Summary
Her presenterer vi romanen klinisk klasse isolasjon og kultur metode for nyre Perivascular Stromal celler (kPSCs) basert på hele organ perfusjon fordøyelsesenzymer og NG2-celle berikelse. Med denne metoden er det mulig å skaffe tilstrekkelig cellen tallene for mobilnettet terapi.
Abstract
Mesenchymal Stromal celler (MSCs) er vev homøostatisk og immunsystemet modulatory celler som har vist gunstige effekter i nyre sykdommer og transplantasjon. Perivascular Stromal celler (PSCer) deler egenskapene med benmarg MSCs (bmMSCs). Men har de, sannsynligvis lokale preging, vev-spesifikke egenskaper og spille en rolle i lokale vev homeostase. Denne vev spesifisitet kan resultere i bestemte reparasjon av vev, også innen human nyrene. Vi viste tidligere at menneskelige nyre PSCer (kPSCs) har forbedret nyre epithelial sårheling mens bmMSCs ikke har dette potensialet. Videre kan kPSCs forbedre nyre skader i vivo. Derfor utgjør kPSCs en interessant kilde for cellen terapi, spesielt for nyre sykdommer og nyre transplantasjon. Her viser vi detaljerte isolasjon og kultur metoden for kPSCs fra transplantasjon førsteklasses menneskets nyrer basert på hele organ perfusjon fordøyelsesenzymer via nyre arterien og berikelse for perivascular merket NG2. På denne måten kan stor celle mengder fås som er egnet for mobilnettet terapi.
Introduction
Mesenchymal Stromal celler (MSCs) er modulatory immunceller som ble opprinnelig isolert fra benmargen. De er preget av sine spindel formet morfologi, evnen til å differensiere i fett, bein og brusk og plast etterlevelse. MSCs uttrykke stromal markører CD73, CD90, CD105 samtidig er negativt for markører CD31 og CD451,2,3. MSCs er en lovende kandidat for cellen terapi deres vev homøostatisk og immunmodulerende kapasiteter. bmMSCs er for tiden blir studert i kliniske studier for flere sykdommer, inkludert nyre sykdommer og nyre transplantasjon som vurderes andre steder4.
Tidligere ble det vist at perivascular celler fra flere forskjellige solide organer, inkludert fettvev, morkaken og skjelettlidelser muskel dele kjennetegn med MSCs9. Men utstillingen disse cellene også vev-spesifikke funksjoner som kan resultere i organotypic reparasjon10. Menneskelige hjerteinfarkt perivascular celler, for eksempel stimulerte angiogenic svar etter hypoksi og differensiert i cardiomyocytes, mens perivascular celler isolert fra andre vev ikke vise disse potensialene11.
Perivascular stromal celler kan også være isolert fra mus12,13,14 og menneskelige nyre15,16. Vi mye preget kPSCs og sammenlignet disse bmMSCs. Vi fant at kPSCs, ligner bmMSCs, har suppressive kapasitet og støtter vaskulære plexus formasjon. Det er imidlertid vev spesifikke forskjeller mellom celletyper, som kPSCs viste en organotypic transcriptional uttrykk signatur, inkludert de nephrogenic transkripsjonsfaktorer HoxD10 og HoxD11. kPSCs, i motsetning til bmMSCs, gjennomførte ikke myofibroblast transformasjon etter stimulering med TGF-β og var i stand til å skille ut adipocytter. Videre akselerert kPSCs epithelial integritet i en nyre rørformede epithelial såret scratch analysen, et fenomen som ikke ble observert med bmMSCs. Denne forbedrede sår reparasjon ble formidlet gjennom hepatocyte vekst faktor. Videre ameliorated kPSCs nyre skader i en musemodell av akutt nyre skader15. Derfor kPSCs synes å ha overlegen nyre reparasjon kapasiteter og er en interessant ny kilde for cellen terapi i nyre sykdommer.
For å kunne bruke kPSCs for cellen terapi, bør kPSCs bli isolert i en klinisk klasse måte med klinisk klasse enzymer og protokoller. Videre, for å kunne behandle flere pasienter med kPSCs fra 1 donor, tilstrekkelig celle tall kan skaffes. Her viser vi detaljert, klinisk klasse isolasjon prosedyren for kPSCs fra hele transplantasjon klasse nyrene, gir tilstrekkelig antall celler brukes til klinisk mobilnettet terapi.
Representative Results
Metoden klinisk klasse kPSCs isolasjon summeres i figur 1. Råolje nyreceller er isolert fra menneskelige transplantasjon klasse nyrene ved collagenase perfusjon. Resulterende celle suspensjon er kultivert til confluent i 5% Platederivert lysates. Deretter er perivascular stromal cell brøkdel isolert basert på NG2-uttrykk.
kPSCs er plast tilhenger spindel-formet celler (figur 2A) og positivt for stromal markører CD73, CD90, CD105 og perivascular markørene NG2, PDGFR-B og CD146, mens negativ for CD31, CD34, CD45 og HLA-DR (figur 2B). Vanligvis en homogen befolkning på kPSCs kan nås på passage 4 og kPSCs nå senescence rundt passasje 9-10 (figur 2C). Derfor anbefaler vi for å utføre eksperimenter mellom passasje 5-8.
For å evaluere den funksjonelle kapasiteten til den isolerte kPSCs, utfører vi i vitro nyre epithelial sår scratch analysen på hver ny gruppe med kPSCs, som vi viste tidligere at betinget medium for kPSCs kan akselerere epithelial sårheling i denne scratch analysen15. KPSC betinget mediet er laget av dyrking kPSCs 48 h i alphaMEM 5% Platederivert lysates og samle nedbryting. Neste, udødeliggjort menneskelige nyre proksimale tubule epitelceller (HK-2)17 er kultivert til confluent og en ripe såret er gjort. Så enten betinget medium kPSCs eller kontroll middels legges til brønnene og hastigheten på sårheling måles. Når betinget medium for kPSCs legges, lukker såret betydelig raskere (figur 2D).
Figur 1 : Klinisk Grade isolasjon metoden for Human kPSCs. Transplantasjon Klasse nyrer er cannulated og parfyme med collagenase via arteria nyre (A - G) og resulterende celle suspensjon vasket og enten cryopreserved eller sette inn kultur (H - K). Når cellene når confluency (L), utført NG2 celle berikelse er (M). Cellene er trypsinized når de enten er confluent, har sluttet voksende eller når 3D strukturer vises (N - P). Utgivelsen kriteriene for kPSCs er sterilitet, markør uttrykk og evne til å forbedre rørformede epithelial sårheling (Q). Pilen: nyre arterien. Skala bar = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: karakteristikk av menneskelig kPSCs. En) kPSCs er spindel-formet, plast tilhenger celler. B) kPSCs er positive for mesenchymal markører CD73, CD90, CD105, perivascular markører NG2, PDGFR-β og CD146, mens negativ for CD31, CD34 og CD45. kPSCs express MHC-klassen jeg (HLA-ABC) men ikke klasse II (HLA-DR). C) vekst kjennetegner tre forskjellige kPSC givere fra flowcytometri bekreftet homogen NG2 positive populasjoner (på passage 4). kPSCs nå senescence rundt passasje 9-10. D) kPSCs kan øke nyre epithelial reparasjon i en såret scratch analysen. Representant bilder av kontroll medium og kPSC betinget medium på t = 0, 4, 8 og 12 h vises. Skala bar i A) = 200 μm, i D) = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Perivascular celler har vært isolert fra mange ulike menneskelige solide organer, inkludert bukspyttkjertelen, fett, brusk og nyre9,15,16. De fleste metoder, men er basert på små utvalg av vev, som er dissekert og etterpå behandles med fordøyelsesenzymer. Videre, dette er vanligvis ikke utført kliniske kvalitet produkter. Dette gjør disse strategiene mindre egnet for direkte klinisk oversettelse hvor store mengder av klinisk-grade celler er nødvendig.
Her viser vi en roman isolasjon metode for menneskelig kPSCs for hele organer basert på perfusjon med klinisk klasse enzymer og materialer. Protokollen er tilpasset fra klinisk holmer Langerhans isolasjon protokollen som brukes for klinisk anvendelse i vårt senter18.
Dette er den første kliniske klasse metoden der store mengder kPSCs kan oppnås. Variasjon i cellen avkastning er hovedsakelig donor avhengige. Men når cellen avkastningen vi nå få fra en brøkdel av råolje celle suspensjon av tre ulike givere er ekstrapolert, i teorien, kan en gjennomsnittlig avkastning på 2,7 x 1012 kPSCs per giver oppnås. Som MSC terapi vanligvis består av 2 cellen infusions med 1-2 x 106 celler/kg kroppen vekt4, er disse cellen tallene tilstrekkelig for allogenic behandling av flere pasienter.
En kritisk trinn i isolasjon prosedyren er den collagenase fordøyelsen. Når fordøyelsen perioden er for kort, blir store klumper av vev, som blir vanskeligere å kultur. Når Perfusjonsperiode er for lang, kan økt celledød observeres. Derfor nyre starter å bli myk og væsker mindre gjennomsiktig, nyre bør bli massert forsiktig og collagenase behandling bør stoppes.
Et annet viktig skritt er kulturen i cellene etter NG2 celle berikelse. Noen ganger etter den NG2 cellen berikelse starter perivascular cellene ikke sprer eller starte vokse i 3D strukturer. I dette tilfellet, når cellene er trypsinized og reseeded, begynner cellene vanligvis å vokse i monolayer kultur.
Som starter materiale, ble menneskelige transplantasjon Klasse nyrer forkastet hovedsakelig for kirurgiske grunner brukt. Dette er funksjonell organer uten store fibrose. Vi erkjenner at dette kan være en begrensning som dette er en relativt sjelden og vanskelig å få orgel kilde. Explanted nyrer kan være en annen kilde; imidlertid avhengig av grunnen av nyre explantation, disse nyrene kan inneholde flere fibrose og dermed myofibroblasts, og derfor må utvises forsiktighet siden myofibroblasts kunne være isolert og kultivert i stedet for perivascular celler.
Som kPSCs isolert med denne protokollen show organo-typic egenskaper med nyre epithelial sår helbredelse kapasitet15, cellen terapi med kPSCs i nyre sykdommer og transplantasjon ville være et interessant program som fremtidige. For dette formålet er det flere strategier av celle/celle produktlevering. Første strategi er IV infusjon av kPSCs, som brukes i dag i bmMSC kliniske studier. Et annet interessant program er bruk av kPSCs eller kPSC-utskilles faktorer i maskinen perfusjon før transplantasjon. På denne måten kan kvaliteten på explanted nyre forbedre som kan føre til forbedret nyrefunksjon etter transplantasjon. Begge strategier er kPSCs en interessant ny cellen kilde å utforske mer for klinisk formål.
Disclosures
D.G.L., M.A.E., og T.J.R. er forbundet med en patentsøknad angående denne forskningen. Andre forfattere ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen har mottatt finansiering fra EUs syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) under grant avtalenummer 305436 STELLAR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baxter bags | Fenwal | R4R-7004 | |
| Human platelets | Sanquin | hospital surplus material expired for less than 2 d is used | |
| platelet lysate | custom made | ||
| Disposable sterile bottles | Corning | 09-761-11 | |
| 500 mL PP centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| a-MEM medium | Lonza | BE12-169F | |
| glutamax | thermo fisher | 35050038 | |
| pen/strep | Invitrogen | 15070063 | |
| transfusion system | Codan | 455609 | |
| DMEM-F12 | life technologies | 11320-074 | |
| Normal Human Serum (NHS) | Sanquin | ||
| Hepes 1 M | Lonza | BE-17-737E | |
| NaHCO3 7.5% | Lonza | BE17-613E | |
| CaCl2 1 M | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| UW | Bridge to life | 32911 | |
| Heparin | Leo Pharma | ||
| collagenase NB1 GMP grade | SERVA | 17455.03 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ml | |
| surgical drapes | 3M Nederland | DH999969404 | |
| perfusion pump | metrohm | x007528300 | |
| pump head | metrohm | x077202600 | |
| perfusion tray | custom made | ||
| LS25 masterflex tubes | Masterflex | HV-96410-25 | |
| accessory spike | Gambro DASCO | 6038020 | |
| pulmozyme | Roche | ||
| culture flasks 25 cm2 | greiner | 690175 | |
| culture flask 75 cm2 | greiner | 658170 | |
| culture flask 175 cm2 | greiner | 661160 | |
| Trypsin | sigma | t4174 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500g | |
| FcR blocking reagent | miltenyi | 130-059-901 | |
| anti melanoma beads (NG2) | miltenyi | 130-090-452 | |
| cell strainer 70 µm | Corning | 352350 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS magnet | miltenyi | 130-090-976 | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | |
| CD45 APC | BD | 555485 | |
| CD146 PE | BD | 550315 | |
| NG2 APC | R&D | FAB2585A | |
| CD90 PE | BD | 555596 | |
| HLA ABC APC | BD | 555555 | |
| CD105 FITC | Ancell | 326-040 | |
| HLA DR APC | BD | 559866 | |
| CD56 PE | BD | 555516 | |
| CD73 PE | BD | 550257 | |
| CD31 FITC | BD | 555445 | |
| CD133 PE | miltenyi | 130-090-853 | |
| PDGF-r | R&D | mab 1263 | |
| mouse IgG1 FITC | BD | 345815 | |
| mouse IgG1 PE | BD | 345816 | |
| mouse IgG1 APC | BD | 345818 | |
| IgG2b PE | BD | 555743 | |
| goat anti mouse PE | Dako | R0480 | |
| sodium azide | Merck | 822335 | |
| DMEM Ham’s F12 | Gibco | 31331-028 | |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Sigma | I1884 | |
| hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
| triiodothyrinine | Sigma | T5516 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | sigma | E9644 | |
| Immortalized human renal PTEC (HK2) | courtesey of M. Ryan, university college Dublin |
References
- Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp Hematol. 2 (2), 83-92 (1974).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Leuning, D. G., Reinders, M. E., de Fijter, J. W., Rabelink, T. J. Clinical translation of multipotent mesenchymal stromal cells in transplantation. Semin Nephrol. 34 (4), 351-364 (2014).
- Reinders, M. E., et al. Autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cells for the treatment of allograft rejection after renal transplantation: results of a phase I study. Stem Cells Transl Med. 2 (2), 107-111 (2013).
- Perico, N., et al. Autologous mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: a pilot study of safety and clinical feasibility. Clin J Am Soc Nephrol. 6 (2), 412-422 (2011).
- Perico, N., et al. Mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: pretransplant infusion protects from graft dysfunction while fostering immunoregulation. Transpl Int. 26 (9), 867-878 (2013).
- Tan, J., et al. Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial. JAMA. 307 (11), 1169-1177 (2012).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Sacchetti, B., et al. No Identical "Mesenchymal Stem Cells" at Different Times and Sites: Human Committed Progenitors of Distinct Origin and Differentiation Potential Are Incorporated as Adventitial Cells in Microvessels. Stem Cell Reports. 6 (6), 897-913 (2016).
- Chen, W. C., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).
- Dekel, B., et al. Isolation and characterization of nontubular sca-1+lin- multipotent stem/progenitor cells from adult mouse kidney. J Am Soc Nephrol. 17 (12), 3300-3314 (2006).
- Li, J., et al. Collecting duct-derived cells display mesenchymal stem cell properties and retain selective in vitro and in vivo epithelial capacity. J Am Soc Nephrol. 26 (1), 81-94 (2015).
- Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Res. 8 (1), 58-73 (2012).
- Leuning, D. G., et al. Clinical-Grade Isolated Human Kidney Perivascular Stromal Cells as an Organotypic Cell Source for Kidney Regenerative Medicine. Stem Cells Transl Med. , (2016).
- Bruno, S., et al. Isolation and characterization of resident mesenchymal stem cells in human glomeruli. Stem Cells Dev. 18 (6), 867-880 (2009).
- Ryan, M. J., et al. HK-2: an immortalized proximal tubule epithelial cell line from normal adult human kidney. Kidney Int. 45 (1), 48-57 (1994).
- Nijhoff, M. F., et al. Glycemic Stability Through Islet-After-Kidney Transplantation Using an Alemtuzumab-Based Induction Regimen and Long-Term Triple-Maintenance Immunosuppression. Am J Transplant. , (2015).
