Summary
Hier präsentieren wir eine neue klinische Grade Isolation und Kultur Methode zur Niere perivaskuläre Stromazellen Zellen (kPSCs) anhand der gesamten Organ Perfusion mit Verdauungsenzymen und NG2-Zelle Bereicherung. Mit dieser Methode ist es möglich, ausreichende Zellzahlen für Zelltherapie erwerben.
Abstract
Mesenchymaler Stromazellen Zellen (MSCs) sind homöostatische und Immunsystem modulierende Gewebezellen, die wohltuende Wirkung bei Nierenerkrankungen und Transplantation gezeigt haben. Perivaskuläre Stromazellen Zellen (EAP) teilen Eigenschaften mit Knochenmark MSCs (BmMSCs). Jedoch besitzen sie auch, wahrscheinlich aufgrund lokaler Prägung, Gewebe-spezifische Eigenschaften und spielen eine Rolle bei der lokalen Gewebe Homöostase. Diese Gewebespezifität führen bestimmte Gewebereparatur, auch innerhalb der menschlichen Niere. Wir zeigten bisher, dass menschliche Niere EAP (kPSCs) Niere epitheliale Wundheilung während BmMSCs nicht dieses Potenzial hatte verbessert haben. Darüber hinaus können kPSCs Niere Verletzungen in Vivolindern. Daher bilden kPSCs eine interessante Quelle für Zelltherapie, insbesondere für Nierenerkrankungen und Nierentransplantation. Hier zeigen wir die detaillierte Isolation und Kultur-Methode für kPSCs von Transplantation-Grade menschliche Nieren basierend auf ganze Organ Perfusion von Verdauungs-Enzymen über die Nierenarterie und Bereicherung für die perivaskuläre Marker NG2. Auf diese Weise großzellige Mengen erhalten, die für die zelluläre Therapie eignen.
Introduction
Mesenchymaler Stromazellen Zellen (MSCs) sind modulierende Immunzellen, die ursprünglich aus dem Knochenmark isoliert wurden. Sie zeichnen sich durch ihre Spindel förmigen Morphologie, Fähigkeit, in Fett, Knochen und Knorpel und Kunststoff Termintreue zu unterscheiden. MSCs express die stromale Marker CD73, CD90, CD105 und negativ für die Marker CD31 und CD451,2,3. MSCs sind ein viel versprechender Kandidat für die Zelltherapie aufgrund ihrer Gewebe homöostatische und immunmodulatorische Kapazitäten. BmMSCs werden derzeit in klinischen Studien für verschiedene Krankheiten, einschließlich Nierenerkrankungen und Nierentransplantation wie an anderer Stelle überprüft4geprüft.
Bisher zeigte sich, dass perivaskuläre Zellen aus mehreren verschiedenen solide Organe, einschließlich Fettgewebe, Plazenta und Skelettmuskulatur mit MSCs9Merkmale teilen. Allerdings zeigen diese Zellen auch Gewebe-spezifische Funktionen die organotypischen Reparatur10führen kann. Menschlichen myokardialen perivaskuläre Zellen, z. B. angeregt angiogenen Antworten nach Hypoxie und differenziert in Kardiomyozyten, während perivaskuläre Zellen isoliert von anderen Geweben nicht diese Potenziale11zeigte.
Perivaskuläre Stromazellen Zellen können auch von der Maus12,13,14 und menschliche Niere15,16isoliert werden. Wir haben ausgiebig gekennzeichnet kPSCs und verglich diese mit BmMSCs. Wir festgestellt, dass kPSCs, ähnlich wie BmMSCs, immunsuppressive Kapazitäten und vaskulären Plexus Bildung unterstützen können. Allerdings gibt es Unterschiede zwischen der Zelltypen als kPSCs zeigte eine organotypischen transkriptionelle Ausdruck Signatur, einschließlich der nephrogenen Transkriptionsfaktoren, HoxD10 und HoxD11 Gewebe. kPSCs, im Gegensatz zu BmMSCs, nicht unterziehen, Myofibroblast Transformation nach Stimulation mit TGF-β und waren nicht in der Lage, sich in Adipozyten differenzieren. Darüber hinaus beschleunigt kPSCs epitheliale Integrität in einem Nieren röhrenförmige epithelialen Wunde kratzen Assay, ein Phänomen, das nicht mit BmMSCs beobachtet wurde. Diese erweiterten Wunde Reparatur wurde durch Hepatozyten-Wachstumsfaktor Freisetzung vermittelt. Darüber hinaus verbessert kPSCs Niere Verletzungen in einem Mausmodell der akuten Nierenversagens Verletzungen15. Daher kPSCs überlegene renal Reparatur Kapazitäten zu haben scheinen und sind eine interessante neue Quelle für die Zelltherapie bei Nierenerkrankungen.
Um kPSCs Zelle Therapie Zwecken nutzen zu können, sollte kPSCs in gewissem Sinne klinische Grade mit klinischen Grade Enzyme und Protokollen isoliert werden. Um mehrere Patienten mit kPSCs von 1 Spender behandeln zu können, sollte darüber hinaus ausreichend Zellzahlen erzielt werden. Hier zeigen wir im Detail, das klinische Grade isoliert Verfahren der kPSCs von ganzen Transplantation Grade Nieren, nachgiebig ausreichende Zahl von Zellen für Klinische Zelltherapie verwendet werden.
Representative Results
Die klinische Grade kPSCs Isolationsmethode ist in Abbildung 1zusammengefasst. Grobe Nierenzellen sind von menschlichen Transplantation Grade Nieren von Kollagenase Perfusion isoliert. Die daraus resultierende Zellsuspension ist bis zum Zusammenfluss in 5 % Thrombozyten Lysates kultiviert. Dann ist die perivaskuläre Stromazellen Zelle Bruchteil isoliert basierend auf NG2 Ausdruck.
kPSCs sind aus Kunststoff anhaftende spindelförmige Zellen (Abb. 2A) und positiv für die stromale Marker CD73, CD90, CD105 und perivaskuläre Marker NG2, PDGFR-B und CD146, während negativ für CD31, CD34, CD45 und HLA-DR (Abbildung 2B). In der Regel eine homogene Bevölkerung von kPSCs erreichen Sie in der Passage 4 und kPSCs erreichen Seneszenz um Durchgang 9-10 (Abbildung 2C). Wir empfehlen daher Experimente zwischen 5-8 Durchgang durchführen.
Um die Funktionsfähigkeit der isolierten kPSCs zu bewerten, führen wir einen in-vitro- Niere epithelialen Wunde kratzen Assay auf jede neue Charge von kPSCs, wie zuvor gezeigt, dass die konditionierte Medium der kPSCs beschleunigen kann epitheliale Wundheilung in dieser Kratzer Assay-15. Das kPSC konditionierten Medium erfolgt durch Kultivierung kPSCs für 48 h in AlphaMEM 5 % Thrombozyten Lysates und den Überstand zu sammeln. Als nächstes verewigt menschliche Niere proximale Röhrchen Epithelzellen (HK-2)17 sind bis zum Zusammenfluss kultiviert und dann Kratzen Wunde gemacht. Dann entweder die konditionierte Medium der kPSCs oder Kontrolle Medium wird hinzugefügt, um die Brunnen und die Geschwindigkeit der Wundheilung wird gemessen. Wenn die konditionierte Medium der kPSCs hinzugefügt wird, schließt die Wunde deutlich schneller (Abbildung 2D).
Abbildung 1 : Klinische Grade Isolation Methode des menschlichen kPSCs. Transplantation Grade Nieren sind kanülierte durchströmt mit Kollagenase über die Nierenarterie (A - G) und die daraus resultierende Zellsuspension wird gewaschen und entweder kryokonserviert oder in Kultur (H - K). Nachdem die Zellen Konfluenz (L) erreicht haben, durchgeführt NG2 Zelle Bereicherung ist (M). Zellen sind trypsiniert wenn sie entweder konfluierende, sind nicht mehr vermehren oder wenn 3D-Strukturen (N - P) angezeigt. Die Freigabekriterien für kPSCs sind Sterilität, Marker Ausdruck und die Fähigkeit, röhrenförmigen epitheliale Wundheilung (Q) zu verbessern. Pfeil: Nierenarterie. Maßstabsleiste = 200 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Charakterisierung des menschlichen kPSCs. Ein) kPSCs sind spindelförmig, Kunststoff adhärente Zellen. ( B) kPSCs sind positiv für mesenchymalen Marker CD73, CD90, CD105, perivaskuläre Marker NG2, PDGFR-β und CD146, während negativ für CD31, CD34 und CD45. kPSCs express MHC-Klasse ich (HLA-ABC) jedoch keine Klasse II (HLA-DR). ( C) Wuchsmerkmalen von drei verschiedenen kPSC Spender aus Durchflusszytometrie bestätigt homogene NG2 positive Populationen (Abschnitt 4). kPSCs erreichen Seneszenz um Durchgang 9-10. D) kPSCs sind in der Lage, Niere epithelialen Reparatur in einer Wunde kratzen Assay zu verbessern. Repräsentative Bilder von Kontrolle und kPSC bedingt Medium bei t = 0, 4, 8 und 12 h gezeigt. Maßstabsleiste a) = 200 µm, in D) = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Perivaskuläre Zellen wurden von vielen verschiedenen menschlichen solide Organe, einschließlich Fett, Knorpel, Bauchspeicheldrüse und Niere9,15,16isoliert. Die meisten Methoden basieren jedoch auf kleine Proben von Gewebe, die seziert und danach mit Verdauungsenzymen behandelt. Darüber hinaus erfolgt dies in der Regel nicht mit klinischen Grade Produkte. Dies macht diese Strategien weniger geeignet für direkte klinische Übersetzung befinden sich große Mengen an klinischen Grade Zellen notwendig.
Hier zeigen wir eine neuartige Isolationsmethode des menschlichen kPSCs für ganze Organe anhand der Perfusion mit klinischen Grade Enzyme und Materialien. Das Protokoll ist vom klinischen Langerhans-Inseln Isolierung Protokoll derzeit im Einsatz für die klinische Anwendung in unserem Zentrum18angepasst.
Dies ist die erste klinische Grade-Methode, wo große Mengen von kPSCs erreicht werden können. Die Variabilität der Zellausbeute ist weitgehend Geber angewiesen. Wenn die Zellausbeute erhalten wir derzeit von einem Bruchteil der rohen Zellsuspension von drei verschiedenen Gebern, in der Theorie extrapoliert ist konnte eine durchschnittliche Rendite von 2,7 x 1012 kPSCs pro Spender erreicht werden. MSC-Therapie besteht in der Regel aus 2 Zelle Infusionen mit 1-2 x 106 Zellen/kg Körper Gewicht4, genügen diese Zellzahlen allogene Behandlung von mehreren Patienten.
Ein entscheidender Schritt in der Isolierung-Prozedur ist die Dauer der Kollagenase Verdauung. Wenn die Verdauung Periode zu kurz ist, bleiben große Klumpen des Gewebes, die schwerer zu Kultur werden. Wenn die Perfusion Periode zu lang ist, kann erhöhte Zelltod beobachtet werden. Daher, sobald die Niere weich und die Flüssigkeiten weniger transparent zu werden beginnt, die Niere sollte sanft massiert und die Kollagenase-Behandlung abgebrochen werden sollte.
Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Kultur der Zellen nach der NG2 Zelle Bereicherung. Manchmal nach der NG2 Zelle Bereicherung starten die perivaskuläre Zellen nicht zu vermehren oder in 3D Strukturen zu wachsen beginnen. In diesem Fall wenn die Zellen trypsiniert und eingesät, startet die Zellen in der Regel in Monolayer Kultur wachsen.
Als Ausgangsmaterial, dienten menschliche Transplantation Grade Nieren hauptsächlich aus chirurgischen Gründen verworfen. Dies sind funktionelle Organe ohne großen Fibrose. Wir anerkennen, dass dies möglicherweise eine Einschränkung, da dies eine relativ seltene und schwer zu Orgel Quelle zu erhalten. Explantierten Nieren möglicherweise eine andere Quelle; jedoch, je nach dem Grund der Niere Explantation diese Nieren enthalten mehr Fibrose und somit Myofibroblasts, und daher vorsichtig vorzugehen, da Myofibroblasts könnten isoliert und statt perivaskuläre Zellen kultiviert.
Wie die kPSCs isoliert mit diesem Protokoll Show Organo-typisches Eigenschaften mit Niere epithelialen Wunde heilende Fähigkeiten15, Zell-Therapie mit kPSCs bei Nierenerkrankungen und Transplantation wäre eine interessante zukünftige Anwendung. Zu diesem Zweck gibt es mehrere Strategien der Zelle/Zelle Produktlieferung. Die erste Strategie ist IV-Infusion von kPSCs, wie derzeit in klinischen Studien BmMSC verwendet. Eine weitere interessante Anwendung ist die Verwendung von kPSCs oder kPSC ausgeschieden Faktoren bei der Perfusion der Maschine vor der Transplantation. Auf diese Weise könnte die Qualität der explantierten Niere verbessern die nach der Transplantation zu verbesserten Nierenfunktion führen könnten. Für beide Strategien sind kPSCs eine interessante neue Zelle Quelle für klinische Zwecke weiter zu erkunden.
Disclosures
D.G.L., M.A.E., und T.J.R. mit einer Patentanmeldung bezüglich dieser Forschung verbunden sind. Die anderen Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Forschung wird finanziell von der Europäischen Gemeinschaft siebten Rahmenprogramm (RP7/2007-2013) unter Grant Vertragsnummer 305436 STELLAR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baxter bags | Fenwal | R4R-7004 | |
| Human platelets | Sanquin | hospital surplus material expired for less than 2 d is used | |
| platelet lysate | custom made | ||
| Disposable sterile bottles | Corning | 09-761-11 | |
| 500 mL PP centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| a-MEM medium | Lonza | BE12-169F | |
| glutamax | thermo fisher | 35050038 | |
| pen/strep | Invitrogen | 15070063 | |
| transfusion system | Codan | 455609 | |
| DMEM-F12 | life technologies | 11320-074 | |
| Normal Human Serum (NHS) | Sanquin | ||
| Hepes 1 M | Lonza | BE-17-737E | |
| NaHCO3 7.5% | Lonza | BE17-613E | |
| CaCl2 1 M | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| UW | Bridge to life | 32911 | |
| Heparin | Leo Pharma | ||
| collagenase NB1 GMP grade | SERVA | 17455.03 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ml | |
| surgical drapes | 3M Nederland | DH999969404 | |
| perfusion pump | metrohm | x007528300 | |
| pump head | metrohm | x077202600 | |
| perfusion tray | custom made | ||
| LS25 masterflex tubes | Masterflex | HV-96410-25 | |
| accessory spike | Gambro DASCO | 6038020 | |
| pulmozyme | Roche | ||
| culture flasks 25 cm2 | greiner | 690175 | |
| culture flask 75 cm2 | greiner | 658170 | |
| culture flask 175 cm2 | greiner | 661160 | |
| Trypsin | sigma | t4174 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500g | |
| FcR blocking reagent | miltenyi | 130-059-901 | |
| anti melanoma beads (NG2) | miltenyi | 130-090-452 | |
| cell strainer 70 µm | Corning | 352350 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS magnet | miltenyi | 130-090-976 | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | |
| CD45 APC | BD | 555485 | |
| CD146 PE | BD | 550315 | |
| NG2 APC | R&D | FAB2585A | |
| CD90 PE | BD | 555596 | |
| HLA ABC APC | BD | 555555 | |
| CD105 FITC | Ancell | 326-040 | |
| HLA DR APC | BD | 559866 | |
| CD56 PE | BD | 555516 | |
| CD73 PE | BD | 550257 | |
| CD31 FITC | BD | 555445 | |
| CD133 PE | miltenyi | 130-090-853 | |
| PDGF-r | R&D | mab 1263 | |
| mouse IgG1 FITC | BD | 345815 | |
| mouse IgG1 PE | BD | 345816 | |
| mouse IgG1 APC | BD | 345818 | |
| IgG2b PE | BD | 555743 | |
| goat anti mouse PE | Dako | R0480 | |
| sodium azide | Merck | 822335 | |
| DMEM Ham’s F12 | Gibco | 31331-028 | |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Sigma | I1884 | |
| hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
| triiodothyrinine | Sigma | T5516 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | sigma | E9644 | |
| Immortalized human renal PTEC (HK2) | courtesey of M. Ryan, university college Dublin |
References
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