Summary
在这里我们提出肾血管周围间质细胞 (kPSCs) 基于整个器官灌注与消化酶和 NG2 细胞丰富新颖的临床分级分离和培养方法。使用此方法，就可以获得足够的细胞数量，为细胞疗法。
Abstract
骨髓间质细胞 (MSCs) 是组织稳态和免疫调节细胞，有有利影响肾脏疾病和示移植。血管周围间质细胞 (Psc) 与骨髓间充质干细胞 （骨髓间充质干细胞） 共享特性。然而，他们也拥有，最有可能由于当地印迹、 组织特定的属性和地方组织的平衡中起着作用。这个组织特异性可能会导致组织具体的修复，还在人体肾脏内。我们先前表明人类肾脏物业服务公司 (kPSCs) 有增强肾上皮伤口愈合而骨髓间充质干细胞并没有这种潜力。此外，kPSCs 可以改善肾损伤的体内。因此，kPSCs 构成一个有趣的来源，细胞疗法，特别是对肾脏病和肾移植。在这里我们展示从移植级 kPSCs 详细的分离和培养方法基于整个器官灌注的消化酶通过肾动脉和血管周围标记 NG2 浓缩的人类肾脏。这种方式，适合细胞疗法可以获得大细胞数量。
Introduction
骨髓间质细胞 (MSCs) 是最初分离大鼠骨髓细胞的免疫调节细胞。他们的特点是其梭形形态，能够分化成脂肪、 骨和软骨及塑料粘附。骨髓间充质干细胞表达基质标记 CD73，CD90、 CD105 同时被标记 CD31 和 CD451，，23负。骨髓间充质干细胞是细胞疗法由于其组织稳态和免疫调节能力有前途的候选人。目前正在进行临床试验的几种疾病，包括肾脏病和肾移植在其他地方审查4研究骨髓间充质干细胞。
以前它是显示血管周细胞从几个不同的实体器官，包括脂肪、 胎盘和骨骼肌细胞与骨髓间充质干细胞9共享特性。但是，这些细胞也表现出组织特异性功能从而导致器官修复10。人类心肌血管周围的细胞，例如，刺激血管反应后缺氧和分化成心肌细胞，而从其他组织血管周细胞并没有表现出这些潜力11。
血管周围间质细胞也可以隔绝鼠标12，，1314和16人肾15，。我们广泛 kPSCs 的特点，并比较这些对骨髓间充质干细胞。我们发现 kPSCs，类似于骨髓间充质干细胞，具有免疫抑制能力，并可支持血管丛形成。然而，有组织的细胞类型，作为 kPSCs 表明器官型转录表达签名，包括肾源性转录因子 HoxD10 和 HoxD11 之间的具体区别。kPSCs，与骨髓间充质干细胞，并没有经过肌成纤维细胞转化与 TGF-β 的刺激后，却不能分化为脂肪细胞。此外，kPSCs 加速上皮完整性在肾肾小管上皮伤口划痕实验中，没有观察到与骨髓间充质干细胞的现象。此增强的创面修复介导肝细胞生长因子释放。此外，kPSCs 改善肾损伤的急性肾损伤15小鼠模型。因此，kPSCs 似乎有优越的肾脏修复能力，是一个有趣的新来源细胞治疗在肾脏疾病。
为了能为细胞治疗目的使用 kPSCs，kPSCs 应隔离在临床分级方式，与临床分级酶和协议。此外，要能够从 1 捐助几个治疗 kPSCs，应该得到足够的单元格数目。在这里我们展示细节，从整个移植级肾，kPSCs 的临床分级分离过程中产生足够数量的细胞用于临床细胞治疗。
Representative Results
在图 1中总结出的临床分级 kPSCs 隔离方法。原油肾细胞是从人类移植年级肾脏胶原酶灌注中分离。由此产生的细胞悬浮培养直到 5%血小板裂解液中汇合。然后基于 NG2 表达，血管周围间质细胞分数是孤立的。
kPSCs 塑料贴壁纺锤状细胞 (图 2A)，积极为 CD73 CD90、 CD105、 血管周围的间质标记标记 NG2、 血小板 B、 CD146，而消极 CD31、 CD34、 CD45 和 HLA-DR (图 2B)。通常情况下，kPSCs 均匀人口可达到通道 4 和 kPSCs 到达周围通道 9-10 (图 2C) 衰老。因而，我们建议进行通道 5-8 之间的实验。
要评价功能能力的孤立的 kPSCs，我们请执行体外肾上皮伤口划痕检测对每一批新的 kPSCs，正如我们先前表明的 kPSCs 培养液可以加速上皮伤口愈合在此划伤测定15。KPSC 培养液是通过培养 48 h alphaMEM 5%血小板裂解液中 kPSCs 和收集上清液。接下来，永生化人肾近端小管上皮细胞 (港币 2)17养殖直到汇合，然后划伤的伤口。然后要么 kPSCs 或控制介质条件培养液的中添加到井和伤口愈合的速度衡量。当添加的 kPSCs 培养液时，伤口关闭明显更快 (图 2D)。
图 1： 临床分级分离方法的人类 kPSCs.洗由此产生的细胞悬液移植级肾是空心和经肾动脉 (A-G) 胶原酶灌注和要么冻存或投入文化 (H-K)。细胞达到合流 (L) 后，NG2 细胞富集被执行 (M)。细胞消化时他们要么汇合，已停止增殖或当 3D 结构出现 (N-P)。KPSCs 的发布标准是不育、 标志物表达及增强肾小管上皮伤口愈合 (Q) 的能力。箭头： 肾动脉。条码秤 =请点击这里查看此图的大版本。 200 µ m。
图 2:表征人类 kPSCs。) KPSCs 是纺锤状、 塑料贴壁细胞。B) kPSCs 是为间充质标记 CD73，CD90、 CD105，血管周围标记 NG2、 血小板 β 和 CD146，而消极 CD31、 CD34 和 CD45 阳性。kPSCs 表达 MHC 类我 (HLA-ABC) 但不是类 II (HLA-DR)。C) 生长特性的三个不同的 kPSC 捐助者从流式证实均匀 NG2 积极的人口 （通道 4）。kPSCs 到达周围通道 9-10 的衰老。D) kPSCs 是能够提高肾上皮修复伤口划痕检测中。代表的形象，控制介质及 kPSC 条件介质在 t = 0、 4、 8 和 12 h 显示。条码秤 a） = 200 µ m，d) =请点击这里查看此图的大版本。 100 µ m。
Discussion
血管周围细胞已分离出许多不同的人类固体器官，包括胰腺、 脂肪、 软骨和肾脏9，，1516。然而，大多数的方法，基于小样本的组织，这是解剖和事后处理消化酶。此外，这通常不会执行与临床分级产品。这使得这些策略不太适合直接临床翻译大量的临床分级细胞是必要。
在这里我们展示整个器官灌注的临床分级酶和材料基于人类 kPSCs 新型分离方法。议定书 》 是改编自目前使用中的临床应用在我们中心18临床胰岛分离协议。
这是首次临床分级方法可以达到很大数量的 kPSCs。在细胞产率变异性是主要是捐助者的依赖。然而，当我们目前获得的三个不同的捐助者将原油细胞悬浮液的一小部分细胞产率推断，在理论上，可以实现 x 1012 kPSCs 每捐助 2.7 平均产量。由于 MSC 治疗通常包括用 1-2 x 106细胞/公斤身体重量42 细胞输注，这些单元格数字已足以让同种异体治疗的几个病人。
在分离过程中的一个重要步骤是胶原酶消化的持续时间。当消化期太短，则会继续一大簇的组织将对文化更难。当灌注时间过长时，增加的细胞死亡可能观察到。因此，尽快肾脏开始变得柔软和不透明液体，应轻轻按摩肾脏和胶原酶治疗应停止。
另一个关键的一步后 NG2 细胞富集是细胞的培养。有时后 NG2 细胞富集，不开始血管周细胞增殖或开始在三维结构中成长。在这种情况下，当细胞消化，加赛，细胞将通常开始生长单层培养。
为起始原料，主要用于外科手术的原因被丢弃的人类移植等级肾脏被使用。这些都是无重大肺间质纤维化的功能器官。我们承认，这可能是一个限制，因为这是比较少见，很难获取器官源。移植的肾可能是另一个来源;然而，根据肾取出的原因，这些肾脏可能包含更多的纤维化和因而肌成纤维细胞，并因此要小心因为肌成纤维细胞可能分离、 培养而不是血管周围细胞。
KPSCs 分离与此协议显示有机典型属性与肾上皮伤口愈合能力15，kPSCs 在肾脏疾病细胞治疗以及移植将是一个有趣的未来应用。为此目的，有的细胞产品交付的几种策略。第一种策略是输液的 kPSCs，作为目前 bmMSC 临床研究中。另一个有趣的应用程序是使用 kPSCs 或 kPSC 排泄因素在移植前机器灌注。这种方式，移植肾的质量可能会提高移植后可能导致肾功能改善。对于这两种策略，kPSCs 是有趣新的细胞来源，进一步探讨用于临床治疗。
Disclosures
D.G.L.，M.A.E.，和 T.J.R.都与本研究有关的专利申请。其他作者没有透露。
Acknowledgments
这项研究已收到欧洲共同体第七框架计划 （FP7/2007年-2013 年） 的资助下赠款协议编号 305436 恒星。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baxter bags | Fenwal | R4R-7004 | |
| Human platelets | Sanquin | hospital surplus material expired for less than 2 d is used | |
| platelet lysate | custom made | ||
| Disposable sterile bottles | Corning | 09-761-11 | |
| 500 mL PP centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| a-MEM medium | Lonza | BE12-169F | |
| glutamax | thermo fisher | 35050038 | |
| pen/strep | Invitrogen | 15070063 | |
| transfusion system | Codan | 455609 | |
| DMEM-F12 | life technologies | 11320-074 | |
| Normal Human Serum (NHS) | Sanquin | ||
| Hepes 1 M | Lonza | BE-17-737E | |
| NaHCO3 7.5% | Lonza | BE17-613E | |
| CaCl2 1 M | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| UW | Bridge to life | 32911 | |
| Heparin | Leo Pharma | ||
| collagenase NB1 GMP grade | SERVA | 17455.03 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ml | |
| surgical drapes | 3M Nederland | DH999969404 | |
| perfusion pump | metrohm | x007528300 | |
| pump head | metrohm | x077202600 | |
| perfusion tray | custom made | ||
| LS25 masterflex tubes | Masterflex | HV-96410-25 | |
| accessory spike | Gambro DASCO | 6038020 | |
| pulmozyme | Roche | ||
| culture flasks 25 cm2 | greiner | 690175 | |
| culture flask 75 cm2 | greiner | 658170 | |
| culture flask 175 cm2 | greiner | 661160 | |
| Trypsin | sigma | t4174 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500g | |
| FcR blocking reagent | miltenyi | 130-059-901 | |
| anti melanoma beads (NG2) | miltenyi | 130-090-452 | |
| cell strainer 70 µm | Corning | 352350 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS magnet | miltenyi | 130-090-976 | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | |
| CD45 APC | BD | 555485 | |
| CD146 PE | BD | 550315 | |
| NG2 APC | R&D | FAB2585A | |
| CD90 PE | BD | 555596 | |
| HLA ABC APC | BD | 555555 | |
| CD105 FITC | Ancell | 326-040 | |
| HLA DR APC | BD | 559866 | |
| CD56 PE | BD | 555516 | |
| CD73 PE | BD | 550257 | |
| CD31 FITC | BD | 555445 | |
| CD133 PE | miltenyi | 130-090-853 | |
| PDGF-r | R&D | mab 1263 | |
| mouse IgG1 FITC | BD | 345815 | |
| mouse IgG1 PE | BD | 345816 | |
| mouse IgG1 APC | BD | 345818 | |
| IgG2b PE | BD | 555743 | |
| goat anti mouse PE | Dako | R0480 | |
| sodium azide | Merck | 822335 | |
| DMEM Ham’s F12 | Gibco | 31331-028 | |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Sigma | I1884 | |
| hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
| triiodothyrinine | Sigma | T5516 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | sigma | E9644 | |
| Immortalized human renal PTEC (HK2) | courtesey of M. Ryan, university college Dublin |
References
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