Summary
Nous présentons ici une méthode d’isolation et de la culture de roman de grade clinique pour rein périvasculaires des cellules stromales (kPSCs) basé sur la perfusion des organes entiers avec des enzymes digestives et enrichissement NG2-cellule. Avec cette méthode, il est possible d’acquérir le nombre de cellules suffisant pour la thérapie cellulaire.
Abstract
Cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont homéostatiques et immunitaire modulateurs cellules des tissus qui ont montré des effets bénéfiques dans les maladies des reins et de la transplantation. Cellules stromales périvasculaires (PSC) partagent des caractéristiques avec la moelle osseuse MSCs (bmMSCs). Cependant, ils possèdent également, probablement en raison de l’empreinte locale, les propriétés spécifiques des tissus et jouent un rôle dans l’homéostasie tissulaire locale. Cette spécificité tissulaire peut entraîner réparation spécifique des tissus, également dans le rein humain. Nous avons montré précédemment que rein humain PSC (kPSCs) ont amélioré rénales épithéliales de cicatrisation tandis que bmMSCs n’avait pas ce potentiel. De plus, kPSCs peut améliorer de lésion rénale in vivo. Par conséquent, les kPSCs constituent une source intéressante pour la thérapie cellulaire, en particulier pour les maladies des reins et de la transplantation rénale. Ici, nous montrons aux méthodes d’isolement et de la culture pour kPSCs de transplantation-grade des reins humains basés sur la perfusion ensemble-orgue d’enzymes digestives via l’artère rénale et un enrichissement pour le marqueur périvasculaires NG2. De cette façon, les quantités de grandes cellules peuvent être obtenues qui conviennent à la thérapie cellulaire.
Introduction
Cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont des cellules modulateurs immunitaires qui ont été initialement isolées de la moelle osseuse. Ils sont caractérisés par leur morphologie, capacité à se différencier en gras, des os et du cartilage et adhérence plastique fusiforme. MSCs expriment les marqueurs stromales CD73, CD90, CD105 tout en étant négatif pour les marqueurs CD31 et CD451,2,3. MSCs sont un candidat prometteur pour la thérapie cellulaire en raison de leurs tissus homéostatique et immunomodulatrices. bmMSCs sont actuellement à l’étude dans des essais cliniques pour plusieurs maladies, dont les maladies des reins et une transplantation rénale comme revu ailleurs4.
Antérieurement, il a été montré que périvasculaires des cellules de plusieurs différents organes solides, y compris le tissu adipeux, placenta et le muscle squelettique partagent des caractéristiques avec MSCs9. Cependant, ces cellules présentent également des fonctions spécifiques des tissus qui peuvent se traduire par organotypique réparation10. Les cellules humaines périvasculaires myocardique, par exemple, stimulent angiogénique réponses après l’hypoxie et se différencient en cardiomyocytes, tandis que les cellules périvasculaires isolées des autres tissus n’ont pas montré de ces potentiels11.
Cellules stromales périvasculaires peuvent également être isolées des souris12,,du13,14 et15,de rein humain16. Abondamment, nous avons caractérisé kPSCs et par rapport aux bmMSCs. Nous avons constaté que kPSCs, similaires à bmMSCs, ont des capacités immunosuppresseurs peut prendre en charge la formation du plexus vasculaire. Cependant, il sont a des tissus des différences spécifiques entre les types de cellules, comme kPSCs a montré une signature d’expression transcriptionnelle organotypique, y compris les facteurs de transcription néphrogénique HoxD10 et HoxD11. kPSCs, contrairement à bmMSCs, n’a pas subi de transformation des myofibroblastes après stimulation par TGF-β et ont été incapables de se différencier en adipocytes. En outre, kPSCs accéléré intégrité épithéliale dans un essai gratter plaie épithéliales tubulaires du rein, un phénomène qui n’a été observé avec bmMSCs. Cette plaie renforcée réparation a été véhiculée par le communiqué de facteur de croissance des hépatocytes. En outre, kPSCs amélioré des lésions rénales dans un modèle murin d’insuffisance rénale aiguë lésion15. Par conséquent, les kPSCs semblent avoir des capacités de réparation rénale supérieure et sont une source intéressante de nouveau pour la thérapie cellulaire dans les maladies des reins.
Pour pouvoir utiliser kPSCs à des fins de thérapie cellulaire, kPSCs devraient être isolés d’une manière de grade clinique avec les enzymes de grade clinique et protocoles. En outre, pour être en mesure de traiter plusieurs patients avec kPSCs du 1 donneur, nombre de cellules suffisant devrait être obtenu. Nous montrons ici en détail, la technique d’isolation de grade clinique de kPSCs de reins de toute transplantation de grade, ce qui donne un nombre suffisant de cellules à utiliser pour la thérapie cellulaire clinique.
Representative Results
La méthode d’isolement de grade clinique kPSCs est résumée dans la Figure 1. Les cellules rénales brut sont isolés des reins de grade de la transplantation humaine par perfusion de collagénase. La suspension de cellules qui en résulte est cultivée jusqu’au confluent dans les lysats de plaquettes de 5 %. Ensuite la fraction de cellules stromales périvasculaires est isolée en fonction sur expression NG2.
kPSCs sont des cellules adhérentes en plastique en forme de fuseau (Figure 2A) et sont positifs pour les marqueurs stromales marqueurs CD73, CD90, CD105 et périvasculaires NG2, PDGFR-B et CD146, tandis que des résultats négatifs pour le CD31, CD34, CD45 et HLA-DR (Figure 2B). En règle générale, une population homogène de kPSCs peut être rejoint au passage 4, et le kPSCs atteindre sénescence autour du passage 9-10 (Figure 2C). Nous conseillons donc d’effectuer des expériences entre passage 5-8.
Pour évaluer la capacité fonctionnelle de le kPSCs isolés, nous effectuons un essai in vitro rénales épithéliales plaie gratter avec sur chaque nouveau lot de kPSCs, comme nous l’avons montré précédemment que le milieu conditionné de kPSCs peut accélérer la cicatrisation épithéliale dans ce dosage zéro15. Le milieu conditionné de kPSC fait en cultivant kPSCs pendant 48 h dans les lysats de plaquettes alphaMEM 5 % et en recueillant le liquide surnageant. Ensuite, le rein humain immortalisées tubule proximal des cellules épithéliales (HK-2)17 sont cultivées jusqu’au confluent et puis faite une plaie de grattage. Alors soit le milieu conditionné de milieu kPSCs ou le contrôle est ajouté aux puits et la vitesse de cicatrisation est mesurée. Lors de l’ajout du milieu conditionné de kPSCs, la plaie referme beaucoup plus rapide (Figure 2D).
Figure 1 : Clinique Grade Isolation méthode of Human kPSCs. Transplantation de reins de grade sont canulés et perfusés avec la collagénase par l’intermédiaire de l’artère rénale (A - G) et la suspension de cellules qui en résulte est lavée et soit cryopréservés ou mis en culture (H - K). Lorsque les cellules atteignent la confluence (L), NG2 enrichissement cellulaire est exécutée (M). Les cellules sont trypsinisées quand ils sont confluentes, ont cessé de proliférer ou lorsque ces structures 3D apparaissent (N - P). Les critères de publication pour kPSCs sont la stérilité, expression du marqueur et la capacité d’améliorer la cicatrisation épithéliale tubulaire (Q). Flèche : artère rénale. Echelle = 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Characterization of Human kPSCs. Un) kPSCs sont des cellules adhérentes en plastique, en forme de fuseau. KPSCs B) sont positifs pour les marqueurs mésenchymateux CD73, CD90, CD105, marqueurs périvasculaires NG2, PDGFR-β et CD146, tandis que des résultats négatifs pour le CD31, CD34 et CD45. kPSCs express MHC classe I (HLA-ABC) mais pas de classe II (HLA-DR). C) caractéristiques de la croissance des trois donneurs de kPSC différentes de cytométrie confirment homogène NG2 populations positives (au passage 4). kPSCs rejoindre la sénescence autour du passage 9-10. KPSCs D) sont en mesure d’améliorer la réparation épithéliales rénales dans un dosage zéro blessure. Les images représentant des moyens de contrôle et milieu de kPSC conditionné à t = 0, 4, 8 et 12 h sont indiqués. Echelle a) = 200 µm, d) = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
Les cellules périvasculaires ont été isolées de nombreux différents organes solides humaines, y compris le pancréas, la graisse, du cartilage et le rein de15,9,16. La plupart des méthodes, cependant, sont basés sur de petits échantillons de tissu, qui sont disséqués et ensuite traités avec des enzymes digestives. En outre, c’est généralement pas réalisée avec des produits de qualité clinique. Cela rend ces stratégies moins approprié pour une traduction clinique directe où de grandes quantités de cellules cliniques de qualité sont nécessaires.
Nous montrons ici une méthode d’isolement roman de kPSCs humain pour des organes entiers, basé sur la perfusion avec les enzymes de grade clinique et matériaux. Le protocole est adapté à partir du protocole d’isolement clinique îlots de Langerhans en cours d’utilisation pour des applications cliniques dans notre centre18.
C’est la première méthode de grade clinique où de grandes quantités de kPSCs est possible. La variabilité du rendement de la cellule est dans une large mesure les donateurs dépendant. Toutefois, lorsque le rendement cellulaire que nous obtenons actuellement d’une fraction de la suspension cellulaire brut de trois différents donateurs est extrapolé, en théorie, un rendement moyen de 2,7 x 1012 kPSCs par donneur pourrait être atteint. Comme MSC thérapie consiste généralement en 2 perfusions de cellule avec 1-2 x 106 cellules/kg corps poids4, nombre de ces cellules est suffisant pour un traitement allogénique de plusieurs patients.
Une étape cruciale dans la procédure d’isolement est la durée de la digestion de collagénase. Lorsque la période de digestion est trop courte, grosses touffes de tissu restera, qui sera plus difficile à la culture. Lorsque la période de perfusion est trop longue, la mort cellulaire accrue peut-être être observée. Par conséquent, dès que le rein commence à devenir mou et des fluides moins transparents, le rein doit se faire masser doucement et la collagénase de traitement doit être arrêtée.
Une autre étape critique est la culture des cellules après enrichissement cellulaire NG2. Parfois après l’enrichissement de cellule NG2, les cellules périvasculaires ne commencent pas à proliférer ou commencent à se développer dans les structures 3D. Dans ce cas, lorsque les cellules sont trypsinisées et redéfinies, les cellules habituellement commencera à croître en culture monocouche.
Comme matériau de départ, reins de grade de la transplantation humaine rejetés principalement pour des raisons chirurgicales ont été utilisés. Voici les organes fonctionnels sans fibrose importante. Nous reconnaissons que cela pourrait être une limitation, car c’est une maladie relativement rare et difficile à obtenir la source de l’orgue. Reins explantés pourraient constituer une autre source ; Toutefois, selon le motif de l’explantation rein, ces reins peuvent contenir plus de fibrose et donc myofibroblastes, et c’est pourquoi il faut veiller car les myofibroblastes peuvent être isolées et cultivées au lieu de cellules périvasculaires.
Comme le kPSCs isolés avec ce spectacle de protocole propriétés organo-typic avec rein épithélial enroulait guérison capacités15, thérapie cellulaire avec kPSCs dans les maladies des reins et transplantation serait une intéressante application future. À cette fin, il y a plusieurs stratégies de livraison du produit cellule/cellule. La première stratégie est perfusion IV de kPSCs, tel qu’il est actuellement utilisé dans les études cliniques de bmMSC. Une autre application intéressante est l’utilisation des kPSCs ou des facteurs de kPSC-excrétés dans la perfusion de la machine avant la transplantation. De cette façon, la qualité du rein explanté pourrait améliorer qui pourrait conduire à la fonction rénale améliorée après la transplantation. Pour les deux stratégies, kPSCs sont une source intéressante de cellules nouvelles à explorer davantage à des fins cliniques.
Disclosures
D.G.L., M.A.E., et T.J.R. sont associés à une demande de brevet concernant cette étude. Les autres auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a reçu un financement du septième programme-cadre (7e PC/2007-2013) de la Communauté européenne en vertu de la concession numéro de contrat 305436 STELLAR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baxter bags | Fenwal | R4R-7004 | |
| Human platelets | Sanquin | hospital surplus material expired for less than 2 d is used | |
| platelet lysate | custom made | ||
| Disposable sterile bottles | Corning | 09-761-11 | |
| 500 mL PP centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| a-MEM medium | Lonza | BE12-169F | |
| glutamax | thermo fisher | 35050038 | |
| pen/strep | Invitrogen | 15070063 | |
| transfusion system | Codan | 455609 | |
| DMEM-F12 | life technologies | 11320-074 | |
| Normal Human Serum (NHS) | Sanquin | ||
| Hepes 1 M | Lonza | BE-17-737E | |
| NaHCO3 7.5% | Lonza | BE17-613E | |
| CaCl2 1 M | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| UW | Bridge to life | 32911 | |
| Heparin | Leo Pharma | ||
| collagenase NB1 GMP grade | SERVA | 17455.03 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ml | |
| surgical drapes | 3M Nederland | DH999969404 | |
| perfusion pump | metrohm | x007528300 | |
| pump head | metrohm | x077202600 | |
| perfusion tray | custom made | ||
| LS25 masterflex tubes | Masterflex | HV-96410-25 | |
| accessory spike | Gambro DASCO | 6038020 | |
| pulmozyme | Roche | ||
| culture flasks 25 cm2 | greiner | 690175 | |
| culture flask 75 cm2 | greiner | 658170 | |
| culture flask 175 cm2 | greiner | 661160 | |
| Trypsin | sigma | t4174 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500g | |
| FcR blocking reagent | miltenyi | 130-059-901 | |
| anti melanoma beads (NG2) | miltenyi | 130-090-452 | |
| cell strainer 70 µm | Corning | 352350 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS magnet | miltenyi | 130-090-976 | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | |
| CD45 APC | BD | 555485 | |
| CD146 PE | BD | 550315 | |
| NG2 APC | R&D | FAB2585A | |
| CD90 PE | BD | 555596 | |
| HLA ABC APC | BD | 555555 | |
| CD105 FITC | Ancell | 326-040 | |
| HLA DR APC | BD | 559866 | |
| CD56 PE | BD | 555516 | |
| CD73 PE | BD | 550257 | |
| CD31 FITC | BD | 555445 | |
| CD133 PE | miltenyi | 130-090-853 | |
| PDGF-r | R&D | mab 1263 | |
| mouse IgG1 FITC | BD | 345815 | |
| mouse IgG1 PE | BD | 345816 | |
| mouse IgG1 APC | BD | 345818 | |
| IgG2b PE | BD | 555743 | |
| goat anti mouse PE | Dako | R0480 | |
| sodium azide | Merck | 822335 | |
| DMEM Ham’s F12 | Gibco | 31331-028 | |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Sigma | I1884 | |
| hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
| triiodothyrinine | Sigma | T5516 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | sigma | E9644 | |
| Immortalized human renal PTEC (HK2) | courtesey of M. Ryan, university college Dublin |
References
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