Summary
여기 우리는 신장 혈관 주위 Stromal 세포 (kPSCs) 소화 효소와 NG2 셀 농축 전체가 장기 관류에 따라 새로운 임상 등급 고립과 문화 방법 제시. 이 방법으로 세포 치료에 대 한 충분 한 셀 번호 취득 가능 하다.
Abstract
Mesenchymal Stromal 세포 (MSCs)는 조직 항상성 및 면역 modulatory 세포 신장 질환과 이식에 유익한 효과 표시. 혈관 주위 Stromal 세포 (PSCs) 골 MSCs (bmMSCs)와 특성을 공유. 그러나, 그들은 또한 소유, 대부분 지역 각 인, 조직 관련 속성 및 지역 조직의 항상성에서 역할. 이 조직 특이성 또한 인간의 신장 내 조직 특정 복구 될 수 있습니다. 우리는 이전 인간의 신장 Psc (kPSCs)는 신장 상피 상처 치유 bmMSCs이이 잠재력 하지 않은 반면 강화 보였다. 또한, kPSCs는 신장 상해 비보개량 수 있습니다. 따라서, kPSCs는 특히 신장 질환과 신장 이식에 대 한 세포 치료에 대 한 재미 있는 소스를 구성합니다. 여기 우리가 인간의 신장 신장 동맥 및 혈관 주위 마커 NG2 농축을 통해 소화 효소의 전체 장기 관류에 따라 이식-학년에서 kPSCs에 대 한 자세한 고립과 문화 메서드를 보여줍니다. 이 방법에서는, 큰 셀 수량 얻어질 수 있다 세포 치료에 적합 합니다.
Introduction
Mesenchymal Stromal 세포 (MSCs)는 면역 modulatory 세포는 골 수에서 원래 고립 되었다. 그들은 그들의 스핀 들 모양의 형태, 지방, 뼈와 연골, 그리고 플라스틱 부착으로 차별 하는 능력에 의해 특징. MSCs stromal 마커 CD73, CD90, CD105 동안 마커 CD31, CD451,2,3에 대 한 부정적인 표현 한다. MSCs는 그들의 조직의 항상성 및 immunomodulatory 용량 세포 치료에 대 한 유망한 후보. bmMSCs는 현재 신장 질환과 신장 이식으로4다른 검토를 포함 하 여 여러 가지 질병에 대 한 임상 실험에서 공부 되 고 있습니다.
이전 그것은 혈관 주위 지방 조직을 포함 하 여 여러 다른 단단한 장기에서 세포, 태 반 및 골격 근육 MSCs9특성을 공유 표시 했다. 그러나,이 세포는 또한 조직 관련 기능 organotypic 수리10귀 착될 수 있는 전시. 예를 들어 인간의 심근 혈관 주위 세포 hypoxia 후 신생 응답을 자극 하 고 혈관 주위 세포가 다른 조직에서 고립이 후보11보여주지 않았다 하는 동안, cardiomyocytes에 분화.
혈관 주위 stromal 세포 마우스12,,1314 및 인간의 신장15,16으로부터 격리 될 수 있습니다. 우리는 광범위 하 게 kPSCs를 특징 하 고 bmMSCs에 비해. 우리는 kPSCs, bmMSCs, 유사한 면역 능력 있고, 혈관 신경 얼 기 형성을 지원할 수 있습니다 발견. 그러나, 조직 세포 유형 HoxD10 및 HoxD11 nephrogenic 전사 인자를 포함 하 여 organotypic transcriptional 식 서명 했다 kPSCs로 구체적인 차이가 있습니다. kPSCs, bmMSCs, 달리 myofibroblast 변환 후 TGF-β와 자극을 받아야 하지 않았다 고 adipocytes에 차별화 하지 못했습니다. 또한, kPSCs는 신장 관 상피 상처 스크래치 분석 결과, bmMSCs와 관찰 하지 현상은 상피 무결성 가속. 이 향상 된 상처 복구 hepatocyte 성장 인자 자료를 통해 중재 했다. 또한, kPSCs ameliorated 급성 신장 상해15의 쥐 모델에서 신장 상해. 따라서, kPSCs 우수한 신장 수리 능력을가지고 것과 신장 질환의 세포 치료에 대 한 흥미로운 새로운 소스.
세포 치료 목적을 위해 kPSCs를 사용할 수 있어야 kPSCs 임상 등급 효소와 프로토콜 임상 등급 방식으로 격리 한다. 또한, 1 기증자에 게 서 kPSCs와 여러 환자를 치료 수 있도록, 충분 한 셀 숫자를 얻은 합니다. 여기 우리가 임상 세포 치료에 사용 되는 셀의 충분 한 숫자 저조한 전체 이식 학년 신장에서 kPSCs의 임상 등급 격리 절차 자세히 보여줍니다.
Representative Results
임상 등급 kPSCs 절연 메서드는 그림 1에 요약 됩니다. 조 신장 세포 콜라 관류에 의해 인간의 이식 학년 신장 으로부터 격리 됩니다. 결과 셀 서 스 펜 션 5% 혈소판 lysates에 합칠 때까지 양식입니다. 다음 혈관 주위 stromal 세포 분수 NG2 식에 따라 격리 됩니다.
kPSCs 플라스틱 부착 스핀 들 모양의 셀 (그림 2A) 고 CD31, CD34, CD45 그리고 HLA-DR (그림 2B)에 대 한 부정적인 동안 stromal 마커 CD73, CD90, CD105 및 혈관 주위 마커 NG2, PDGFR-B와 CD146에 대 한 긍정적인. 일반적으로, kPSCs의 균질 인구 통로 4에 도달 될 수 있다 그리고 kPSCs 도달 통로 9-10 (그림 2C) 주위 노화. 우리는 통로 5-8 사이 실험을 수행 하 따라서 조언 한다.
격리 된 kPSCs의 기능 능력을 평가, 우리 수행 체 외에 신장 상피 상처 스크래치 분석 결과 kPSCs의 모든 새로운 배치에 우리가 이전 kPSCs의 바른된 매체 상피 상처 치유이 스크래치 시험15가속화할 수 있습니다 보여준. KPSC 조건된 매체 alphaMEM 5% 혈소판 lysates 48 h에 대 한 kPSCs를 경작 하 고는 상쾌한 수집 하 여 이루어집니다. 다음, 불멸 하 게 인간의 신장 근 위 관 상피 세포 (홍콩-2)17 합칠까지 교양 하 고 스크래치 상처를 만든 다음. 다음 중 kPSCs 또는 제어 매체의 바른된 매체 우물에 추가 되 고 상처의 치유의 속도 측정. KPSCs의 조절된 중 추가 될 때 상처는 훨씬 빠른 (그림 2D) 닫습니다.
그림 1 : 인간의의 임상 등급 격리 방법 kPSCs. 이식 학년 신장 cannulated 신장 동맥 (A-G)을 통해 콜라와 함께 끼얹는다 고 결과 세포 현 탁 액을 씻어 그리고 중 cryopreserved 또는 문화 (H-K)에 넣어. 셀에 도달 confluency (L), 후 셀 농축은 NG2 수행 (M). 셀 때 하나 confluent, trypsinized는 확산 또는 3D 구조 (N-P)를 표시 하는 때 중단 했다. KPSCs에 대 한 릴리스 조건 있으며 불 임, 마커 식 관 상피 상처 치유 (Q)을 강화 하는 기능. 화살표:의 신장 동맥 눈금 막대 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 특성의 인간 kPSCs. ) kPSCs는 스핀 들-모양, 플라스틱 부착 세포. B) kPSCs는 엽 마커 CD73, CD90, CD105, CD31 CD34, CD45 부정 하면서 혈관 주위 마커 NG2, PDGFR-β 및 CD146에 대 한 긍정적 이다. kPSCs 익스프레스 MHC 클래스 I (HLA-ABC) 하지만 하지 클래스 II (HLA-DR). C) cytometry에서 3 명의 다른 kPSC 기증자의 성장 특성 확인 (통로 4)에 균질 NG2 긍정적인 인구. kPSCs 노화 통로 9-10 주위에 도달합니다. D) kPSCs 신장 상피 수리 상처 스크래치 분석 결과에서 향상 시킬 수 있습니다. 제어 매체 및 t kPSC 조절 매체의 대표 이미지 = 0, 4, 8 및 12 h 표시 됩니다. A에서 눈금 막대) = 200 µ m, d에서) = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
혈관 주위 세포는 많은 다른 인간 단단한 장기, 췌 장, 지방, 연골, 신장9,,1516등에서 분리 되었습니다. 그러나 대부분의 방법은,, 기반으로 조직, 해 부 되 고 이후에 소화 효소 치료의 작은 샘플 합니다. 또한, 이것은 일반적으로 수행 되지 않습니다 임상 학년 제품. 이것은 이러한 전략 직접 임상 번역을 위해 보다 적게 적당 한 임상 등급 셀의 대량은 필요 합니다.
여기 우리는 관류 임상 등급 효소와 재료에 따라 전체 기관에 대 한 인간 kPSCs의 소설 격리 방법을 보여줍니다. 프로토콜은 현재 우리의 센터18에 임상 응용 프로그램에 대 한 사용에에서 임상 독도 Langerhans 격리 프로토콜에서 적응.
이것은 첫 번째 임상 등급 방법 kPSCs의 대량을 달성 될 수 있다입니다. 셀 수익률의 변동성은 크게 기증자 의존. 그러나, 이론적으로, 우리는 현재 3 명의 다른 기증자의 조 세포 현 탁 액의 일부분에서 얻을 셀 생산량 추정 때 기증자 당 1012 kPSCs x 2.7의 평균 수익률 달성 될 수 있습니다. MSC 치료는 일반적으로 1-2 106 셀/kg 몸 무게4x 2 셀 혼합 이루어져 있다로이 핸드폰 번호 allogenic 치료의 여러 환자에 대 한 충분 한 있습니다.
분리 절차의 하나의 중요 한 단계는 콜라 소화의 기간입니다. 소화 기간이 너무 짧은 때 문화에 더 있을 것 이다 조직의 큰 덩어리 유지 됩니다. 관류 기간이 너무 긴 경우 증가 세포 죽음을 관찰할 수 있습니다. 따라서, 최대한 빨리 신장 부드럽고 덜 투명 한 체액 되기 시작, 신장 부드럽게 마사지 한다 고 콜라 치료를 중지 합니다.
또 다른 중요 한 단계 NG2 셀 농축 후 셀의 문화입니다. 가끔 NG2 셀 농축 후 혈관 주위 세포 증식 또는 3 차원 구조에 성장 하기 시작 시작 되지 않습니다. 이 경우 셀 trypsinized을 다시 시드해야 하는 경우 셀 것 이다 일반적으로 단층 문화에서 성장 시작 됩니다.
자료를 시작으로 인간 이식 학년 신장 수술 이유로 주로 삭제 사용 되었다. 이러한 주요 섬유 증 없이 기능적인 기관 이다입니다. 우리는 이것이 비교적 드문이 제한 있을 인정 및 기관 소스를 얻기 어렵다. Explanted 신장 있을 다른 소스; 그러나, 신장 explantation의 이유에 따라 이러한 신장에 더 많은 섬유 증 및 따라서 myofibroblasts, 포함 될 수 있습니다 그리고 그러므로 주의 해야 myofibroblasts 수 있습니다 격리 하 고 혈관 주위 세포 대신 교양.
kPSCs 절연이 프로토콜 표시와 함께 신장 상피와 유기 전형적 속성 상처 치유 용량15, 신장 질병에서 kPSCs와 세포 치료 하 고 이식 미래 응용 될 것 이다. 이 목적을 위해 셀/제품 배달의 여러 전략 있습니다. 첫 번째 전략은 bmMSC 임상 연구에서 현재 사용 되는 kPSCs의 IV 주입 이다. 또 다른 흥미로운 응용 프로그램은 kPSCs 또는 kPSC 배설 요소 이식 하기 전에 기계 관류에의 사용 이다. 이 방법으로 이식 후 향상 된 신장 기능을 이어질 수 explanted 신장의 품질 향상 됩니다. 두 전략에 대 한 kPSCs는 추가 임상 목적을 위해 탐구 하는 재미 있는 새로운 셀 소스입니다.
Disclosures
D.G.L., M.A.E., 및 T.J.R.는이 연구에 대 한 특허 출원과 함께 연결 되어 있습니다. 다른 저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 부여 계약 번호 305436에서 유럽 공동체의 일곱 번째 기구 프로그램 (FP7 2007-2013 년)에서 자금 지원을 받은 스텔라.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baxter bags | Fenwal | R4R-7004 | |
| Human platelets | Sanquin | hospital surplus material expired for less than 2 d is used | |
| platelet lysate | custom made | ||
| Disposable sterile bottles | Corning | 09-761-11 | |
| 500 mL PP centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| a-MEM medium | Lonza | BE12-169F | |
| glutamax | thermo fisher | 35050038 | |
| pen/strep | Invitrogen | 15070063 | |
| transfusion system | Codan | 455609 | |
| DMEM-F12 | life technologies | 11320-074 | |
| Normal Human Serum (NHS) | Sanquin | ||
| Hepes 1 M | Lonza | BE-17-737E | |
| NaHCO3 7.5% | Lonza | BE17-613E | |
| CaCl2 1 M | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| UW | Bridge to life | 32911 | |
| Heparin | Leo Pharma | ||
| collagenase NB1 GMP grade | SERVA | 17455.03 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ml | |
| surgical drapes | 3M Nederland | DH999969404 | |
| perfusion pump | metrohm | x007528300 | |
| pump head | metrohm | x077202600 | |
| perfusion tray | custom made | ||
| LS25 masterflex tubes | Masterflex | HV-96410-25 | |
| accessory spike | Gambro DASCO | 6038020 | |
| pulmozyme | Roche | ||
| culture flasks 25 cm2 | greiner | 690175 | |
| culture flask 75 cm2 | greiner | 658170 | |
| culture flask 175 cm2 | greiner | 661160 | |
| Trypsin | sigma | t4174 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500g | |
| FcR blocking reagent | miltenyi | 130-059-901 | |
| anti melanoma beads (NG2) | miltenyi | 130-090-452 | |
| cell strainer 70 µm | Corning | 352350 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS magnet | miltenyi | 130-090-976 | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | |
| CD45 APC | BD | 555485 | |
| CD146 PE | BD | 550315 | |
| NG2 APC | R&D | FAB2585A | |
| CD90 PE | BD | 555596 | |
| HLA ABC APC | BD | 555555 | |
| CD105 FITC | Ancell | 326-040 | |
| HLA DR APC | BD | 559866 | |
| CD56 PE | BD | 555516 | |
| CD73 PE | BD | 550257 | |
| CD31 FITC | BD | 555445 | |
| CD133 PE | miltenyi | 130-090-853 | |
| PDGF-r | R&D | mab 1263 | |
| mouse IgG1 FITC | BD | 345815 | |
| mouse IgG1 PE | BD | 345816 | |
| mouse IgG1 APC | BD | 345818 | |
| IgG2b PE | BD | 555743 | |
| goat anti mouse PE | Dako | R0480 | |
| sodium azide | Merck | 822335 | |
| DMEM Ham’s F12 | Gibco | 31331-028 | |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Sigma | I1884 | |
| hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
| triiodothyrinine | Sigma | T5516 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | sigma | E9644 | |
| Immortalized human renal PTEC (HK2) | courtesey of M. Ryan, university college Dublin |
References
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