Summary
Aquí presentamos un método de aislamiento y de la cultura de grado clínico novela para riñón células estromales perivasculares (kPSCs) basado en perfusión de órgano entero con enzimas digestivas y células NG2 enriquecimiento. Con este método, es posible adquirir un número suficiente de células para terapia celular.
Abstract
Las células estromales mesenquimales (MSCs) son homeostáticos e inmune modulador las células del tejido que han mostrado efectos beneficiosos en enfermedades de riñón y trasplante. Células del estroma perivascular (PSCs) comparten características con médula MSCs (bmMSCs). Sin embargo, también poseen, probablemente debido a la impresión local, propiedades específicas de tejidos y juegan un papel en la homeostasis del tejido local. Esta especificidad de tejido puede resultar en la reparación de tejidos específicos, también en el riñón humano. Previamente demostramos que PSC de riñón humano (kPSCs) ha mejorado la riñón epitelial de cicatrización mientras que bmMSCs no tenía este potencial. Además, kPSCs puede mejorar lesiones de riñón en vivo. Por lo tanto, kPSCs constituyen una interesante fuente para terapia celular, particularmente para enfermedades renales y trasplante renal. A continuación os mostramos el método de aislamiento y cultura detallado para kPSCs de trasplante grado de riñones humanos basados en perfusión de órgano conjunto de enzimas digestivas a través de la arteria renal y el enriquecimiento para el marcador perivascular NG2. De esta manera, se pueden obtener cantidades grandes de la célula que son adecuados para la terapia celular.
Introduction
Las células estromales mesenquimales (MSCs) son células inmunes moduladores que fueron originalmente aisladas de la médula ósea. Se caracterizan por su eje en forma de morfología, capacidad de diferenciarse en grasa, hueso y cartílago y adhesión de plástico. MSCs expresan los marcadores estromales CD73, CD90, CD105 siendo negativa para los marcadores CD31 y CD451,2,3. MSCs están un candidato prometedor para la terapia celular debido a su tejido homeostático y capacidad inmunomoduladora. bmMSCs actualmente se están estudiando en ensayos clínicos para varias enfermedades, incluyendo enfermedades de riñón y trasplante de riñón como revisado en otra parte4.
Previamente fue demostrado que perivascular de las células de diferentes órganos sólidos, incluyendo el tejido adiposo, placenta y músculo esquelético comparten características con MSCs9. Sin embargo, estas células también presentan funciones específicas de tejidos que pueden resultar en organotypic reparación10. Las células perivasculares miocardio humano, por ejemplo, estimulan respuestas angiogénicos después de hipoxia y diferenciado en cardiomiocitos, mientras que las células perivasculares aisladas de otros tejidos no mostró estos potenciales11.
Las células del estroma perivascular también pueden ser aisladas del ratón12,13,14 y15,de riñón humano16. Ampliamente había caracterizado kPSCs y comparó a bmMSCs. Se encontró que kPSCs similares a bmMSCs, tienen capacidades inmunosupresoras y puede apoyar la formación del plexo vascular. Sin embargo, hay tejido las diferencias específicas entre los tipos de células, como demostrada una firma de expresión transcripcional organotypic, incluyendo los factores de transcripción nefrógeno HoxD10 y HoxD11 kPSCs. kPSCs, en contraste con bmMSCs, no se someten a transformación de miofibroblastos después del estímulo con TGF-β y eran incapaces de diferenciarse a adipocitos. Además, kPSCs había acelerado integridad epitelial en un ensayo cero riñón herida epitelial tubular, un fenómeno que no se observó con bmMSCs. Esta herida mayor reparación fue mediada a través de la liberación de factor de crecimiento hepatocito. Por otra parte, kPSCs mejoró la lesión renal en un modelo murino de lesión renal aguda15. Por lo tanto, kPSCs parecen tener capacidades de reparación renal superior y son una interesante fuente nueva para terapia celular en enfermedades renales.
Para poder utilizar kPSCs para fines de terapia celular, kPSCs deben aislarse de manera grado clínico con enzimas de grado clínico y protocolos. Por otra parte, para ser capaces de tratar a varios pacientes con kPSCs de 1 donante, debe obtenerse un número suficiente de células. A continuación os mostramos en detalle, el procedimiento de aislamiento de grado clínico de kPSCs de los riñones de trasplante de todo grado, produciendo un número suficiente de células para ser utilizado por clínica terapia celular.
Representative Results
El método de aislamiento de kPSCs de grado clínico se resume en la figura 1. Las células del riñón crudo están aisladas de trasplante humano riñones de grado por perfusión de colagenasa. La suspensión resultante se cultiva hasta confluentes en los lysates de plaquetas de 5%. Entonces la fracción de células estromales perivasculares aislada basados en la expresión de NG2.
kPSCs plástico adherente en forma de huso de las células (figura 2A) y son positivos para los marcadores estromales marcadores CD73, CD90, CD105 y perivascular NG2, PDGFR-B y CD146, mientras que la negativa para CD31 y CD34, CD45, HLA-DR (figura 2B). Por lo general, una población homogénea de kPSCs puede ser alcanzada en el paso 4 y kPSCs llegar a la Senectud en el paso 9 y 10 (figura 2C). Por lo tanto aconsejamos realizar experimentos entre el pasaje 5-8.
Para evaluar la capacidad funcional de la kPSCs aisladas, realizamos un en vitro riñón epitelial de la herida rasguño ensayo en cada lote nuevo de kPSCs, como hemos demostrado anteriormente que el medio condicionado de kPSCs puede acelerar la cicatrización epitelial en este ensayo scratch15. El medio condicionado kPSC realiza cultivo kPSCs durante 48 h en alphaMEM 5% plaquetas lisados y recoger el sobrenadante. A continuación, el riñón humano inmortalizado proximal túbulo células epiteliales (HK-2)17 se cultivan hasta confluentes y entonces se hace una herida arañazo. Ya sea el medio condicionado de medio kPSCs o control se agrega a los pozos y se mide la velocidad de cicatrización de la herida. Cuando se agrega el medio condicionado de kPSCs, la herida cierra mucho más rápido (figura 2D).
Figura 1 : KPSCs grado clínico de la método de aislamiento humano. Trasplante de riñones de grado son canulados y perfundidos con colagenasa vía la arteria renal (A - G) y la suspensión resultante se lava y ya sea congelados o poner en cultura (H - K). Después las células llegar a confluencia (L), NG2 enriquecimiento celular es realizar (M). Las células se tripsinizaron cuando cualquiera son confluente, han dejado de proliferar o cuando las estructuras 3D aparecen (N - P). Los criterios de liberación de kPSCs son la esterilidad, de expresión de marcador y la capacidad para mejorar la cicatrización de la herida epitelial tubular (Q). Flecha: arteria renal. Barra de escala = 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: kPSCs caracterización de humanos. Un) kPSCs son células fusiformes, plástico adherentes. B) kPSCs son positivas para marcadores mesenquimales CD73, CD90, CD105, marcadores perivascular NG2, PDGFR-β y CD146, mientras que la negativa para CD31, CD34 y CD45. kPSCs expresar MHC clase I (HLA-ABC), pero no clase II (HLA-DR). C) características de crecimiento de tres donantes diferentes kPSC de citometría de flujo confirmaron homogénea NG2 positivo las poblaciones (paso 4). kPSCs llega a la senescencia en el paso 9 y 10. KPSCs D) son capaces de mejorar la reparación epitelial de riñón en un ensayo de rayado de herida. Imágenes representativas del medio de control y kPSC acondicionado medio en t = 0, 4, 8 y 12 h. Barra de escala en la A) = 200 μm, D) = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Células perivasculares se han aislado de muchas diferentes sólidos los órganos humanos, como páncreas, grasa, cartílago y el riñón9,15,16. Mayoría de los métodos, sin embargo, se basa en pequeñas muestras de tejido, que son disecados y luego tratados con enzimas digestivas. Por otra parte, esto generalmente no se realiza con productos de grado clínico. Esto hace que estas estrategias menos conveniente para la traducción clínica directa donde son necesarias grandes cantidades de células de tipo clínico.
A continuación os mostramos un método de aislamiento novela de kPSCs humano de órganos enteros basados en perfusión con enzimas de grado clínico y materiales. El protocolo se adapta el protocolo de aislamiento clínico islotes de Langerhans actualmente en uso para su aplicación clínica en nuestro centro18.
Este es el primer grado clínico donde grandes cantidades de kPSCs pueden ser alcanzadas. La variabilidad en el rendimiento de la célula es en gran parte dependientes de donantes. Sin embargo, cuando el rendimiento celular que actualmente obtenemos de una fracción de la suspensión celular crudo de tres diferentes donantes se extrapola, en teoría, podría lograrse un rendimiento promedio de 2.7 x 1012 kPSCs por donante. Como terapia MSC consiste en típicamente 2 infusiones de células con 1-2 x 106 células/kg peso corporal4, estos números de celular son suficientes para alógeno tratamiento de varios pacientes.
Un paso crítico en el procedimiento de aislamiento es la duración de la digestión de la colagenasa. Cuando el período de digestión es demasiado corto, se mantendrá grumos grandes de tejido, que será más difícil a la cultura. Cuando el período de perfusión es demasiado largo, se puede observar la muerte creciente de la célula. Por lo tanto, tan pronto como el riñón empieza a ser suave y los fluidos menos transparentes, el riñón se debe masajear suavemente y debe suspenderse el tratamiento de la colagenasa.
Otro paso fundamental es el cultivo de las células después de enriquecimiento de células NG2. A veces tras el enriquecimiento de células NG2, las células perivasculares no empiece a proliferar o comienzan a crecer en las estructuras 3D. En este caso, cuando las células se tripsinizaron y resembraron, las células generalmente comenzará a crecer en cultivo monocapa.
Como material de partida, se utilizaron riñones de grado humano trasplante descartados por razones quirúrgicas. Estos son órganos funcionales sin fibrosis importante. Reconocemos que esto puede ser una limitación ya que este es un relativamente raro y difícil de obtener fuente de órganos. Los riñones explanted podrían ser otra fuente; sin embargo, dependiendo de la razón de la explantación de riñón, estos riñones pueden contener más fibrosis y miofibroblastos, y por lo tanto debe tenerse cuidado puesto que myofibroblasts podría aislado y cultivado en vez de células perivasculares.
El kPSCs aislado con este espectáculo de protocolo propiedades organo-typic con riñón epitelial habían herida curación capacidades15, terapia celular con kPSCs en enfermedades del riñón y trasplante sería una aplicación interesante en el futuro. Para ello, existen varias estrategias de entrega del producto celular de la célula. La primera estrategia es la infusión IV de kPSCs, como se utiliza actualmente en los estudios clínicos de bmMSC. Otra aplicación interesante es el uso de kPSCs o factores kPSC excreta en perfusión máquina antes del trasplante. De esta manera, podría mejorar la calidad del riñón explanted que podría conducir a función renal mejorada después del trasplante. Ambas estrategias de kPSCs son una fuente interesante de celular nuevo para explorar más a fondo para los propósitos clínicos.
Disclosures
D.G.L., M.A.E., y T.J.R. se asocian con una solicitud de patente con respecto a esta investigación. Otros autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación ha recibido financiación de séptimo programa de la Comunidad Europea marco (FP7/2007-2013) bajo la concesión número de acuerdo 305436 estelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baxter bags | Fenwal | R4R-7004 | |
| Human platelets | Sanquin | hospital surplus material expired for less than 2 d is used | |
| platelet lysate | custom made | ||
| Disposable sterile bottles | Corning | 09-761-11 | |
| 500 mL PP centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| a-MEM medium | Lonza | BE12-169F | |
| glutamax | thermo fisher | 35050038 | |
| pen/strep | Invitrogen | 15070063 | |
| transfusion system | Codan | 455609 | |
| DMEM-F12 | life technologies | 11320-074 | |
| Normal Human Serum (NHS) | Sanquin | ||
| Hepes 1 M | Lonza | BE-17-737E | |
| NaHCO3 7.5% | Lonza | BE17-613E | |
| CaCl2 1 M | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| UW | Bridge to life | 32911 | |
| Heparin | Leo Pharma | ||
| collagenase NB1 GMP grade | SERVA | 17455.03 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ml | |
| surgical drapes | 3M Nederland | DH999969404 | |
| perfusion pump | metrohm | x007528300 | |
| pump head | metrohm | x077202600 | |
| perfusion tray | custom made | ||
| LS25 masterflex tubes | Masterflex | HV-96410-25 | |
| accessory spike | Gambro DASCO | 6038020 | |
| pulmozyme | Roche | ||
| culture flasks 25 cm2 | greiner | 690175 | |
| culture flask 75 cm2 | greiner | 658170 | |
| culture flask 175 cm2 | greiner | 661160 | |
| Trypsin | sigma | t4174 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500g | |
| FcR blocking reagent | miltenyi | 130-059-901 | |
| anti melanoma beads (NG2) | miltenyi | 130-090-452 | |
| cell strainer 70 µm | Corning | 352350 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS magnet | miltenyi | 130-090-976 | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | |
| CD45 APC | BD | 555485 | |
| CD146 PE | BD | 550315 | |
| NG2 APC | R&D | FAB2585A | |
| CD90 PE | BD | 555596 | |
| HLA ABC APC | BD | 555555 | |
| CD105 FITC | Ancell | 326-040 | |
| HLA DR APC | BD | 559866 | |
| CD56 PE | BD | 555516 | |
| CD73 PE | BD | 550257 | |
| CD31 FITC | BD | 555445 | |
| CD133 PE | miltenyi | 130-090-853 | |
| PDGF-r | R&D | mab 1263 | |
| mouse IgG1 FITC | BD | 345815 | |
| mouse IgG1 PE | BD | 345816 | |
| mouse IgG1 APC | BD | 345818 | |
| IgG2b PE | BD | 555743 | |
| goat anti mouse PE | Dako | R0480 | |
| sodium azide | Merck | 822335 | |
| DMEM Ham’s F12 | Gibco | 31331-028 | |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Sigma | I1884 | |
| hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
| triiodothyrinine | Sigma | T5516 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | sigma | E9644 | |
| Immortalized human renal PTEC (HK2) | courtesey of M. Ryan, university college Dublin |
References
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