Summary
Här presenterar vi en roman kliniska grade isolering och kultur metod för njure perivaskulär stromaceller (kPSCs) baserat på hela orgel perfusion med matsmältningsenzymer och NG2-cell anrikning. Med denna metod är det möjligt att förvärva tillräcklig cell nummer för cellterapi.
Abstract
Mesenkymala stromaceller (MSCs) är vävnad homeostatiska och immun immunmodulerande celler som har visat positiva effekter i njursjukdomar och transplantation. Perivaskulär stromaceller (PSC) dela egenskaper med benmärg MSCs (bmMSCs). Dock äger de också, troligen på grund av lokala imprinting, vävnad-specifika egenskaper och spela en roll i lokal vävnadsreaktion homeostas. Detta vävnadsspecificitet kan resultera i vävnad specifika reparation, också inom den mänskliga njuren. Vi har tidigare visat att mänskliga njurar PSC (kPSCs) har förbättrat njure epitelial sårläkning medan bmMSCs inte hade denna potential. Dessutom kan kPSCs lindra njure skada i vivo. KPSCs utgör således en intressant källa för cellterapi, särskilt för njursjukdomar och njurtransplantation. Här visar vi den detaljerade isolering och kultur metoden för kPSCs från transplantation-grade mänskliga njurar baserat på hela-orgel genomblödning av matsmältningsenzymer via Njurartären och berikande för perivaskulär markören NG2. På detta sätt, kan det erhållas stora cell mängder som är lämpliga för cellterapi.
Introduction
Mesenkymala stromaceller (MSCs) är immunmodulerande immunceller som isolerades ursprungligen från benmärgen. De kännetecknas av sin spindel som formade morfologi, förmåga att differentieras till fett och brosk, ben och plast följsamhet. MSCs express stromal markörerna CD73, CD90, CD105 samtidigt vara negativa för markörer CD31 och CD451,2,3. MSCs är en lovande kandidat för cellterapi på grund av sin vävnad homeostatiska och immunmodulerande kapacitet. bmMSCs studeras för närvarande i kliniska prövningar för flera sjukdomar, inklusive njursjukdomar och njurtransplantation som granskat någon annanstans4.
Tidigare visades att perivaskulär celler från flera olika solida organ, inklusive fettvävnad, moderkakan och skelettmuskel delar egenskaper med MSCs9. Dock uppvisar dessa celler också vävnadsspecifika funktioner vilket kan resultera i organotypic reparation10. Mänskliga hjärtinfarkt perivaskulär celler, till exempel stimuleras angiogena Svaren efter hypoxi och differentieras efter hjärtmuskelceller, medan perivaskulär celler isolerade från andra vävnader inte visade dessa potentialer11.
Perivaskulär stromaceller kan också isoleras från mus12,13,14 och mänskliga njurar15,16. Vi i stor utsträckning kännetecknas kPSCs och jämförde dessa till bmMSCs. Vi hittade att kPSCs, liknar bmMSCs, har immunhämmande kapacitet och kan stödja vaskulär plexus bildning. Men finns det vävnad specifika skillnader mellan celltyper, som kPSCs visade en organotypic transkriptionell uttryck signatur, inklusive de nefrogen transkriptionsfaktorerna HoxD10 och HoxD11. kPSCs, i motsats till bmMSCs, genomgå inte myofibroblast omvandling efter stimulering med TGF-β och kunde inte differentieras till adipocyter. Dessutom accelererade kPSCs epitelial integritet i en njure tubulär epitelial sår scratch test, ett fenomen som inte observerats med bmMSCs. Detta förbättrade sår reparation var medierad via hepatocyte tillväxtfaktor release. Dessutom förbättras kPSCs njurskada i en musmodell av akut njure skada15. Därför kPSCs verkar ha överlägsen nedsatt reparation kapacitet och är en intressant ny källa för cellterapi i njursjukdomar.
För att kunna använda kPSCs för cell terapi ändamål, ska kPSCs isoleras på en klinisk grade sätt med kliniska grade enzymer och protokoll. Dessutom för att kunna behandla flera patienter med kPSCs från 1 donator, bör tillräcklig cell nummer erhållas. Här visar vi i detalj, kliniska grade isolering tillvägagångssättet av kPSCs från hela transplantation grad njurarna, vilket ger tillräckligt antal celler som ska användas för kliniska cellterapi.
Representative Results
Metoden kliniska grade kPSCs isolering sammanfattas i figur 1. Råolja njurceller isoleras från mänskliga transplantation grad njurarna av kollagenas perfusion. Resulterande cellsuspensionen är odlade tills konfluenta i 5% trombocytantal lysates. Då är andelen perivaskulär stromal cell isolerade baserat på NG2 uttryck.
kPSCs är plast vidhäftande spolformad celler (figur 2A) och är positiva för stromal markörer CD73, CD90, CD105 och perivaskulär markörerna NG2, PDGFR-B och CD146, medan negativa för CD31, CD34, CD45 och HLA-DR (figur 2B). Vanligtvis en homogen population av kPSCs kan nås på passage 4 och kPSCs nå åldras runt passagen 9-10 (figur 2C). Vi rekommenderar därför för att utföra experiment mellan passage 5-8.
Utvärdera den funktionella kapaciteten hos den isolerade kPSCs, utför vi ett in vitro- njure epitelial sår scratch test på varje ny omgång kPSCs, som vi tidigare visade att luftkonditionerade medlet av kPSCs kan påskynda epitelial sårläkning i denna scratch test15. KPSC luftkonditionerade medium görs genom odling kPSCs för 48 h i alphaMEM 5% trombocytantal lysates och samla in supernatanten. Nästa, de förevigade mänskliga njurar proximala tubuli epitelceller (HK-2)17 odlas tills konfluenta och sedan ett skrap sår görs. Sedan antingen luftkonditionerade medlet av kPSCs eller kontroll medium läggs till brunnarna och hastigheten på sårläkning mäts. När luftkonditionerade medlet av kPSCs läggs, stänger såret betydligt snabbare (figur 2D).
Figur 1 : Kliniska Grade isolering metod för mänskliga kPSCs. Transplantation grad njurar är kanylerade och perfusion med kollagenas via renal artären (A - G) och den resulterande cellsuspensionen tvättas och antingen fryst tillstånd eller sätta i kultur (H - K). När cellerna når konfluens (L), utförs NG2 cell anrikning är (M). Celler är trypsinized när de antingen är konfluenta, har slutat frodas eller när 3D-strukturer visas (N - P). Release kriterierna för kPSCs är sterilitet, markör uttryck och förmågan att förbättra tubulär epitelial sårläkning (Q). Pil: Njurartären. Skalstapeln = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: karakterisering av mänskliga kPSCs. En) kPSCs är spolformad, plast vidhäftande celler. B) kPSCs är positiva för mesenkymala markörer CD73, CD90, CD105, perivaskulär markörer NG2, PDGFR-β och CD146, medan negativa för CD31, CD34 och CD45. kPSCs express MHC-klass I (HLA-ABC) men inte klass II (HLA-DR). C) tillväxt kännetecken för tre olika kPSC givare från flödescytometri bekräftade homogen NG2 positiva populationer (på passage 4). kPSCs nå åldras runt passagen 9-10. D) kPSCs kan förbättra njure epitelial reparation i ett sår scratch test. Representativa bilder av kontroll medium och kPSC luftkonditionerade medium vid t = 0, 4, 8 och 12 h visas. Skalstapeln i A) = 200 µm, i D) = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Discussion
Perivaskulär celler har isolerats från många olika mänskliga solid organ, inklusive de njure9,15,16, bukspottkörteln, fett och brosk. De flesta metoder, bygger dock på små prover av vävnad, som är dissekeras och därefter behandlas med matsmältningsenzymer. Dessutom är detta vanligtvis inte utförs med kliniska grade produkter. Detta gör dessa strategier mindre lämplig för direkt klinisk översättning där stora mängder kliniska-grade celler behövs.
Här visar vi en roman isolering metod för mänskliga kPSCs av hela organ baserat på perfusion med kliniska grade enzymer och material. Protokollet är anpassade från det kliniska Langerhanska isolering nu protokollet för klinisk tillämpning i vårt center18.
Detta är den första kliniska grade metoden där stora mängder kPSCs kan uppnås. Variabiliteten i cell kapacitet är till stor del givare beroende. Dock när den cell avkastningen vi för närvarande erhåller från en bråkdel av den rå cellsuspensionen av tre olika givare är extrapoleras, i teorin, skulle en genomsnittsavkastning av 2.7 x 1012 kPSCs per givare kunna uppnås. Som MSC behandling består oftast av 2 cell infusioner med 1-2 x 106 celler/kg kropp vikt4, är dessa cell nummer tillräckliga för prövningar behandling av flera patienter.
Ett kritiskt steg i förfarandet för isolering är varaktigheten av kollagenas matsmältningen. När matsmältningen perioden är för kort, förblir stora klumpar av vävnad, som kommer att vara svårare att kultur. När perfusion är alltför lång, observeras ökad celldöd. Därför så snart som njurarna börjar bli mjuk och de mindre genomskinliga vätskorna, njuren ska masseras försiktigt och kollagenas behandlingen bör avbrytas.
Ett annat viktigt steg är en kultur av cellerna efter NG2 cell anrikning. Ibland efter NG2 cell berikning börjar perivaskulär cellerna inte föröka eller börjar växa i 3D-strukturer. I det här fallet när cellerna är trypsinized och sådd, kommer cellerna vanligtvis börjar växa i enskiktslager kultur.
Som utgångsmaterial, användes mänskliga transplantation grad njurarna kasseras huvudsakligen för kirurgiska skäl. Dessa är funktionella organ utan större fibros. Vi erkänner att detta kan vara en begränsning eftersom detta är en relativt sällsynt och svårt att få orgel källa. Explanterad njurar kan vara en annan källa; men beroende på resonera av njure explantation, dessa njurarna kan innehålla mer fibros och därmed myofibroblaster och därför bör försiktighet eftersom myofibroblaster kan vara isolerade och odlade i stället för perivaskulär celler.
Som kPSCs isolerad med detta protokoll show organo-typis boenden med njure epitelial sår läkande kapacitet15, cellterapi med kPSCs i njursjukdomar och transplantation skulle vara en intressant framtida tillämpning. För detta ändamål finns det flera strategier för cell deponicell produktleverans. Den första strategin är IV infusion av kPSCs, som används för närvarande i bmMSC kliniska studier. Ett annat intressant program är att använda kPSCs eller kPSC-utsöndras faktorer i maskinen perfusion före transplantation. På detta sätt, kan kvaliteten på explanterad njuren förbättra vilket kan leda till förbättrad njurfunktion efter transplantation. För båda strategierna är kPSCs en intressant ny cell källa att ytterligare utforska för kliniska ändamål.
Disclosures
D.G.L., M.A.E., och T.J.R. är associerade med en patentansökan avseende denna forskning. De andra författarna inte har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning har beviljats medel från Europeiska gemenskapens sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) under lån avtalsnummer 305436 STELLAR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baxter bags | Fenwal | R4R-7004 | |
| Human platelets | Sanquin | hospital surplus material expired for less than 2 d is used | |
| platelet lysate | custom made | ||
| Disposable sterile bottles | Corning | 09-761-11 | |
| 500 mL PP centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| a-MEM medium | Lonza | BE12-169F | |
| glutamax | thermo fisher | 35050038 | |
| pen/strep | Invitrogen | 15070063 | |
| transfusion system | Codan | 455609 | |
| DMEM-F12 | life technologies | 11320-074 | |
| Normal Human Serum (NHS) | Sanquin | ||
| Hepes 1 M | Lonza | BE-17-737E | |
| NaHCO3 7.5% | Lonza | BE17-613E | |
| CaCl2 1 M | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| UW | Bridge to life | 32911 | |
| Heparin | Leo Pharma | ||
| collagenase NB1 GMP grade | SERVA | 17455.03 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ml | |
| surgical drapes | 3M Nederland | DH999969404 | |
| perfusion pump | metrohm | x007528300 | |
| pump head | metrohm | x077202600 | |
| perfusion tray | custom made | ||
| LS25 masterflex tubes | Masterflex | HV-96410-25 | |
| accessory spike | Gambro DASCO | 6038020 | |
| pulmozyme | Roche | ||
| culture flasks 25 cm2 | greiner | 690175 | |
| culture flask 75 cm2 | greiner | 658170 | |
| culture flask 175 cm2 | greiner | 661160 | |
| Trypsin | sigma | t4174 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500g | |
| FcR blocking reagent | miltenyi | 130-059-901 | |
| anti melanoma beads (NG2) | miltenyi | 130-090-452 | |
| cell strainer 70 µm | Corning | 352350 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS magnet | miltenyi | 130-090-976 | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | |
| CD45 APC | BD | 555485 | |
| CD146 PE | BD | 550315 | |
| NG2 APC | R&D | FAB2585A | |
| CD90 PE | BD | 555596 | |
| HLA ABC APC | BD | 555555 | |
| CD105 FITC | Ancell | 326-040 | |
| HLA DR APC | BD | 559866 | |
| CD56 PE | BD | 555516 | |
| CD73 PE | BD | 550257 | |
| CD31 FITC | BD | 555445 | |
| CD133 PE | miltenyi | 130-090-853 | |
| PDGF-r | R&D | mab 1263 | |
| mouse IgG1 FITC | BD | 345815 | |
| mouse IgG1 PE | BD | 345816 | |
| mouse IgG1 APC | BD | 345818 | |
| IgG2b PE | BD | 555743 | |
| goat anti mouse PE | Dako | R0480 | |
| sodium azide | Merck | 822335 | |
| DMEM Ham’s F12 | Gibco | 31331-028 | |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Sigma | I1884 | |
| hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
| triiodothyrinine | Sigma | T5516 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | sigma | E9644 | |
| Immortalized human renal PTEC (HK2) | courtesey of M. Ryan, university college Dublin |
References
- Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp Hematol. 2 (2), 83-92 (1974).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Leuning, D. G., Reinders, M. E., de Fijter, J. W., Rabelink, T. J. Clinical translation of multipotent mesenchymal stromal cells in transplantation. Semin Nephrol. 34 (4), 351-364 (2014).
- Reinders, M. E., et al. Autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cells for the treatment of allograft rejection after renal transplantation: results of a phase I study. Stem Cells Transl Med. 2 (2), 107-111 (2013).
- Perico, N., et al. Autologous mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: a pilot study of safety and clinical feasibility. Clin J Am Soc Nephrol. 6 (2), 412-422 (2011).
- Perico, N., et al. Mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: pretransplant infusion protects from graft dysfunction while fostering immunoregulation. Transpl Int. 26 (9), 867-878 (2013).
- Tan, J., et al. Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial. JAMA. 307 (11), 1169-1177 (2012).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Sacchetti, B., et al. No Identical "Mesenchymal Stem Cells" at Different Times and Sites: Human Committed Progenitors of Distinct Origin and Differentiation Potential Are Incorporated as Adventitial Cells in Microvessels. Stem Cell Reports. 6 (6), 897-913 (2016).
- Chen, W. C., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).
- Dekel, B., et al. Isolation and characterization of nontubular sca-1+lin- multipotent stem/progenitor cells from adult mouse kidney. J Am Soc Nephrol. 17 (12), 3300-3314 (2006).
- Li, J., et al. Collecting duct-derived cells display mesenchymal stem cell properties and retain selective in vitro and in vivo epithelial capacity. J Am Soc Nephrol. 26 (1), 81-94 (2015).
- Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Res. 8 (1), 58-73 (2012).
- Leuning, D. G., et al. Clinical-Grade Isolated Human Kidney Perivascular Stromal Cells as an Organotypic Cell Source for Kidney Regenerative Medicine. Stem Cells Transl Med. , (2016).
- Bruno, S., et al. Isolation and characterization of resident mesenchymal stem cells in human glomeruli. Stem Cells Dev. 18 (6), 867-880 (2009).
- Ryan, M. J., et al. HK-2: an immortalized proximal tubule epithelial cell line from normal adult human kidney. Kidney Int. 45 (1), 48-57 (1994).
- Nijhoff, M. F., et al. Glycemic Stability Through Islet-After-Kidney Transplantation Using an Alemtuzumab-Based Induction Regimen and Long-Term Triple-Maintenance Immunosuppression. Am J Transplant. , (2015).
