigma | t4174 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500g | |
| FcR blocking reagent | miltenyi | 130-059-901 | |
| anti melanoma beads (NG2) | miltenyi | 130-090-452 | |
| cell strainer 70 µm | Corning | 352350 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS magnet | miltenyi | 130-090-976 | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | |
| CD45 APC | BD | 555485 | |
| CD146 PE | BD | 550315 | |
| NG2 APC | R&D | FAB2585A | |
| CD90 PE | BD | 555596 | |
| HLA ABC APC | BD | 555555 | |
| CD105 FITC | Ancell | 326-040 | |
| HLA DR APC | BD | 559866 | |
| CD56 PE | BD | 555516 | |
| CD73 PE | BD | 550257 | |
| CD31 FITC | BD | 555445 | |
| CD133 PE | miltenyi | 130-090-853 | |
| PDGF-r | R&D | mab 1263 | |
| mouse IgG1 FITC | BD | 345815 | |
| mouse IgG1 PE | BD | 345816 | |
| mouse IgG1 APC | BD | 345818 | |
| IgG2b PE | BD | 555743 | |
| goat anti mouse PE | Dako | R0480 | |
| sodium azide | Merck | 822335 | |
| DMEM Ham’s F12 | Gibco | 31331-028 | |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Sigma | I1884 | |
| hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
| triiodothyrinine | Sigma | T5516 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | sigma | E9644 | |
| Immortalized human renal PTEC (HK2) | courtesey of M. Ryan, university college Dublin |
References
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