Summary
Her præsenterer vi en roman kliniske grade isolation og kultur metode for nyre Perivascular stromale celler (kPSCs) baseret på hele orglet perfusion med fordøjelsesenzymer og NG2-celle berigelse. Med denne metode er det muligt at erhverve tilstrækkeligt celle numre for cellulære terapi.
Abstract
Mesenchymale stromale celler (MSCs) er væv homeostatiske og immun modulerende celler, der har vist positive effekter i nyresygdomme og transplantation. Perivascular stromale celler (PSC) deler egenskaber med knoglemarv MSCs (bmMSCs). Men de også besidder, sandsynligvis på grund af lokale prægning, væv-specifikke egenskaber og spille en rolle i lokale væv homøostase. Dette væv specificitet kan resultere i væv specifikke reparation, også inden for den menneskelige nyrerne. Tidligere viste vi, at menneskelige nyre PSC'er (kPSCs) har udvidet nyre epitelial sårheling der henviser til, at bmMSCs ikke har dette potentiale. KPSCs kan desuden forbedre nyre skade in vivo. Derfor, kPSCs er en interessant informationskilde for Celleterapi, især for nyresygdomme og renal transplantation. Her viser vi de detaljerede isolation og kultur metode for kPSCs fra transplantation-grade menneskelige nyrer baseret på hele-orgel perfusion af fordøjelsesenzymer via nyrearteriestenose og berigelse for perivascular markøren NG2. På denne måde, kan være fremstillet store celle mængder, der er egnet til cellulære terapi.
Introduction
Mesenchymale stromale celler (MSCs) er modulerende immunceller, der blev oprindeligt isoleret fra knoglemarven. De er kendetegnet ved deres spindel formet morfologi, evnen til at skelne i fedt, knogle og brusk og overholdelse af plast. MSC'er express stromale markører CD73, CD90, CD105 samtidig med at være negativ for markører CD31 og CD451,2,3. MSC'er er en lovende kandidat til celleterapi på grund af deres væv homeostatiske og immunmodulerende kapacitet. bmMSCs er i øjeblikket undersøgt i kliniske forsøg for flere sygdomme, herunder nyresygdomme og nyre transplantation som gennemgik andetsteds4.
Tidligere var det vist at perivascular celler fra flere forskellige fast organer, herunder fedtvæv, moderkagen og skeletmuskulatur deler egenskaber med MSCs9. Men, disse celler også udviser væv-specifikke funktioner, som kan resultere i organotypic reparation10. Menneskelige myokardiets perivascular celler, for eksempel, stimuleret angiogene svar efter hypoxi og opdeles i cardiomyocytes, mens perivascular celler isoleret fra andre væv ikke vise disse potentialer11.
Perivascular stromale celler kan også isoleres fra mus12,13,14 og menneskelige nyre15,16. Vi grundigt karakteriseret kPSCs og sammenlignet disse til bmMSCs. Vi fandt, at kPSCs, svarende til bmMSCs, har immunosuppressive kapacitet og kan støtte vaskulær plexus dannelse. Der er dog væv specifikke forskelle mellem celletyper, som kPSCs viste en organotypic transcriptional udtryk signatur, herunder nefrogen transskriptionsfaktorer HoxD10 og HoxD11. kPSCs, i modsætning til bmMSCs, undergår ikke myofibroblast transformation efter stimulation med TGF-β og var ude af stand til at differentiere i adipocytter. Derudover accelererede kPSCs epitelial integritet i en nyre rørformede epitelial sår scratch assay, et fænomen, der ikke blev observeret med bmMSCs. Denne forbedrede sår reparation var medieret gennem hepatocyt vækstfaktor frigivelse. Desuden forbedret kPSCs nyre skade i en musemodel af akutte nyre skade15. Derfor kPSCs synes at have superior renal reparation kapacitet og er en interessant ny kilde til celleterapi i nyresygdomme.
For at kunne bruge kPSCs til celle terapi formål, bør kPSCs være isoleret i en kliniske grade måde med kliniske grade enzymer og protokoller. Desuden, for at være i stand til at behandle flere patienter med kPSCs fra 1 donor, tilstrækkelig celle numre bør opnås. Her viser vi i detaljer, proceduren kliniske grade isolation af kPSCs fra hele transplantation grade nyrer, giver tilstrækkeligt antal celler skal bruges til klinisk cellulære terapi.
Representative Results
Kliniske grade kPSCs isolation metode er sammenfattet i figur 1. Rå nyreceller er isoleret fra menneskelig transplantation grade nyrerne af collagenase perfusion. Den resulterende cellesuspension er kulturperler indtil sammenflydende i 5% trombocyttal lysates. Derefter er perivascular stromale celle brøkdel isoleret baseret på NG2 udtryk.
kPSCs er plast vedhængende spindel-formet celler (fig. 2A) og er positive for de stromale markører perivascular, CD105, CD73 og CD90 markører NG2, PDGFR-B og CD146, mens negative for CD31, CD34, CD45 og HLA-DR (figur 2B). Typisk, en homogen population af kPSCs kan nås på passage 4 og kPSCs nå gulne omkring passage 9-10 (figur 2C). Vi anbefaler derfor for at udføre eksperimenter mellem passage 5-8.
For at evaluere den funktionelle kapacitet af de isolerede kPSCs, udfører vi en in vitro- nyre epitelial sår scratch assay på hver ny batch af kPSCs, som vi tidligere viste at konditioneret medium af kPSCs kan fremskynde epitelial sårheling i denne scratch assay15. KPSC konditioneret medium er lavet af dyrkning kPSCs for 48 h i alphaMEM 5% trombocyttal lysates og indsamle supernatanten. Næste, udødeliggjort menneskelige nyre proksimale tubulus epitelceller (HK-2)17 er kulturperler indtil sammenflydende og derefter et skrab sår er lavet. Derefter enten kPSCs eller kontrol medium konditioneret medium føjes til brøndene og hastigheden af sårheling måles. Såret lukkes når konditioneret medium af kPSCs er tilføjet, betydeligt hurtigere (figur 2D).
Figur 1 : Kliniske Grade Isolation metode af menneskelige kPSCs. Transplantation grade nyrerne er kanylerede og perfunderet med collagenase via nyrearteriestenose (A - G) og den resulterende cellesuspension er vasket og enten befrugtede eller sætte i kultur (H - K). Efter cellerne nå confluency (L), udført NG2 celle berigelse er (M). Celler er trypsinized når de enten er sammenflydende, har stoppet prolifererende eller Hvornår 3D strukturer vises (N - P). Release kriterierne for kPSCs er sterilitet, markør udtryk og evnen til at øge rørformede epitelial sårheling (Q). Pil: nyrearteriestenose. Skalalinjen = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: karakterisering af menneskelige kPSCs. En) kPSCs er spindel-formet, plast vedhængende celler. B) kPSCs er positive for mesenchymale markører CD73, CD90, CD105, perivascular markører NG2, PDGFR-β og CD146, mens negative for CD31, CD34 og CD45. kPSCs express MHC-klasse jeg (HLA-ABC) men ikke klasse II (HLA-DR). C) vækst egenskaber af tre forskellige kPSC donorer fra flowcytometri bekræftet homogene NG2 positive populationer (på passage 4). kPSCs nå gulne omkring passage 9-10. D) kPSCs er købedygtig forøge nyre epitelial reparation i et sår scratch assay. Repræsentative billeder af kontrol medium og kPSC aircondition medium til t = 0, 4, 8 og 12 h er vist. Skalalinjen i A) = 200 µm i D) = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Perivascular celler er blevet isoleret fra mange forskellige menneskelige fast organer, herunder bugspytkirtlen, fedt, brusk og nyre9,15,16. De fleste metoder, men er baseret på små prøver af væv, som er dissekeret og bagefter behandlet med fordøjelsesenzymer. Det er desuden normalt ikke udføres med kliniske grade produkter. Dette gør disse strategier mindre egnet til direkte kliniske oversættelse hvor store mængder af klinisk-grade celler er nødvendige.
Her viser vi en roman isolation metode af menneskelige kPSCs for hele organer baseret på perfusion med kliniske grade enzymer og materialer. Protokollen er tilpasset fra den kliniske Holme af Langerhanske isolation protokol i øjeblikket i brug for klinisk anvendelse i vores center18.
Dette er den første kliniske grade metode, hvor store mængder af kPSCs kan opnås. Variation i celle udbytte er stort set donor afhængige. Når cellen udbytte vi i øjeblikket få fra en brøkdel af rå cellesuspension af tre forskellige donorer er ekstrapoleres, i teorien, opnås imidlertid en gennemsnitlige afkast på 2,7 x 1012 kPSCs per donor. Som MSC terapi består typisk af 2 celle infusioner med 1-2 x 106 celler/kg krop vægt4, er disse celle numre tilstrækkelig for allogen behandling af flere patienter.
Et kritisk trin i proceduren isolation er varigheden af collagenase fordøjelsen. Når perioden fordøjelsen er for kort, forbliver store klumper af væv, som vil være sværere at kultur. Når perfusion er alt for lang, kan øget celledød observeres. Derfor, så snart nyren begynder at blive bløde og mindre gennemsigtig væske, nyrerne bør være masseres forsigtigt og collagenase behandlingen bør stoppes.
En anden kritisk trin er kulturen i cellerne efter NG2 celle berigelse. Nogle gange efter den NG2 celle berigelse begynder perivascular celler ikke at formere eller begynder at vokse i 3D strukturer. I dette tilfælde, når cellerne er trypsinized og tilsås, vil cellerne normalt begynder at vokse i éncellelag kultur.
Som udgangspunkt materiale, blev menneskelig transplantation grade nyrerne kasseret hovedsageligt for kirurgisk grunde brugt. Disse er funktionelle organer uden større fibrose. Vi anerkender, at dette kunne være en begrænsning, da dette er en forholdsvis sjælden og svært at få orgel kilde. Eksplanterede nyrerne kan være en anden kilde; men afhængigt af grunden af nyre explantation, disse nyrer kan indeholde flere fibrose og dermed myofibroblasts, og derfor omhu bør tages, da myofibroblasts kan være isoleret og kulturperler i stedet for perivascular celler.
Som kPSCs isoleret med denne protokol Vis organo-mest egenskaber med nyre epitelial sår healing kapacitet15, celleterapi med kPSCs i nyresygdomme og transplantation vil være en interessant fremtidig anvendelse. Til dette formål er der flere strategier i cellen/cellerne produkt levering. Den første strategi er IV infusion af kPSCs, som anvendes i øjeblikket i de kliniske undersøgelser, bmMSC. En anden interessant program er brugen af kPSCs eller kPSC-udskilles faktorer i maskinen perfusion før transplantation. På denne måde, kan kvaliteten af det eksplanterede nyre forbedre, som kunne føre til forbedret nyrefunktion efter transplantation. For begge strategier er kPSCs en interessant ny celle kilde til yderligere at udforske til kliniske formål.
Disclosures
D.G.L., M.A.E., og T.J.R. er forbundet med en patent ansøgning vedrørende denne forskning. Andre forfattere har intet at videregive.
Acknowledgments
Denne forskning har modtaget støtte fra Det Europæiske Fællesskabs syvende ramme-Program (FP7/2007-2013) under grant aftalenummer 305436 STELLAR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baxter bags | Fenwal | R4R-7004 | |
| Human platelets | Sanquin | hospital surplus material expired for less than 2 d is used | |
| platelet lysate | custom made | ||
| Disposable sterile bottles | Corning | 09-761-11 | |
| 500 mL PP centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| a-MEM medium | Lonza | BE12-169F | |
| glutamax | thermo fisher | 35050038 | |
| pen/strep | Invitrogen | 15070063 | |
| transfusion system | Codan | 455609 | |
| DMEM-F12 | life technologies | 11320-074 | |
| Normal Human Serum (NHS) | Sanquin | ||
| Hepes 1 M | Lonza | BE-17-737E | |
| NaHCO3 7.5% | Lonza | BE17-613E | |
| CaCl2 1 M | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| UW | Bridge to life | 32911 | |
| Heparin | Leo Pharma | ||
| collagenase NB1 GMP grade | SERVA | 17455.03 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ml | |
| surgical drapes | 3M Nederland | DH999969404 | |
| perfusion pump | metrohm | x007528300 | |
| pump head | metrohm | x077202600 | |
| perfusion tray | custom made | ||
| LS25 masterflex tubes | Masterflex | HV-96410-25 | |
| accessory spike | Gambro DASCO | 6038020 | |
| pulmozyme | Roche | ||
| culture flasks 25 cm2 | greiner | 690175 | |
| culture flask 75 cm2 | greiner | 658170 | |
| culture flask 175 cm2 | greiner | 661160 | |
| Trypsin | sigma | t4174 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500g | |
| FcR blocking reagent | miltenyi | 130-059-901 | |
| anti melanoma beads (NG2) | miltenyi | 130-090-452 | |
| cell strainer 70 µm | Corning | 352350 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS magnet | miltenyi | 130-090-976 | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | |
| CD45 APC | BD | 555485 | |
| CD146 PE | BD | 550315 | |
| NG2 APC | R&D | FAB2585A | |
| CD90 PE | BD | 555596 | |
| HLA ABC APC | BD | 555555 | |
| CD105 FITC | Ancell | 326-040 | |
| HLA DR APC | BD | 559866 | |
| CD56 PE | BD | 555516 | |
| CD73 PE | BD | 550257 | |
| CD31 FITC | BD | 555445 | |
| CD133 PE | miltenyi | 130-090-853 | |
| PDGF-r | R&D | mab 1263 | |
| mouse IgG1 FITC | BD | 345815 | |
| mouse IgG1 PE | BD | 345816 | |
| mouse IgG1 APC | BD | 345818 | |
| IgG2b PE | BD | 555743 | |
| goat anti mouse PE | Dako | R0480 | |
| sodium azide | Merck | 822335 | |
| DMEM Ham’s F12 | Gibco | 31331-028 | |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Sigma | I1884 | |
| hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
| triiodothyrinine | Sigma | T5516 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | sigma | E9644 | |
| Immortalized human renal PTEC (HK2) | courtesey of M. Ryan, university college Dublin |
References
- Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp Hematol. 2 (2), 83-92 (1974).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Leuning, D. G., Reinders, M. E., de Fijter, J. W., Rabelink, T. J. Clinical translation of multipotent mesenchymal stromal cells in transplantation. Semin Nephrol. 34 (4), 351-364 (2014).
- Reinders, M. E., et al. Autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cells for the treatment of allograft rejection after renal transplantation: results of a phase I study. Stem Cells Transl Med. 2 (2), 107-111 (2013).
- Perico, N., et al. Autologous mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: a pilot study of safety and clinical feasibility. Clin J Am Soc Nephrol. 6 (2), 412-422 (2011).
- Perico, N., et al. Mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: pretransplant infusion protects from graft dysfunction while fostering immunoregulation. Transpl Int. 26 (9), 867-878 (2013).
- Tan, J., et al. Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial. JAMA. 307 (11), 1169-1177 (2012).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Sacchetti, B., et al. No Identical "Mesenchymal Stem Cells" at Different Times and Sites: Human Committed Progenitors of Distinct Origin and Differentiation Potential Are Incorporated as Adventitial Cells in Microvessels. Stem Cell Reports. 6 (6), 897-913 (2016).
- Chen, W. C., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).
- Dekel, B., et al. Isolation and characterization of nontubular sca-1+lin- multipotent stem/progenitor cells from adult mouse kidney. J Am Soc Nephrol. 17 (12), 3300-3314 (2006).
- Li, J., et al. Collecting duct-derived cells display mesenchymal stem cell properties and retain selective in vitro and in vivo epithelial capacity. J Am Soc Nephrol. 26 (1), 81-94 (2015).
- Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Res. 8 (1), 58-73 (2012).
- Leuning, D. G., et al. Clinical-Grade Isolated Human Kidney Perivascular Stromal Cells as an Organotypic Cell Source for Kidney Regenerative Medicine. Stem Cells Transl Med. , (2016).
- Bruno, S., et al. Isolation and characterization of resident mesenchymal stem cells in human glomeruli. Stem Cells Dev. 18 (6), 867-880 (2009).
- Ryan, M. J., et al. HK-2: an immortalized proximal tubule epithelial cell line from normal adult human kidney. Kidney Int. 45 (1), 48-57 (1994).
- Nijhoff, M. F., et al. Glycemic Stability Through Islet-After-Kidney Transplantation Using an Alemtuzumab-Based Induction Regimen and Long-Term Triple-Maintenance Immunosuppression. Am J Transplant. , (2015).
